专利名称：一种抑制Bcl2基因表达的表达盒及含有该表达盒的载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及ー种抑制Bcl2基因表达的表达盒及含有该表达盒的载体。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一。根据GL0B0CAN最新的数据，2008年，全球发现1270万癌症病例，760万例死亡；半数病例发生在中国。目前有大量医疗投入在恶性肿瘤的治疗上，主要的治疗模式为手术、放疗和化疗。但由于三大常规治疗模式的局限性，总体治疗效果和预后均仍不理想。肿瘤治疗第四种模式的肿瘤生物治疗正显示出越来越好的应用前景，其中基因治 疗是最基本也是最主要的治疗手段之一。但是目前针对恶性肿瘤而进行的基因治疗研究部分由于对肿瘤细胞杀伤效率偏低问题而无法进入临床，而低杀伤效率往往由于是肿瘤细胞对治疗用药物的耐受。因此，研究肿瘤细胞对目前肿瘤基因治疗药物耐受的分子机制，对研究开发新的肿瘤基因治疗药物具有十分重要的意义。正常细胞在各种致癌因素的作用下逐渐发生变化直至最后发生癌变，有许多基因表现出过度表达的现象，尤其是ー些促进细胞生长、侵袭等恶性表型基因的过量表达。大多数恶性肿瘤细胞中抵抗细胞凋亡因子之一的Bcl2水平显著升高。ー些研究表明，降低、阻遏Bcl2的表达，可以使肿瘤细胞发生凋亡，具有一定的抑瘤效果。例如，申请号为200610091396. O的中国发明专利公开了四组siRNA双链序列，它们可抑制bcl-2抗凋亡基因的表达，能有效地抑制Bcl-2蛋白表达和翻译，从而减少Bcl2蛋白合成，以求恢复细胞的正常凋亡调控能力，最终达到延缓肿瘤生长的目的，是很好的抗白血病和肿瘤细胞耐药性的小分子双链核酸药物。腺病毒是研究、应用得最为广泛的基因治疗药物载体，目前临床及临床试验的恶性肿瘤基因治疗约40%的方案均采用腺病毒载体。例如，申请号为201110050046. O的中国专利文献公开了ー种靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒Ad-TD-hIL12，该病毒已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC N0:V201031。该病毒载体为C亚类的5型腺病毒Ad5，经删除E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个基因，并利用E3gp-19K启动子控制表达人IL12的p35和p40亚基基因序列。该病毒通过感染肿瘤细胞在肿瘤细胞中复制溶解肿瘤细胞同时，能在肿瘤组织中产生高水平具有多种抗肿瘤作用的hIL12。hIL12具有抗肿瘤血管形成作用，能调节人体免疫能力，使机体产生抗肿瘤特异免疫能力，杀死远处转移肿瘤细胞并可防止肿瘤复发，可作为ー种靶向性基因工程药物治疗各种实体瘤，不但可用于肿瘤内注射，还可用于腹腔、胸腔内注射，均不会引起明显副作用，具有较好的疗效和安全性。
发明内容
本发明提供了一种抑制Bcl2基因表达的表达盒及含有该表达盒的载体，该表达盒的产物能够有效抑制Bcl2基因的表达，却能够减缓肿瘤细胞的凋亡，在肿瘤细胞对药物的耐受机制研究及肿瘤细胞基因治疗药物的研究中具有重要意义。ー种抑制Be 12基因表达的表达盒，所述表达盒包括依次连接的癌胚抗原CEA启动子、至少ー个人工microRNA编码序列和终止子，所述人工microRNA编码序列的碱基序列如SEQ ID NO 5 所示。所述CEA是ー种癌胚抗原，是人类胚胎发育阶段细胞合成的正常成分，出生后逐渐消失，或仅存留极微量，当正常细胞转化为肿瘤细胞时，这类抗原可以重新合成出来。CEA在包括肺癌、肠癌、胃癌、乳癌等常见肿瘤在内的多种肿瘤中均有表达，其启动子被用于靶向性基因治疗研究。但由于其启动效率较低，当将其置于人巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)转录增强子后时，可以明显提高CEA启动子的效率，但同时丢失了其细胞特异性，因此，包含CMV增强子的重组CEA启动子可以作为一种广谱的启动人细胞中基因转录的调控元件。 因此，作为优选，所述表达盒还包括位于所述癌胚抗原CEA启动子前的人巨细胞
