专利名称：检测他克莫司和环孢素a个体化用药相关snp位点的试剂盒及扩增方法和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测SNP位点的试剂盒及其PCR扩增方法，尤其是利用多重PCR 结合分子开关技术检测他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的试剂盒及其多重 PCR扩增方法和检测方法。
背景技术：
他克莫司又名FK506是一种从链霉菌属(str印tomyces tsukubaensis)中分离出的发酵产物，其化学结构属23元大环内酯类抗生素。为一种强力的新型免疫抑制剂。对T 细胞有选择性抑制作用，主要通过与细胞内免疫嗜素1 结合蛋白(FKBP)结合而抑制Th细胞释放IL-2、IL-3、IFN-Y并抑制IL-2R表达。近年来，作为肝、肾移植的一线用药，已在日本、美国等14个国家上市。临床实验表明，其在心、肺、肠、骨髓等移植中应用有很好的疗效。同时他克莫司在治疗特应性皮炎(AD)、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中也发挥着积极的作用。环孢素A(CyCl0Sprine，CyA)是由11个氨基酸组成的环状多肽，是土壤中一种真菌的活性代谢物.1978年英国首次将CyA应用于临床肾移植，此后CyA又用于肝、心、肺、胰腺、骨髓等器官的移植，均取得令人满意的效果，明显提高病人的生存率.1984年环孢素A进入我国，形成了"环孢素A+硫唑嘌呤+激素"的三联免疫抑制方案，大大提高了移植存活率，同时也使移植术后急性排斥反应的发生率大幅下降.CyA 作为一种强效免疫抑制剂，近年来人们对它的研究越来越多，发现它还可用来治疗自身免疫性疾病、血液病及抗寄生虫病等。他克莫司和环孢素A有效治疗范围很窄，剂量不足或者血药浓度过低可能会导致移植物的排斥反应，而剂量过高会诱导一系列不良反应，包括肾毒性、神经毒性、移植性糖尿病、对传染易感性增加、癌变、高血压以及胃肠功能紊乱。他克莫司和环孢素A的生物利用度在个体间差异性很大，大量的临床研究表明，除了受患者年龄、种族、体重、饮食等临床因素影响外个体间基因水平上的差异是导致药物代谢差异的主要原因，CYP3A4、CYP3A5和MDRl基因上SNP多态性是影响他克莫司和环孢素A药物代谢的关键因素。环孢素和他克莫司主要在肝脏和胃肠道经由CYP3A4和CYP3A5同工酶的羟基化和去甲基化作用而代谢。这些药物的代谢几乎是完全的，仅有小于的原型药物会出现在尿液或粪便中。环孢素和他克莫司的代谢产物由胆汁中排出，不到5%的产物经尿液排出。CYP3A4*1G rs2MM80是目前所有CYP3A4单核苷酸多态性中突变频率最高的一个位点研究发现，CYP3A4*1G基因突变可能会提高CYP3A4酶活性，影响患者的血药浓度/剂量比 (C/D)，当患者携带此突变时，则C/D值降低，患者异出现急性排斥反应(AR)，而药物不良反应(ADR)发生几率较低，应增加用药量；当患者为野生纯合子时，则应减少用药量。中国人 CYP3A5*3 rs776746突变频率较高，突变会导致转录的核糖核酸插入部分内含子3，在109 位点提前出现终止密码子，翻译出无功能蛋白片段。当患者为CYP3A5*3突变纯合子时，患者C/D值较高，应减少药物用量。P-gp编码基因MDRl具有多个多态性位点，肠道P-gp的表达具有个体差异。P-gp是一种三磷酸腺苷依赖的细胞转运蛋白，能将细胞内或脂质双层内的药物和毒物泵出细胞外，减少药物的吸收和增加药物的排泄。他克莫司和环孢素A既是P-gp的底物，又是抑制剂，MDRl基因多态性可通过改变P-gp的活性而影响药代动力学参数。MDRl C3435Trsl045642是MDRl基因上突变频率较高SNP位点，MDRl 3435 TT基因型个体其肠道P-gp表达水平明显低于3435CT/CC个体，研究证明TT型患者较TC/CC型患者需要较少的药物剂量。
发明内容
环孢素A和他克莫司的代谢酶CYP3A4、CYP3A5和转运酶MDRl的基因遗传多态性直接或间接影响两种药物在体内的转运和代谢过程。本发明提供一种利用多重PCR结合分子开关技术检测环孢素A和他克莫司个体化用药相关SNP位点的试剂盒及其多重PCR扩增方法和检测方法。本发明采用的技术方案一种检测环孢素A和他克莫司个体化用药相关基因单核苷酸多态性位点的试剂盒，所述试剂盒可同时对CYP3A4基因rs2242480 SNP位点、CYP3A5 基因rs776746 SNP位点及MDRl基因rsl045642SNP位点进行扩增分型检测，以β -Actin 基因为内参来检测扩增条件；野生型2Χ缓冲包含上述3个SNP位点的野生型正向序列特异性引物、共用反向引物和内参序列上下游引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的野生型表型；突变型2 X缓冲液包含上述3个SNP位点的突变型正向序列特异性引物、共用反向引物和内参序列上下游引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带对应SNP位点的突变型表型；当其中一个SNP位点所对应的片段长度条带仅在野生型扩增中得出阳性结果，突变型扩增对应位置条带为阴性时判读为野生纯合型， 相反为突变纯合型，野生型和突变型扩增都出现阳性条带其结果为杂合型，通过野生型和突变型的特异性扩增经过DNA凝胶电泳综合分析确认受试者的基因型。