专利名称：甘油发酵法制备1,3-丙二醇的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，一种甘油发酵法制备1，3-丙二醇的方法。
背景技术：
1，3-丙二醇是有广阔应用前景的化工原料，主要用做聚醋和聚氨酯的单体以及溶齐U、抗冻剂或保护剂等。此外，1，3_丙二醇还可用作增塑剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂的合成，也可作为产品中的组分如化妆品、打印机墨水、清洁剂、稳定剂和燃料电池燃料等的添加剂来提高产品的性能。作为医药和有机合成的中间体，1，3_丙二醇可用于食品、化妆品和制药等行业。1，3-丙二醇作为中间体还生产多醇聚酯及作为碳链延伸剂，还可用于制备其它不饱和聚酯，如聚萘二甲酸丙二醇酯(PTN)和共聚聚酯以及制备新型聚氨酯树脂等。1，3-丙二醇的生产方法有化学法和生物法，中国专利CN101134713A，CN1431183A等均是采用化学法，但是化学合成法副产物多，产品提纯分离困难，生产成本高。相比之下，生物转化法生产1，3_丙二醇以其利用再生资源、对环境污染小等特点越来越受到重视。目前生物合成法生产I,3-丙二醇存在产物浓度低，生产周期长和甘油转化率低等问题，因此，采用廉价易得的原料，在温和条件下制备I，3-丙二醇，对于提升I，3-丙二醇和下游产物的制备以及扩大应用都有特别重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种合成由甘油发酵合成1，3_丙二醇的方法，实现1，3-丙二醇的条件温和、成本低廉制备。本发明是这样实 现的:将伊纽小单孢菌中sisl的3’，4’-双脱羟基酶基因通过基因重组和DNA重排等技术得到2’ -脱羟基酶基因(sisll)。通过克隆得到sisll，随后将其构建到pET30a表达载体，并在E.coli BL21实现异源表达，构建甘油脱水合成1，3_丙二醇(TOO)的工程菌BL21-sis，同时采用超分子自组装模板法固定化，然后在含有甘油的培养基中发酵合成1，3_丙二醇，通过过滤发酵液、有机溶剂萃取等获得产品1，3_丙二醇。具体技术方案如下:I)将伊纽小单孢菌中sisl的3’，4’ -双脱羟基酶基因通过基因重组和DNA重排等技术得到2’ -脱羟基酶基因(sisll)，通过PCR方法加上生物砖标准化酶切位点EcoRI，hindIII并与生物砖骨架Pet30a连接，进行同义突变，完成生物砖元件Pet-sis的构建；2)将构建好的Pet-sis，转化到大肠杆菌BL21中，甘油保种；3)进行发酵培养前先在种子培养基中培养，用无菌注射器将种子液第I次接种于装有种子培养基的血清瓶中再培养，将扩培的种子液第2次接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵后，得产物I，3-丙二醇。在步骤I)中，PCR仪、凝胶成像仪和蛋白电泳仪购自美国BIO-RAD公司。在步骤2)中，所述的伊纽小单孢菌购自买Takara公司，所述大肠杆菌BL21购买Takara 公司。
在步骤3)中，所述种子培养基可采用LB培养基；所述培养的条件可为37°C、150r/min摇床培养；所述第I次接种的接种量可为5%;所述再培养的条件可为37°C、150r/min摇床培养；所述第2次接种的接种量可为10%;所述发酵的过程中可向发酵罐中通氮气来维持体系的厌氧条件，并控制PH为6.8 ;所述发酵的过程中可加入补料混合溶液，所述补料混合溶液由甘油组成；所述分析发酵液中甘油和1，3-丙二醇浓度的方法可采用美国安捷伦高效液相色谱AgilentllOO分析发酵液中甘油和1，3_丙二醇浓度。在步骤3)中，在发酵过程中，可每间隔I 3h取样，测定发酵液的菌体OD值，分析发酵液中甘油和1，3_丙二醇的浓度。本发明的优点在于将伊纽小单孢菌中sisl的3’，4’_双脱羟基酶基因通过基因重组和DNA重排等技术得到2’ -脱羟基酶基因(sisll)。通过克隆得到sisll，将其构建到pET30a表达载体，并在E.coli BL21实现异源表达，构建甘油脱水合成1，3-丙二醇的工程菌BL21-sis，同时采用超分子自组装模板法固定化，然后在含有甘油的培养基中发酵合成1，3_丙二醇。这种方法的益处在于大大突破了甘油生物法生产1，3_丙二醇甘油转化率低的瓶颈，提高了底物转化率，缩短了发酵时间，从而降低了生产成本，为微生物利用甘油发酵法生产1，3-丙二醇的工业化奠·定了基础。