病毒增强子。所述人工microRNA编码序列为人工设计合成，其合成方法为针对人Bcl2基因的mRNA序列(GenBank登录号匪000633. I)利用网上软件分析该mRNA序列上合适的位点，确定人工microRNA的作用祀点,设计合成引物两对引物序列正向引物I : 5 ’ -TGCTGTTGACAGTGAGCGCGCCTTGAAACATTGATGGAATTAGTGAAGCCACAGATGTA-3’ (SEQ ID NO 1),反向引物I :5 ’ -TCCGAGGCAGTAGGCAAGCCTTGAAACATTGATGGAATTACATCTGTGGCTTCACTAAT-3’ (SEQ ID NO 2)；正向引物2 :5，-AGATCTGATCCAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG-3，(SEQ ID NO 3)；反向引物2:5’-GGATCCATCGTAGCCCTTGAAG TCCGAGGCAGTAGGCA-3’ (SEQ ID NO :4)。先分别将正向引物I和反向引物I进行重叠延伸PCR，得到97bp的扩增产物；再以扩增产物为模板，用正向引物2和反向引物2进行PCR扩增，得到142bp的扩增产物；142bp的扩增产物以T-A克隆的方式克隆至pMD19-T载体，经DNA测序验证其正确性，正确的序列即为针对人Bcl2基因的人工microRNA编码序列。为了加强其作用效果，优选地，所述表达盒中包含有5 10个串联的人工microRNA编码序列。更优选地，所述表达盒中包含有10个串联的人工HiiCT0RNA编码序列。所述10个串联的人工microRNA编码序列的制备方法为人工microRNA编码序列用限制性内切酶BamH I和BglII双酶切后回收，重新插入同一载体的BamHI位点，经过多次插入克隆最终获得含有10个人工microRNA编码序列串联连接的编码序列，该10个串联的人工microRNA编码序列，即为本发明中优选的目的基因。所述终止子为牛生长激素基因多聚腺苷酸信号区。最优选地，所述表达盒依次由CMV转录增强子、癌胚抗原CEA启动子、10个串联的人工microRNA编码序列和牛生长激素基因多聚腺苷酸信号区(BGHpA)组成，命名为表达盒p-miRB，其碱基序列如SEQ ID NO 6所示。
如SEQ ID NO :6所示的碱基序列中，其中第7位至第537位为CMV转录增强子；第544位至第912位为CEA转录启动子；第919位至第2408位为10个串联连接的靶向人Bcl2基因的人工microRNA编码序列；第2415位至第2757位为牛生长激素基因多聚腺苷酸信号区BGHpA，BGHpA为基因表达提供转录终止信号。本发明还提供了 ー种含有所述表达盒的重组质粒。优选地，所述重组质粒的原始质粒为pDC312。所述重组质粒具有如附图I所示的结构。所述重组质粒的制备方法为将已经构建的包含CMV增强子、CEA启动子和10个串联的人工miCt0RNA编码序列的序列插入已经构建包含BGHpA的腺病毒穿梭质粒(pDC312,Microbix公司，美国)pDC312_BGHpA的BamH I位点，得到带有完整表达盒p-miRB的腺病毒穿梭质粒，酶切鉴定结果与预期完全相符，即为所述重组质粒。
本发明还提供了ー种含有所述表达盒的腺病毒载体。将上述带有完整表达盒p-miRB的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox (delta) El，3cre (Microbix公司，美国)共转染腺病毒包装细胞293细胞，得到带有表达盒p-miRB的腺病毒载体。本发明采用RNA干扰中最新的人工microRNA技术，以在绝大多数恶性肿瘤细胞中高表达的抵抗凋亡的Bcl2为靶点，设计并克隆靶向Bcl2的人工microRNA的编码序列，在ー些恶性肿瘤细胞内表达后有效抑制这个基因的表达，却没有诱导这些肿瘤细胞凋亡，相反，与空腺病毒载体相比，表达靶向Bcl2的人工microRNA的腺病毒载体却能降低凋亡，表明这些肿瘤细胞对可表达靶向Bcl2的人工microRNA的腺病毒载体具有耐受性，为研究肿瘤细胞对腺病毒基因治疗药物的耐受性的分子基础提供有效的工具，在新的基因治疗药物的开发中具有重要作用。