专利名称：一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种溶菌酶的制备方法，特别涉及一种鸡蛋清中分离溶菌酶的方法。
背景技术：
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。溶菌酶在临床上是有效的消炎剂，在食品防腐和基因工程等方面也有广泛的应用。溶菌酶来源很广，在人、动物、植物和微生物中均有发现，其中鸡蛋清中含量最高，因此，工业生产溶菌酶常以鸡蛋为原料。
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从鸡蛋中溶菌酶的提取方法报道很多，有直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、沉淀法、双水相萃取、超滤法等。各种方法优缺点不一，产品的质量和生产成本也有所不同。目前，沉淀法是一种工业上应用比较成熟的提取方法，其在技术要求和生产成本上都比较好。其中，生吉萍等中国食品学报，2003年增刊，10 14用等电点沉淀法，即先将获取的蛋清液用NaCl溶液稀释，再用lmol/L的NaOH溶液将蛋清pH值调到9.5 11.0，使其接近溶菌酶的等电点，并4°C下静置，从而使溶菌酶沉淀下来。这种方法操作简单，在工业生产中可以使产品的成本大大降低。但是其生产周期较长，产率相对偏低，纯度不高，高纯度产品获取过程复杂，需要增加较多步骤。康旭、邓川等采用盐析沉淀法畜牧与饲料科学，2010，31 (5)，91 92，即用pH值为6.5的磷酸盐缓冲液(PBS)将蛋清稀释5倍，在搅拌和除去杂蛋白后，用硫酸铵对上清液分级沉淀，取40 % 80 %饱和度部分的沉淀，得溶菌酶。得到的溶菌酶纯度达到电泳纯，其中用80%左右饱和度硫酸铵时收率最好。此法得到的溶菌酶纯度和产率都比较高，但是依旧存在沉淀速度慢及不完全的问题，因而使得溶菌酶的活性降低了很多。陈若飞用聚丙烯酸沉淀法从蛋壳中提取溶菌酶沈阳化工学院学报，2008年9月第22卷第3期222 225，在除去杂蛋白后，加入NaOH溶液调pH至6.0，加入聚丙烯酸，产生乳白色胶状物。将聚合物用Na2COJf其溶解，并pH调至9.5，加入质量分数为5%的CaCl2液将溶菌酶聚丙烯酸解离，接着过滤得到澄清溶液。最后加入NaOH溶液调pH为10.5左右，使溶菌酶结晶析出。此法选择性好，得到的溶菌酶纯度很高，但是聚丙烯酸价格较贵，而且水溶液的黏性较大，不方便大规模生产。文章军和钱生球在其专利一种分离溶菌酶的方法中描述，以蛋清为原料，加水稀释后，搅拌均匀，用酸调pH至4.0 5.0，静置，除去沉淀，再将溶液升温至75 80°C，冷却静置，过滤得上清液，然后用碱调pH至7.5 8.0，加入乙醇至产生沉淀，静置6 10小时后过滤，干燥沉淀溶菌酶。其工艺步骤简单、生产周期短、除杂蛋白效果较好、收率也比较高，但是最后所得酶的活性不是特别高。国外，研究者用N-异聚丙烯酰胺与丙烯酸单体的共聚物从蛋清中，Journal ofBiotechnology, 87 (2001)，95 107，虽然得到的产品纯度高、收率高、活性也比较好，但是生产的成本高，而且操作十分复杂。
溶菌酶为白色或微白色冻干粉，可溶于水，不溶于乙醚和丙酮。相对分子量在14000左右，pi在10.5 11.0，最适存在和反应的pH值为6.5。酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96°C或pH值为3条件下，15min后活力保持87%。而蛋清中的其他蛋白的pi在4.0 5.0,在80°C以上的闻温下易失活，所以，可以用等电点沉淀法除杂蛋白。由于溶菌酶的Pi太高，此时采用等电点沉淀产生一定量的失活，但溶菌酶在弱碱性条件下，会在乙醇作用下结晶，所以可以用乙醇使其结晶而分离。此外，木质素磺酸钠可以溶解在碱性的水溶液中，而且在实验研究中发现，木质素磺酸钠可以在弱酸条件下与溶菌酶生成聚合物沉淀。所以本发明就是利用这种聚合沉淀的方法提取分离蛋清中溶菌酶。而聚丙烯酰胺作为水溶性高分子聚合物，具有良好的絮凝性，本身无毒副作用，且聚丙烯酰胺易与木质素磺酸盐生产凝聚物。蒋成新在研究中，有利用聚丙烯酰胺和木质素磺酸钠复合石油钻采工艺，1988年专辑(22) 2，193 202，生成复合铬冻胶堵水剂。而本发明则是利用聚丙烯酰胺水溶液与木质素磺酸钠结合，生成沉淀，而使木质素磺酸钠和溶菌酶的聚合沉淀解离，达到得到分离。
所以本发明使用的原材料价格低、工艺简单、条件温和、便于操作控制、生产周期短，比以往的沉淀法更经济，更适合于工业化生产。
发明内容
本发明目的是提供一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，使用的原材料价格低、工艺简单、条件温和、便于操作控制、生产周期短，比以往的沉淀法更经济，更适合于工业化生产。本发明采用的技术方案是:一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，所述方法按以下步骤进行:(I)将鲜鸡蛋清用水稀释后，搅拌均匀，调节pH值至4.0 5.0后立即加热至80 85°C，保温10 15min，水浴冷却至20 35°C后静置6 10h，过滤，获得滤液a ；(2)将步骤(I)获得的滤液a调pH值至4.5 6.5，搅拌下，缓慢加入木质素磺酸钠至有沉淀生成,静置3 9小时，过滤，取滤饼用Na2CO3水溶液溶解完全后，再缓慢加入聚丙烯酰胺水溶液至无沉淀产生，静置4 8小时，过滤，获得滤液b ；(3)向步骤(2)获得的滤液b中缓慢加入无水乙醇至产生白色沉淀，静置(15 40°C下静置3 5h)，过滤，将滤饼冷冻干燥，获得所述溶菌酶。