具体实施例方式通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的限制。实施例1I)生物砖元件Pet-sis的构建提取伊纽小单孢菌基因组，根据NCBI公布的依纽小单孢菌生物合成基因簇(FJ160413)基因序列设计合成PCR所需的引物。上游引物sisll 为:CCC AAGCTT TCACACCGAGATCTGC(HindiII)；下游引物sisI2 为:CCG GAATTC ATGGAACCAGGACTTG (EcoR I)。向200 μ L eppedoff管中，加入200pmol的dNTPs,上下游引物各20 μ mol,模板DNA约lng,5UFast Pfu DNA聚合酶，10 μ L5 X Fast Pfu酶Buffer,然后加无菌蒸懼水至总体积50 μ L0利用Biometra TProfessional PCR仪反应参数是94°C预变性5min后,94。。变性45s，66.8°C退火45s，72。。延伸90s，30个循环，然后72°C延伸5min，得到PCR产物。提取质粒Pet30a，经HindIII/EcoR I双酶切，连接前端载体片段和目的基因插入片段，得到质粒Pet-sis转化到DH5 α中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37°C培养24h，挑单菌落，370C LB液体培养基200r/min震荡培养14h。2)工程菌的构建。提取质粒Pet-sis，转化到BL21中，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37°C培养24，挑单菌落，370C LB液体培养基200r/min震荡培养14h得到工程菌BL21_sis。3)发酵培养(I)发酵方式:10L机械搅拌发酵罐，通氮气分批发酵(2)培养基:种子培养基(g/L):可溶性淀粉8 %，葡萄糖2 %，酵母粉8 %，硫酸镁0.2%.碳酸钙 0.2%，氯化钴 2μ g.L-1，甘氨酸 0.2%, (NH4) 2S045g,iI pH7.0,0.1Mpa 灭菌 20min。发酵培养基(g/L):发酵培养基为添加15.0%甘油的LB培养基；再添加微量元素10mL/Lo微量元素溶液(/L)=ZnCl2,0.06g ；MnCl2.4Η20，0.2g ;Η3Β03，0.08g ；CoCl2.6Η20,0.1g ；CuCl2.2Η20，0.0lg ；NiCl2.6Η20，0.020g ；Na2MoO4.2Η20，0.040g。(3)发酵过程:发酵培养:将扩培的种子液以9%的接种量接种于装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，搅拌转速HOrpm，在发酵过程中向发酵罐中通氮气来维持发酵体系的厌氧条件。pH控制:用浓度为2mol/LNa0H溶液自动调节为6.8。补料控制:根据分批发酵中甘油消耗与碱液消耗的比例关系，以甘油(折合后):NaOH =74: 9的比例(质量比)配制混合溶液，补料时用该混合溶液代替单纯的NaOH溶液，在调节pH的同时进行甘油流加，补料结束后换回单纯的NaOH溶液，继续消耗完发酵液中残余的甘油。取样分析:每间隔2h取样，测定发酵液的菌体OD值，分析发酵液中甘油和1，3_丙