本发明的有益效果利用本发明提供的表达盒及载体可以为人们从ー个完全不同的新角度对肿瘤细胞耐受基因治疗的药物的分子机制展开研究提供一个新颖的工具，其特点在于以在多种肿瘤细胞均表达的CEA与高效的CMV转录增强子重组后调控外源性基因在肿瘤细胞中的表达、以人工microRNA抑制肿瘤细胞过表达的抗凋亡基因Bcl2，在有效抑制Bcl2表达之后却出于常规地降低肿瘤细胞的凋亡，为研究肿瘤细胞的生长特性提供新线索，在基因治疗药物的研究中具有重要意义。
图I为经克隆带有表达盒p-miRB的腺病毒穿梭质粒图谱；图2为Western blot法检测表达盒p-miRB对Bcl2表达抑制的比较图；(其中，I :无病毒感染的Bcl2基因表达；2 :带GFP的对照腺病毒以MOI 100感染癌细胞96小时后Bcl2基因表达；3 :带p-miRB的腺病毒以MOI 100感染癌细胞96小时后Bcl2基因表达)图3为MTT法检测表达盒p-miRB对肺癌细胞生长的作用结果；图4为MTT法检测表达盒p-miRB对肠癌细胞生长的作用结果；图5为MTT法检测表达盒p-miRB对宫颈癌细胞生长的作用結果。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进ー步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，而本发明并不局限于以下实施例。实施例I(I)针对人抗凋亡的Bcl2基因的目的基因的克隆。从GenBank检索得到人Bcl2基因的mRNA序列(GenBank登录号NM 000633. I)，利用 Ambion 公司的在线设计软件(http://www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder.html)分析该mRNA序列上合适的位点,确定人工microRNA的作用祀点，设计合成引物对ー和引物对ニ。引物对一正向引物I :5 ’ -TGCTGTTGACAGTGAGCGCGCCTTGAAACATTGATGGAATTAGTGAAGCCACAGATGTA-3’ (SEQ ID NO 1),反向引物I : 5 ’ -TCCGAGGCAGTAGGCAAGCCTTGAAACATTGATGGAATTACATCTGTGGCTTCACTAAT-3’ (SEQ ID NO 2)；引物对ニ正向引物2 :5，-AGATCTGATCCAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG-3’ (SEQ ID NO 3)；反向引物2:5’-GGATCCATCGTAGCCCTTGAAG TCCGAGGCAGTAGGCA-3’ (SEQ ID NO :4)。先分别将正向引物I和反向引物I进行重叠延伸PCR，反应体系如下
5 X Green GoTaq buffer10 L
25mM dNTPs0.64L
正向引物I1.5L
反向引物I1.5L
GoTaq 聚合酶0.25L
ddH2036.11 LPCR的扩增条件为94°C变性2min后进入循环过程，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共25个循环后72°C延伸5min，得到97bp的扩增产物。 将上述PCR产物进行2 %琼脂糖凝胶电泳，切取97bp的目的条带，用DNA回收试剂 盒回收。再以扩增产物为模板，用正向引物2和反向引物2进行PCR扩增，反应体系为5 X Green GoTaq buffer10 L
25mM dNTPs0.64 L
正向引物21.5 L
反向引物21.5 L
97bp切胶回收产物2 L
GoTaq 聚合酶0.25 L