所属检测CYP3A4基因rs2242480 SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示正向野生型引物TTTACCCAATAAGGTGAGTGGATGG正向突变型引物TTTACCCAATAAGGTGAGTGGATGA反向共用引物CCTACATAGAGTCAGTGAAAGAATCAGTGA所属检测CYP3A5基因rs776746 SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示正向野生型弓丨物ATGTGGTCCAAACAGGGAAGAGATAT正向突变型弓丨物ATGTGGTCCAAACAGGGAAGAGATAC反向共用弓丨物AGGCAACATGACTTAGTAGACAGATGACA所属检测MDRl基因rsl045642 SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示正向野生型引物CGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATT正向突变型引物CGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATC反向共用引物GGGAGAGACAGTCATGCCTACTTCCT本发明试剂盒的组分和含量包括
野生型2X扩增缓冲混合液，突变型2X扩增缓冲混合液，高保真聚合酶。本试剂盒共40人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。本发明与现有技术相比具有下列优点和效果(1)本发明采用多重PCR扩增技术，在一次PCR反应中对3个包含SNP位点的DNA 片段和1个内参片段同时进行扩增，提高检测效率降低检测成本。(2)本发明采用SNP敏感性分子开关技术，使3’端不能与模板互补的引物所引发的扩增非成熟性终止，无法形成产物，避免假阳性结果的产生。(3)引入内参，为阴性结果的判读提供依据，避免假阴性结果的产生。(4)本发明扩增后只需通过DNA凝胶电泳及凝胶成像系统即可完成检测，不需添置贵重设备，快速，准确，灵敏，特异，重复性好，大幅降低了检测成本和操作复杂程度，适合临床和科研使用。(5)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。(6)本发明的试剂盒，分别提供野生型和突变型的2X扩增缓冲液，使用者只要全血裂解悬液和聚合酶即可进行扩增，减少了操作步骤，提高劳动速率，可以实现高效率检测。(7)本发明的试剂盒所提供的野生型和突变型2X扩增缓冲液，使用了不同颜色的扩增指示染料，方便加样时区分，避免人为错误。扩增后即可直接进行凝胶电泳，无需加入loading buffer，操作方便快捷。
具体实施例方式CYP3A4 rs2242480 SNP位点的引物、检测基因CYP3A5 rs776746 SNP位点的引物及检测基因MDRl rsl045642 SNP位点的引物。下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。本发明检测他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的试剂盒，所述试剂盒包括检测基因CYP3A4 rs2242480 SNP位点的引物、检测基因CYP3A5rs776746 SNP位点的引物及检测基因MDRl rsl045642 SNP位点的引物。所述试剂盒包括检测基因CYP3A4 rs2242480 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物、检测基因CYP3A5 rs776746 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物、和检测基因 MDRl rsl045642 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物。所述检测基因CYP3A4 rs2242480位点的引物碱基序列如下所示(SEQ IDN0. 1-9)正向野生型引物TTTACCCAATAAGGTGAGTGGATGG正向突变型引物TTTACCCAATAAGGTGAGTGGATGA反向共用引物CCTACATAGAGTCAGTGAAAGAATCAGTGA所述检测基因CYP3A5 rs776746位点的引物碱基序列如下所示正向野生型弓丨物ATGTGGTCCAAACAGGGAAGAGATAT正向突变型弓丨物ATGTGGTCCAAACAGGGAAGAGATAC反向共用弓丨物AGGCAACATGACTTAGTAGACAGATGACA
所述检测基因MDRl rsl045642位点的引物碱基序列如下所示正向野生型引物CGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATT正向突变型引物CGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATC反向共用引物GGGAGAGACAGTCATGCCTACTTCCT所述的检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒所采用的检测方法对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对3个目的片段和1个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是内对照73!3bp，MDRl rsl045642 518bp，CYP3A5 rs776746 303bp，CYP3A4 rs2242480 139bp ；扩增后经凝胶电泳即可在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断3个SNP位点的基因型。