专利名称：由甘油高产率制备3-羟基丙酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过在含有甘油的培养基中培养突变微生物而制备3-羟基丙酸的方法，所述突变微生物通过在具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物中插入或扩增丙二醇利用蛋白编码基因而获得。
背景技术：
3-羟基丙酸是一种与乳酸和琥珀酸一起作为生物质衍生的平台化学原料备受关注的物质，可用作制备1，3-丙二醇、丙烯酸、丙烯酰胺、丙二酸或诸如聚羟基丙酸的生物聚合物的原料。因此，开发大量制备3-羟基丙酸的技术非常重要。已知作为用于 制备3-羟基丙酸的化学方法，有在钯催化剂存在下由1，3_丙二醇制备3-羟基丙酸的方法(US 5321156);在钯/钼催化剂存在下由3-羟基丙醛制备3-羟基丙酸的方法(US 5831121);使用离子交换树脂由丙烯酸制备3-羟基丙酸的方法(JP2000-159724)；以及在酸或碱催化剂存在下由环氧化物衍生物制备3-羟基丙酸的方法(KR10-0408806)等。就生物方法而言，威斯康星大学的Suthers等人报道了一种使用过表达源自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶基因和源自大肠杆菌(E. coli)或酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的醒脱氢酶基因的重组大肠杆菌菌株由甘油制备3-轻基丙酸的方法(US 6852517)。最近，Rathnasingh等人报道了一种由甘油制备增加量的3-轻基丙酸的新型重组大肠杆菌菌株(Rathnasingh等人，Biotechnol.Bineng. 104:729-39. 2009)。然而，使用重组大肠杆菌由甘油制备3-羟基丙酸的方法的缺点在于，需要向培养基供应昂贵的辅酶腺甙钴胺生素(辅酶B12)以使甘油脱水酶复活。同时，本发明的发明人等发现当在肺炎克雷伯菌中醛脱氢酶基因高表达时，能够以高产率制备3-羟基丙酸而无需添加辅酶B12。因此，本发明的发明人等为了开发通过肺炎克雷伯菌由甘油制备增加量的3-羟基丙酸的方法进行了多方面的努力，结果发现当罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的丙二醇利用蛋白编码基因在肺炎克雷伯菌中过表达时，能够以高产率制备3-羟基丙酸，由此实现了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种由甘油高产率制备3-羟基丙酸的方法。本发明的另一个目的是提供一种能够由甘油高产率制备3-羟基丙酸的突变微生物。为了实现上述目的，本发明提供了一种突变微生物，所述突变微生物通过在具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物中插入或扩增丙二醇利用蛋白编码基因而获得。
本发明还提供了一种制备具有产生3-羟基丙酸的高能力的突变微生物的方法，其特征在于，在具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物中插入或扩增丙二醇利用蛋白编码基因。本发明还提供了一种制备3-羟基丙酸的方法，所述方法包括(a)在含有甘油的培养基中培养上述突变微生物，由此产生3-羟基丙酸的步骤；和(b)回收所产生的1，3-丙二醇的步骤。本发明还提供了一种肺炎克雷伯菌突变株，其特征在于，在肺炎克雷伯菌中，缺失甘油脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)以及甘油脱水酶复活因子II基因(DhaBA2)，而且引入了 1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因、醛脱氢酶编码基因以及丙二醇利用蛋白基因。本发明还提供了一种制备肺炎克雷伯菌突变株的方法，其特征在于，在肺炎克雷伯菌中，使甘油脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)以及甘油脱水酶复活因子II基因(DhaBA2)缺失，而且引入1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因、醛脱氢酶编码基因以及丙二醇利用蛋白基因。本发明还提供了一种制备3-羟基丙酸的方法，所述方法包括(a)在含有甘油的培养基中培养上述肺炎克雷伯菌突变株，由此产生3-羟基丙酸的步骤；和(b)回收所产生的3-羟基丙酸的步骤。通过下述具体实施方式
和所附权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加明确。
图1是表示重组质粒pVOTLp的构建方法图。
图2是表示重组质粒pVOT的构建方法图。图3是表示肺炎克雷伯菌AK突变株的构建方法图。
