专利名称：抗生链霉菌发酵生产喷司他丁的发酵培养基以及发酵方法
技术领域：
本发明属于工业微生物技术领域，特别涉及一种新的抗生链霉菌发酵生产喷司他丁的发酵培养基以及相应的发酵方法。
背景技术：
1974 ^ warner lambert ^W] ^ Woo ^hk Streptomyces antiboticus 发现一种腺苷脱氨酶抑制剂-喷司他丁。1992年喷司他丁被FDA批准用于干细胞白血病 (hairy cell leukemia, HCL)的治疗。随着对其临床应用的增加，市场需求量加大。但目前对喷司他丁生产研究的报道很少，唯一报道的发酵工艺见于US3923785，在该专利中，以抗生链霉菌NRRL3238为生产菌种，主要报道了一种较简单的培养基和培养方式，其目的是为了从发酵液分离到喷司他丁，以进行结构鉴定和生物活性检测。由于该专利的培养工艺过于简单，产物的发酵单位较低，不适用于规模化喷司他丁的生产。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的利用抗生链霉菌发酵生产喷司他丁发酵单位低的不足，提供一种新的抗生链霉菌发酵生产喷司他丁的发酵培养基以及相应的发酵方法，其可以大大提高喷司他丁的发酵单位，提高生产效率。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种用于抗生链霉菌 (Streptomyces antibioticus)发酵生产喷司他丁的发酵培养基，包括碳源和氮源，其中按培养基的总重量计，所述的碳源的含量是0. 5 14%，所述的氮源的含量是0. 5 10%，所述的碳源选自葡萄糖、糊精和小麦淀粉中的一种或多种，所述的氮源选自细豆粕粉、大豆蛋白、黄豆饼粉、酵母浸粉和棉子饼粉中的一种或多种。本发明的发酵培养基中，所述的碳源的含量为0.5 14%，较优的范围为1 6%。本发明的发酵培养基中，所述的氮源选自细豆粕粉、大豆蛋白、黄豆饼粉、酵母浸粉和棉子饼粉中的一种或多种。更佳的是选自细豆粕粉、大豆蛋白、黄豆饼粉和棉子饼粉中的一种或多种和酵母浸粉的混合物。最佳的是细豆粕粉和酵母浸粉的混合物。所述的氮源的含量为0.5 10%，较优的范围为1 6%。本发明的发酵培养基中，如常规的抗生链霉菌的发酵培养基一样，还含有矿物质。 矿物质的含量较佳的是0. 1%。所述的矿物盐可以是常规的抗生链霉菌的发酵培养基中所使用的各种矿物盐，一般作为渗透压调节剂，较佳的是NaCl。本发明的发酵培养基如常规的抗生链霉菌的发酵培养基一样，较佳的还可以进一步的含有痕量生长因子。本发明的发酵培养基如常规的抗生链霉菌的发酵培养基一样，较佳的还可以含有消泡剂。本发明的一较佳的实施例是，本发明的发酵培养基包含
0. 5 14%碳源，所述的碳源选自葡萄糖、糊精和小麦淀粉中的一种或多种；0. 5 10%细豆粕粉、大豆蛋白、黄豆饼粉和/或棉子饼粉；0.1 酵母浸粉；和0.1 矿物盐。本发明的发酵培养基的pH值较佳的是pH5. 0-8. 0，更佳的是pH5. 5-7. 5。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是一种喷司他丁的发酵生产方法，包括步骤(a)将抗生链霉菌(Sti^ptomyces antibioticus)的种子液接种于发酵培养基中进行液体发酵培养，所述的发酵培养基是权利要求1所述的发酵培养基；(b)从发酵液中分离出喷司他丁。在步骤(a)中，所述的抗生链霉菌的种子液是将抗生链霉菌是按常规的方法将抗生链霉菌在种子培养基中培养而得到的。所述的种子培养基可以是现有的抗生链霉菌的种子培养基，较佳的包括2%葡萄糖、2%黄豆饼粉0. 5% NaCUO. 25% CaCO30种子培养的温度较佳的是25 30°C。本发明中，所述的抗生链霉菌可以是现有的各种抗生链霉菌菌株，较佳的是抗生链霉菌NRRL3238。在步骤(a)中，所述的发酵培养的温度是20 40°C，较优的为25 37°C;优选的 pH5 8，较优的为ρΗ5· 5 7. 5。在步骤(b)中，从发酵液中分离出喷司他丁中的方法是常规的方法，一般是将发酵液离心取上清，经过疏水柱的洗脱，浓缩脱色然后结晶，从而得到喷司他丁。本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明除特别说明之外，所用的百分比都是重量百分比(Wt)。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明提供了一种有利于抗生链霉菌高效发酵生产喷司他丁的发酵培养基以及相应的发酵方法。通过优选发酵培养基的碳氮源成分及配比，优化培养温度、PH等发酵参数，从而大大提高喷司他丁的产量。本发明提供的发酵生产方法大幅提高了喷司他丁的发酵单位，适用于喷司他丁的规模化生产。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。发酵液中喷司他丁含量测定发酵结束时取适量发酵液，经12000rpm离心lOmin， 取上清液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤后用于高压液相色谱检测。色谱条件色谱柱=Hypersil 0DS2 柱(5ym，4. 6mmX250mm)；流动相甲醇-乙腈-10mmol/L 乙酸铵(2. 5 2.5 95) (PH = 7. 6)；流速1. OmL/min ；波长:280nm ；柱温40°C;进样量10 μ L，喷司他丁在7分钟左右出峰。实施例1取一株抗生链霉菌(Sti^ptomycesantibioticus) NRRL3238 (购自美国农业部菌种保藏中心)划线于种子斜面培养基二8°C培养7d后接种于种子培养基，装量为 20ml/250ml，于30°C，250rpm的旋转式摇床培养36h。将制得的发酵种子以(ν/ν)接种量接种于含有2L培养基的5L发酵罐中，自动控制发酵温度30°C，pH6. 5，转速与溶氧关联， 维持溶氧为40%，通气量0. 5VVM。24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h，发酵周期72h。喷司他丁的产量达50mg/L。其中所用的斜面培养基组成葡萄糖4.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，麦芽浸粉10. Og/ L，琼脂粉、20. Og/L, pH自然。所用的种子培养基组成2%葡萄糖、2%黄豆饼粉0. 5% NaCUO. 25% CaCO3,pH自然。发酵培养基组成葡萄糖40. Og/L,细豆柏30. Og/L,大豆蛋白20g/L，酵母浸粉 5. Og/L, NaCl 5. Og/L。实施例2按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖10. 0g/L，细豆柏30. 0g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C, ρΗ6· 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。 发酵周期72h，喷司他丁的产量达20mg/L。实施例3按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖60. 0g/L，细豆柏30. 0g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C, ρΗ6· 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。 