二醇浓度。4)发酵结果:从6h补料开始，发酵液中的甘油浓度一直维持在17g/L左右，1，3_丙二醇的浓度快速增加，Ilh左右菌 体生长进入稳定期，15h时发酵结束，继续补料，发酵液中仍然含有17.1 g/L的残余甘油。发酵结束时I，3-丙二醇浓度为33.7g/L，转化率为0.56g/g，生产强度为 2.25g/L。5)发酵产物的分离:发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩后，得到I，3-丙二醇36.33g(收率80.7% )0实施例2各培养基的组成和培养条件同上。I)发酵过程:发酵培养:将扩培的种子液以9%的接种量接种于装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，搅拌转速HOrpm，在发酵过程中向发酵罐中通氮气来维持发酵体系的厌氧条件。pH控制:用浓度为2mol/LNa0H溶液自动调节为6.4。补料控制:根据分批发酵中甘油消耗与碱液消耗的比例关系，以甘油(折合后):NaOH = 8: I的比例(质量比)配制混合溶液，补料时用该混合溶液代替单纯的NaOH溶液，在调节pH的同时进行甘油流加，补料结束后换回单纯的NaOH溶液，继续消耗完发酵液中残余的甘油。取样分析:每间隔2h取样，测定发酵液的菌体OD值，分析发酵液中甘油和1，3_丙
二醇浓度。2)发酵结果:从8h补料开始，发酵液中的甘油浓度一直维持在19g/L左右，1，3_丙二醇的浓度快速增加，13h左右菌体生长进入稳定期，18h时发酵结束，继续补料，发酵液中仍然含有19.1 g/L的残余甘油。发酵结束时I，3-丙二醇浓度为35.7g/L，转化率为0.58g/g，生产强度为 2.35g/g/L。3)发酵产物的分离:发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩后，得到 I，3-丙二醇36.33g(收率84.7% )0
权利要求
1.本发明涉及1，3-丙二醇的合成，是将伊纽小单孢菌中SiSl的3'，4'-双脱羟基酶基因通过基因重组和DNA重排等技术得到2'-脱羟基酶基因(sisll)。通过克隆得到sisll，随后将其构建到pET30a表达载体，并在E.coli BL21实现异源表达，构建甘油脱水合成1，3_丙二醇(TOO)的工程菌BL21-sis，同时采用超分子自组装模板法固定化，然后在含有甘油的培养基中发酵合成1，3_丙二醇，通过过滤发酵液、有机溶剂萃取等获得产品1，3-丙二醇。
2.按照权利要求1所述，其特征在于甘油脱脱羟基合成1，3_丙二醇的工业工程菌的构建是由伊纽小单孢菌中sisl突变得到sisll，使用基因重组和DNA重排技术，将脱氢酶基因整合进大肠杆菌BL21。
3.按照权利要求1所述，其特征在于采用超分子自组装模板对甘油脱氢合成1，3-丙二醇的工业工程菌固定化，并在酸性水溶液中结构稳定。
4.按照权利要求1所述，其特征在于将经固定化的甘油脱氢合成1，3_丙二醇的工业工程菌，在含有甘油的培养基中发酵合成1，3-丙二醇，发酵的工艺技术条件为温度为25-370C >200r/min 振荡培养时间 21_26h。
5.按照权利要求1所述，其特征在于发酵液先经过滤分离催化酶重复使用，利用乙酸丁酯萃取获得产品I ，3-丙二醇。
全文摘要
一种生物法发酵法制备1,3-丙二醇(PDO)的生产工艺，属于生物化工技术领域。本发明将伊纽小单孢菌中sisI的3′,4′-双脱羟基酶基因通过基因重组和DNA重排等技术得到2′-脱羟基酶基因(sisII)。通过克隆得到sisII，随后将其构建到pET30a表达载体，并在E.coli BL21实现异源表达，构建甘油脱水合成1,3-丙二醇的工程菌BL21-sis，同时采用超分子自组装模板法固定化，然后在含有甘油的培养基中发酵合成1,3-丙二醇，通过过滤发酵液、有机溶剂萃取等获得产品1,3-丙二醇。该制备1,3-丙二醇的方法，具有生产周期短，所需设备简单，环境友好，操作简单易控，原料廉价等优点，易于实现工业化生产，具有重大的实用价值。
文档编号C12R1/29GK103146766SQ20131006991
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月6日 优先权日2013年3月6日
发明者蔡佩君, 赵云, 拾冲, 谭静萍, 李 荣, 李成军, 赵明光 申请人:徐州凯米克新材料有限公司