具体实施例方式除非另有定义，本说明书中所使用的所有科技术语均具有本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。总体上，下文所描述的本发明所用术语和试验方法是本领域公知和通常使用的方法。一方面，本发明涉及一种突变微生物及其制备方法，所述突变微生物通过在具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物中插入或扩增丙二醇利用蛋白编码基因而获得。在本发明中，上述丙二醇利用蛋白编码基因可为罗伊乳杆菌(Lactobacillusreuteri)的丙二醇利用蛋白编码基因(PduP);具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-轻基丙酸的能力的微生物,可为克雷伯菌属(Klebsiella)微生物。在本发明中，具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物，可为甘油氧化途径被阻断的微生物。另一方面，本发明涉及一种制备3-羟基丙酸的方法，所述方法包括(a)在含有甘油的培养基中培养上述突变微生物，由此产生3-羟基丙酸的步骤；和(b)回收所产生的3-羟基丙酸的步骤。又一方面，本发明涉及一种肺炎克雷伯菌突变株及其制备方法，所述肺炎克雷伯菌突变株的特征在于，在肺炎克雷伯菌中，缺失甘油脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)U, 3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)以及甘油脱水酶复活因子II基因(DhaBA2)，并且引入了 1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因、醛脱氢酶编码基因以及丙二醇利用蛋白基因而获得。在本发明中，丙二醇利用蛋白编码基因可为罗伊乳杆菌的丙二醇利用蛋白编码基因(PduP)，上述肺炎克雷伯菌突变株可为肺炎克雷伯菌AK-VOTLp (KCTC 11689BP)。还一方面，本发明涉及一种制备3-羟基丙酸的方法，所述方法包括(a)在含有甘油的培养基中培养上述肺炎克雷伯菌突变株，由此产生3-羟基丙酸的步骤；和(b)回收所产生的3-羟基丙酸的步骤。在本发明中，由突变株的培养液回收3-羟基丙酸可利用传统的分离技术实施，例如，包括蒸馏、电渗析、渗透蒸发、色谱、溶剂萃取、反应萃取等，这些技术通常可联合使用以分尚闻纯度物质。在本发明中，基因“扩增”是指另外引入存在于个体染色体或质粒中的基因以使得能够被过表达；基因“引入”是指将基因插入个体染色体中或使用重组载体将基因转化至个体中。在本发明中，作为上述将基因插入细胞染色体中的方法，可使用本领域已知的传统基因操作方法实施。例如，可举出使用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、 痘病毒载体、慢病毒载体或非病毒载体的方法。实施例在下文中，将通过实施例进一步详细描述本发明。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是这些实施例仅用于例示本发明而并非解释为限制本发明的范围。实施例1 :过表达丙二醇利用蛋白编码基因的肺炎克雷伯菌重组菌株的构建(I)过表达丙二醇利用蛋白编码基因的质粒的构建构建了用于在肺炎克雷伯菌菌株中过表达丙二醇利用蛋白编码基因的质粒，所述丙二醇利用蛋白编码基因被认为参与在肺炎克雷伯菌菌株中由甘油产生3-羟基丙酸。将罗伊乳杆菌的染色体DNA作为模板，并使用下列引物序列扩增丙二醇利用蛋白编码基因(PduP) (GenBank数据库号BAG26139)后，用pGEMTEasy载体进行克隆并测序，然后构建质粒DNA (见图1)。序列号1:5'-TCTAGAatgcagattaatgatattgaaagtgct-3' (PduP-F)序列号2:5'-GGATCCCTCGAGttaataccagttacgtactgagaatcc-3' (AldHk-R)如图1所示，将罗伊乳杆菌的丙二醇利用蛋白编码基因(PduP)引入IacZ启动子下游，然后将其插入含有DhaB复活酶基因(dhaT)和1，3_丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)的质粒pVOT中，由此构建含有丙二醇利用蛋白编码基因和DhaB复活酶基因的质粒pVOTLp。将所构建的pVOTLp和质粒pVOT各自引入消除质粒DNA的肺炎克雷伯菌MGH78578菌株(称为“Cu”)，由此构建肺炎克雷伯菌Cu/pVOT和肺炎克雷伯菌Cu/pV0TLp。根据图2所示的方法构建pVOT质粒。将质粒pVOT引入肺炎克雷伯菌中，并命名为“肺炎克雷伯菌AK-V0T”。该重组菌株以保藏号KCTC 11421BP保藏于韩国生命工学研究院生物资源中心。(2)甘油氧化还原途径被阻断的肺炎克雷伯菌重组菌株的构建通过同源重组方法，并使用消除质粒DNA的肺炎克雷伯菌MGH78578菌株(称为“Cu”)作为母体菌株，以安普霉素(apramycin)抗性基因取代dha调节子(图2)的DhaB酶复活因子、DhaT基因、DhaR调节子以及DhaD基因，由此制备甘油氧化途径和还原途径均被阻断的重组菌株AK。将肺炎克雷伯菌MGH78578菌株的染色体DNA作为模板，使用下列引物组，并通过PCR，扩增用于制备同源重组质粒的DNA片段。扩增dhaBI基因片段用引物序列号3:5'-TCTAGAATGAAAAGATCAAAACGATTT-3' (dhaBI XbaI_480bpF)序列号4:5' -GGATCCGTCAGCGGCAATCTGCAC-3' (dhaBI BamH1-480bpR)扩增dhaK基因片段用引物 序列号5:5'-AAGCTTCATGCTCTCCGGCGCCTGTC-3' (dhaK HindII1-200_700bpF)序列号6:5'-AGATCTATTTGGTCCAGCGAGCTGAAGC-3' (dhaK BglI1-200-700bpR)扩增dhaR基因片段用引物序列号7:5'-AGATCTCCTGGGATTTCGCGACGGCA-3' (dhaR bglI1-200-700bpF)序列号8:5' -AAGCTTTCGACAATCGGTTTTAAGGTG-3 ' (dhaRHindII1-200-700bpR)扩增Apr基因片段用引物序列号9:5'-GTTAACCTGACGCCGTTGGATACACC-3' AprHpaIF序列号10:5'-AGATCTAAAAGCTTATGAGCTCAGCCAATCGA-3' AprHindII1-BglIIR利用pGEM TEasy载体将扩增的DNA片段克隆并进行测序。