发酵周期72h，喷司他丁的产量达30mg/L。实施例4按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成糊精60. 0g/L，细豆柏30. 0g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达35mg/L。实施例5按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成糊精20. 0g/L，细豆柏30. 0g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达25mg/L。实施例6按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成糊精40. 0g/L，细豆柏30. 0g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达30mg/L。实施例7按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40. 0g/L，细豆柏10. 0g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C, ρΗ7· 0，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。 发酵周期72h，喷司他丁的产量达20mg/L。实施例8按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40. Og/L，细豆柏60. Og/L，酵母浸粉5. Og/L, NaCl 5. Og/L。自动控制发酵温度30°C, ρΗ6· 0，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。 发酵周期72h，喷司他丁的产量达35mg/L。实施例9按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40. Og/L，细豆柏30. 0g/L，大豆蛋白20g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM。发酵周期72h，喷司他丁的产量达30mg/L。实施例10按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40. 0g/L，大豆蛋白60. 0g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C, ρΗ6· 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。 发酵周期72h，喷司他丁的产量达35mg/L。实施例11按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40. 0g/L，细豆柏30. 0g/L，大豆蛋白20g/L,NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C，pH5. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达25mg/L。实施例12按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40. 0g/L，细豆柏30. 0g/L，大豆蛋白20g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度37°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖 1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达45mg/L。实施例13按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40. 0g/L，细豆柏30. 0g/L，大豆蛋白20g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度25°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖 1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达30mg/L。实施例14按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40. 0g/L，细豆柏30. 0g/L，大豆蛋白20g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C，pH5. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖 1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达40mg/L。实施例15按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40. Og/L，细豆柏30. Og/L，大豆蛋白20g/L，酵母浸粉5. Og/L, NaCl 5. Og/L。自动控制发酵温度30°C，pH7. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖 1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达45mg/L。实施例16按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于50L生物反应器中。发酵培养基组成葡萄糖40. Og/L，细豆柏30. 0g/L，大豆蛋白20g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L, 泡敌0. 05g/L。自动控制发酵温度30°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达55mg/L。实施例17按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成小麦淀粉40. 0g/L，细豆柏30. 0g/L，酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C, ρΗ6· 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。 发酵周期72h，喷司他丁的产量达25mg/L。实施例18按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成小麦淀粉10. 0g/L,棉籽饼粉60. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/ h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达20mg/L。实施例19按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成小麦淀粉60. 0g/L,黄豆饼粉20. 0g/L,酵母浸粉5. 0g/L, NaCl 5. 0g/L。