所述的检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒多重PCR扩增方法预变性由1次循环构成，其条件为温度为94°C，时间为5分钟；PCR扩增由30次循环构成，其条件为变性温度为94 °C，时间为30秒；退火温度为58 °C，时间为30秒；延伸温度为72°C，时间为90秒；扩增结束后于4°C保存至电泳检测。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例一步骤1 全血细胞裂解液的制备取受检者外周静脉血300 μ 1，加入700 μ 1细胞裂解液，颠倒混勻5次，12000rpm 离心1分钟，倒去上清，并将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保沉淀在管中，加入300 μ 1双蒸水，涡旋震荡混勻成细胞裂解悬液。步骤2:PCR扩增反应1、配置野生型反应体系PCR管内加入细胞裂解悬液4.8μ 1、加入5μ 1 2X野生型扩增缓冲液和0. 2μ 1聚合酶(2. 5υ/μ 1)混合构成独立的反应体系，加样后充分混勻，短暂离心，具体见下表
权利要求
1.一种检测他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测基因CYP3A4 rs2242480 SNP位点的引物、检测基因CYP3A5 rs776746 SNP 位点的引物及检测基因MDRl rsl045642 SNP位点的引物。
2.根据权利要求1所述的检测他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测基因CYP3A4 rs2242480 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物、检测基因CYP3A5 rs776746 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物和检测基因MDRl rsl045642 SNP位点的两个正向引物及一个反向引物。
3.根据权利要求2所述的检测他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述检测基因CYP3A4 rs2MM80位点的引物碱基序列如下所示正向里予生型引物:tttacccaat aaggtgagtg gatgg正向突变型引物:tttacccaat aaggtgagtg gatga反向共用引物:cctacataga gtcagtgaaa gaatcagtga所述检测基因cyp3a5 rs776746位点的引物碱基序列如下所示正向里予生型引物atgtggtcca aacagggaag agatat正向突变型引物atgtggtcca aacagggaag agatac反向共用引物aggcaacatg acttagtaga cagatgaca所述检测基因mdrl rsl045642位点的引物碱基序列如下所示正向里予生型引物:cgggtggtgt cacaggaaga gatt正向突变型引物:cgggtggtgt cacaggaaga gate反向共用引物:gggagagaca gtcatgccta cttcct
4.一种权利要求1所述的检测他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的试剂盒所采用的检测方法，其特征在于，对受检样本DNA分别用野生型和突变扩增缓冲液进行扩增，在每个反扩增反应中同时对3个目的片段和1个内参片段进行扩增，扩增片段由大到小依次是内对照 73!3bp，MDRlrsl045642 518bp,CYP3A5 rs776746 303bp,CYP3A4 rs2242480 139bp;扩增后经凝胶电泳即可在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断3个SNP位点的基因型。
5.一种采用权利要求1所述的检测华法林个体化用药相关SNP位点的试剂盒多重PCR 扩增方法，其特征在于，预变性由1次循环构成，其条件为温度为94°C，时间为5分钟；PCR扩增由30次循环构成，其条件为变性温度为94°C，时间为30秒；退火温度为58°C，时间为30秒；延伸温度为72°C，时间为90秒；扩增结束后于4°C保存至电泳检测。
全文摘要
本发明公开了一种利用多重PCR技术结合SNP敏感性分子开关技术检测他克莫司和环孢素A个体化用药相关SNP位点的检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒对他克莫司和环孢素A用药相关的三个SNP位点进行分型，包括CYP3A4基因上的rs2242480 SNP位点、CYP3A5基因上的rs776746 SNP位点及MDR1基因上的rs1045642 SNP位点。试剂盒包含野生型2×扩增缓冲液、突变型2×扩增缓冲液、聚合酶，两种缓冲液中分别含有对应SNP野生型和突变型表型的序列特异性引物和内参引物，可在两个多重PCR反应中完成对上述三个SNP位点的分型，从而达到对他克莫司和环孢素A合理用药提供分子生物学依据。
文档编号C12Q1/68GK102277443SQ20111027420
公开日2011年12月14日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者周毓玲, 崔丽娟, 杜宏伟, 韩俊领 申请人:协和干细胞基因工程有限公司, 天津滨海协和基因科技有限公司