然后，如图3所示，构建质粒DNA。根据图3所示的方法，构建用于制备AK菌株的、DhaB基因的氨基末端(dhaB/ )-LacZ启动子(Plaez)_安普霉素抗性基因-DhaK基因的氨基末端(dhaK')被连接的质粒DNA。使用BamH1-BglII处理上述质粒，并通过电穿孔(电冲击法)将所收集的DNA片段引入至肺炎克雷伯菌Cu菌株中。然后，将在添加有安普霉素的培养基中分离形成克隆的重组菌株。其结果，获得了缺失dha调节子的DhaB酶复活因子、DhaT基因、DhaR调节子以及DhaD基因，并插入了 IacZ启动子和安普霉素抗性基因的重组肺炎克雷伯菌AK菌株(KCTC11419BP)。(3)甘油缺氧代谢氧化途径被阻断的突变菌株中丙二醇利用蛋白编码基因的过表达通过电穿孔将含有丙二醇利用蛋白编码基因的质粒pVOTLp基因、以及含有DhaB复活酶基因和1，3-丙二醇氧化还原酶基因的质粒DNA分别引入肺炎克雷伯菌Cu菌株和AK菌株中。本实施例中所构建的重组菌株AK-VOTLp以保藏号KCTC 11689BP保藏于韩国生命工学研究院生物资源中心。表1:本发明所使用或构建的重组菌株和质粒DNA
权利要求
1.一种突变微生物，其是在具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物中，插入或扩增丙二醇利用蛋白编码基因而获得的突变微生物。
2.根据权利要求1所述的突变微生物，其中，所述丙二醇利用蛋白编码基因是罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的丙二醇利用蛋白编码基因(PduP)。
3.根据权利要求1所述的突变微生物，其中，所述具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物是肺炎克雷伯菌。
4.根据权利要求1所述的突变微生物，其中，甘油的氧化途径被阻断。
5.一种制备具有产生3-羟基丙酸高能力的突变微生物的方法，其特征在于，在具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物中，插入或扩增丙二醇利用蛋白编码基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述丙二醇利用蛋白编码基因是罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的丙二醇利用蛋白编码基因(PduP)。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物是肺炎克雷伯菌。
8.一种制备3-羟基丙酸的方法，所述方法包括 (a)在含有甘油的培养基中，培养权利要求1至4中任一项所述的突变微生物，由此产生3-羟基丙酸的步骤；和 (b)回收所产生的1，3-丙二醇的步骤。
9.一种肺炎克雷伯菌突变株，其特征在于，在肺炎克雷伯菌中缺失甘油脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)以及甘油脱水酶复活因子II基因(DhaBA2)，并引入了 1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因、醛脱氢酶编码基因以及丙二醇利用蛋白基因。
10.根据权利要求9所述的肺炎克雷伯菌突变株，其中，所述丙二醇利用蛋白编码基因是罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的丙二醇利用蛋白编码基因(PduP)。
11.根据权利要求9所述的肺炎克雷伯菌突变株，其中，所述肺炎克雷伯菌突变株是肺炎 克雷伯菌 AK-VOTLp (KCTC 11689BP)。
12.—种制备肺炎克雷伯菌突变株的方法，其特征在于，在肺炎克雷伯菌中使甘油脱氢酶基因(DhaD)、转录激活因子基因(DhaR)、l，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)以及甘油脱水酶复活因子II基因(DhaBA2)缺失，并将1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因、醛脱氢酶编码基因以及丙二醇利用蛋白基因引入至肺炎克雷伯菌中。
13.—种制备3-羟基丙酸的方法，所述方法包括 (a)在含有甘油的培养基中，培养权利要求9至11中任一项所述的肺炎克雷伯菌突变株，由此产生3-羟基丙酸的步骤；和 (b)回收所产生的3-羟基丙酸的步骤。
全文摘要
本发明涉及一种制备3-羟基丙酸的方法，其特征在于，在具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物中插入或扩增丙二醇利用蛋白编码基因而获得突变微生物，并将该突变微生物在含有甘油的培养基中进行培养。根据本发明，能够由甘油高产率制备3-羟基丙酸而无需添加昂贵的辅酶B12作为辅因子。
文档编号C12P7/40GK103038335SQ201180025904
公开日2013年4月10日 申请日期2011年5月24日 优先权日2010年5月25日
发明者金哲镐, 徐正又, 罗莲花 申请人:韩国生命工学研究院