自动控制发酵温度30°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/ h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达20mg/L。实施例20按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖5g/L，细豆柏30g/L，酵母浸粉5g/L，NaC15g/L。自动控制发酵温度 30°C, pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。发酵周期 72h，喷司他丁的产量达5mg/L。实施例21按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40g/L，细豆柏5g/L，NaCl 5g/L。自动控制发酵温度30°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达5mg/L。实施例22按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40g/L，细豆柏5g/L，酵母浸粉5g/L，NaC15g/L。自动控制发酵温度 30°C, pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。发酵周期 72h，喷司他丁的产量达10mg/L。实施例23
按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40g/L，糊精60g/L，细豆柏30g/L，大豆蛋白60g/L，酵母浸粉5g/L， NaCl 5g/L。自动控制发酵温度30°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达35mg/L。实施例24按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40g/L，小麦淀粉40g/L，棉籽饼粉60g/L，大豆蛋白20g/L，酵母浸粉 5g/L,NaCl 5g/L。自动控制发酵温度30°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达30mg/L。实施例25按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40g/L，小麦淀粉40g/L，糊精60g/L，细豆柏35g/L，大豆蛋白60g/L， 酵母浸粉5g/L，NaCl 5g/L。自动控制发酵温度30°C，pH6. 5，溶氧为40%，通气量0. 5VVM， 24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达40mg/L。实施例沈按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40g/L，细豆柏30g/L，大豆蛋白20g/L，酵母浸粉10g/L，NaCl lg/L。自动控制发酵温度20°C，pH5. 0，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/ h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达45mg/L。实施例27按实施例中1制得的种子(ν/ν)接种量接种于发酵培养基中，进行发酵。发酵培养基组成葡萄糖40g/L，细豆柏30g/L，大豆蛋白20g/L，酵母浸粉lg/L，NaCl 10g/L。自动控制发酵温度40°C，pH8. 0，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/ h。发酵周期72h，喷司他丁的产量达35mg/L。对比实施例1取实施例1的抗生链霉菌(Sti^ptomyces antibioticus)NRRL3238，使用实施例 1的种子，按专利US3923785所述发酵培养方法，具体发酵培养基为2%葡萄糖、2%黄豆饼粉、0. 5% NaCUO. 25% CaCO3，消毒前用NaOH调PH至7. 5。发酵温度37°C，溶氧为40%，通气量0. 5VVM，24h开始流加葡萄糖1 10%。L/h。发酵周期120h，喷司他丁的产量为^iig/ L0
权利要求
1.一种用于抗生链霉菌(Sti^ptomyces antibioticus)发酵生产喷司他丁的发酵培养基，包括碳源和氮源，其特征在于，按培养基的总重量计，所述的碳源的含量是0. 5 14%，所述的氮源的含量是0. 5 10%，所述的碳源选自葡萄糖、糊精和小麦淀粉中的一种或多种，所述的氮源选自细豆粕粉、大豆蛋白、黄豆饼粉、酵母浸粉和棉子饼粉中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基中还含有矿物质， 矿物质的含量按培养基的总重量计是0. 1%。
3.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基还进一步的含有痕量生长因子。
4.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基还含有消泡剂。
5.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基按培养基的总重量计包含0. 5 14%碳源，所述的碳源选自葡萄糖、糊精和小麦淀粉中的一种或多种；0. 5 10%细豆粕粉、大豆蛋白、黄豆饼粉和/或棉子饼粉；0. 1 酵母浸粉；和0. 1 矿物盐。
6.一种喷司他丁的发酵生产方法，其特征在于，包括步骤(a)将抗生链霉菌(Sti^ptomycesantibioticus)的种子液接种于发酵培养基中进行液体发酵培养，所述的发酵培养基是权利要求1所述的发酵培养基；(b)从发酵液中分离出喷司他丁。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述的抗生链霉菌的种子液是将抗生链霉菌是按常规的方法将抗生链霉菌在种子培养基中培养而得到的。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述的抗生链霉菌是抗生链霉菌 NRRL3238。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述的发酵培养的温度是 20 40"C。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述的发酵培养的pH值是 5 8。
全文摘要
本发明提供了一种有利于抗生链霉菌高效发酵生产喷司他丁的发酵培养基以及相应的发酵方法。该发酵培养基包括碳源和氮源，其中按培养基的总重量计，所述的碳源的含量是0.5～14％，所述的氮源的含量是0.5～10％，所述的碳源选自葡萄糖、糊精和小麦淀粉中的一种或多种，所述的氮源选自细豆粕粉、大豆蛋白、黄豆饼粉、酵母浸粉和棉子饼粉中的一种或多种。本发明通过优选发酵培养基的碳氮源成分及配比，优化培养温度、pH等发酵参数，从而大大提高喷司他丁的产量。提供的喷司他丁的发酵生产方法，大幅提高了喷司他丁的发酵单位，适用于喷司他丁的规模化生产。
文档编号C12R1/48GK102234673SQ20101016462
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月29日 优先权日2010年4月29日
发明者杨鹏, 王岩, 陈少欣 申请人:上海医药工业研究院