进一步，步骤(2 )中将步骤(I)获得的滤液a用质量浓度5%的NaOH水溶液调pH值，优选调PH值至5.5 5.8。进一步，步骤(2)中木质素磺酸钠相对分子量为4000 10000。进一步，步骤(2)中木质素磺酸钠以质量浓度10% 20%的木质素磺酸钠水溶液的形式加入，所述木质素磺酸钠水溶液与滤液a的体积比为0.4 1.2:1，优选0.8:1。进一步，步骤(2)中Na2CO3水溶液的质量浓度为3 10%，优选5%。进一步，步骤(2)中聚丙烯酰胺水溶液的质量浓度为5% 25%，优选10 15%。进一步，步骤(2)加入木质素磺酸钠的温度为15 40°C，优选25°C ;所述加入聚丙烯酰胺水溶液的温度为15 40°C，优选25°C。
进一步，步骤(2)中聚丙烯酰胺的相对分子量300万 800万。进一步，步骤(3)所述加入无水乙醇的温度为15 40°C，优选25°C。本发明用造纸行业的废物木质素磺酸钠作为沉淀剂，从鸡蛋清中分离溶菌酶。首先，用水将鸡蛋清溶解，调节pH至4.0 5.0并加热至80°C左右，使杂蛋白沉淀、过滤除去，获得滤液；再在弱酸性条件下，用木质素磺酸钠与滤液中的溶菌酶进行聚合、沉淀；然后，将沉淀物在碱性条件下溶解，用聚丙烯酰胺水溶液使其解离，并与木质素磺酸盐生成沉淀，过滤得滤液；最后，向滤液中加入无水乙醇使其结晶，过滤、干燥即得溶菌酶。接下来进行称量和酶活力的测定，其中，酶活力的测定采用分光光度计法(即F.1.P法)。其原理是溶菌酶破坏细菌的细胞壁，从而降低细胞悬浮液的浊度，可用分光光度计法来测定这种反应。一个F.1.P溶菌酶单位相当于在规定条件下于450nm处每分钟将吸光度降低0.001所需的酶量。用以下公式(I)计算酶的活性:
权利要求
1.一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于所述方法按以下步骤进行: (1)将鲜鸡蛋清用水稀释后，搅拌均匀，调节PH值至4.0 5.0后立即加热至80 85°C，保温10 15min，水浴冷却至20 35°C后静置6 10h，过滤，获得滤液a ； (2)将步骤(I)获得的滤液a调pH值至4.5 6.5，搅拌下，缓慢加入木质素磺酸钠至有沉淀生成,静置3 9小时，过滤，取滤饼用Na2CO3水溶液溶解完全后，再缓慢加入聚丙烯酰胺水溶液至无沉淀产生，静置4 8小时，过滤，获得滤液b ； (3)向步骤(2)获得的滤液b中缓慢加入无水乙醇至产生白色沉淀，静置，过滤，将滤饼冷冻干燥，获得所述溶菌酶。
2.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于步骤(I)用质量浓度5%的盐酸来调节pH值。
3.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于步骤(2)中将步骤(I)获得的滤液a用质量浓度5%的NaOH水溶液调pH值。
4.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于:步骤(2)中木质素磺酸钠相对分子量为4000 10000。
5.如权利要求1或4所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于:步骤(2)中木质素磺酸钠以质量浓度10% 2 0%的木质素磺酸钠水溶液的形式加入，所述木质素磺酸钠水溶液与滤液a的体积比为0.4 1.2:1。
6.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于:步骤(2)中Na2CO3水溶液的质量浓度为3 10%。
7.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于:步骤(2)中聚丙烯酰胺水溶液的质量浓度为5% 25%。
8.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于步骤(2)加入木质素磺酸钠的温度为15 40°C，所述加入聚丙烯酰胺水溶液的温度为15 40°C。
9.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于步骤(2)中聚丙烯酰胺的相对分子量300万 800万。
10.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于步骤(3)所述加入无水乙醇的温度为15 40°C。
全文摘要
本发明公开了一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法用水将鸡蛋清溶解，调节pH至4.0～5.0并加热至80℃左右，使杂蛋白沉淀、过滤除去，获得滤液；再在弱酸性条件下，用木质素磺酸钠与滤液中的溶菌酶进行聚合、沉淀；然后，将沉淀物在碱性条件下溶解，用聚丙烯酰胺水溶液使其解离，过滤得滤液；最后，向滤液中加入无水乙醇使其结晶，过滤、干燥即得溶菌酶；本发明使用的原材料价格低、工艺简单、条件温和、便于操作控制、生产周期短，比以往的沉淀法更经济，更适合于工业化生产。
文档编号C12N9/36GK103114082SQ20131006909
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月4日 优先权日2013年3月4日
发明者张健, 金志敏, 夏春年, 姚小武, 张岩 申请人:浙江工业大学