ddH2034.11 LPCR的扩增条件为95°C变性2min后进入循环过程，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共25个循环后72°C延伸5min，得到142bp的扩增产物。PCR产物进行2 %琼脂糖凝胶电泳后，将切胶回收得到142bp的扩增产物以T-A克隆的方式克隆至PMD19-T载体，经DNA测序验证其正确性。正确的序列即为针对人Bcl2基因的人工microRNA编码序列。为了加强其作用效果，人工microRNA编码序列用限制性内切酶BamHI和BglII双酶切后回收，重新插入pMD19_T载体的BamH I位点，经过多次插入克隆最终获得各有10个人工microRNA编码序列串联连接的序列，即为目的基因。(2)表达盒p-miRB的构建及含有该表达盒p_miRB的腺病毒载体的制备。通过常规PCR法扩增pcDNA3. 1(+)质粒上第241-771位区域的543bp (包含两端的BglII和BamHI位点)CMV早期转录增强子和381bp (包含两端的BglII和BamHI位点)的人CEA启动子片段(Genbank登录号NT_011109. 15所列序列中第14480462-14480830位)得到CMV增强子重组CEA启动子。具体步骤如下设计合成引物对三和引物对四引物对三正向引物3 :5’-(BglII)AGATCTGACATTGATTATTGACTAGT-3，(SEQ ID NO :7)，反向引物3 :5’-(BamHI)GGATCCATGGGGCGGAGTTGTTACGA-3，(SEQ ID NO :8)；反应体系如下
5 X Green GoTaq buffer10 L
25mM dNTPs0.64 L
100ngpcDNA3.1(+)^^(0.2 L
正向引物31.5 L
反向引物31.5 L
GoTaq 聚合酶0.25 L
ddH2033.91 LPCR的扩增条件为95°C变性5min后进入循环过程，95°C变性30s，45°C退火45s，72°C延伸45s，共30个循环后72°C延伸lOmin，得到543bp的扩增产物CMV早期转录增强子。引物对四正向引物4:5’-AGATCTCCCGGGACCCTGCTGGGTTTC-3’ (SEQ ID NO 9),
反向引物4 :5’-GGATCCAGCTTGAGTTCCAGGAACG-3’ (SEQ ID NO :10)；反应体系如下
5X Green GoTaq buffer10 L
25mM dNTPs0.64L
I g人肠癌細胞SW620基因组DNAI L
正向引物41.5L
反向引物4.5L
GoTaq 聚合酶0.25L
CldH2O33.11 L PCR的扩增条件为95°C变性5min后进入循环过程，95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共30个循环后72°C延伸IOmin，得到38Ibp的扩增产物CEA启动子。将上述PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，切取543bp和38Ibp的目的扩增产物，用DNA回收试剂盒回收。将切胶回收得到543bp的CMV早期转录增强子和381bp CEA启动子以T-A克隆的方式克隆至pMD19-T载体，分别得到pMD19-T/CMV早期转录增强子和PMD19-T/CEA启动子，经DNA测序验证其正确性。pMD19_T/CMV早期转录增强子载体上的543bp的CMV早期转录增强子用限制性内切酶BamH I和BglII双酶切后回收，重新插入PMD19-T/CEA启动子载体的BamH I位点，获得CMV增强子重组CEA启动子。将CMV增强子重组CEA启动子和10个串联连接的靶向人工microRNA编码序列分别插入已经构建包含BGHpA的腺病毒穿梭质粒(pDC312，Microbix公司，美国)pDC312-BGHpA的BamH I位点，得到带有完整表达盒p_miRB的腺病毒穿梭质粒，其结构如图I所示，酶切鉴定结果与预期完全相符。将上述带有完整表达盒p-miRB的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox (delta) El，3cre (Microbix公司，美国)共转染腺病毒包装细胞293细胞，得到带有表达盒p-miRB的腺病毒载体，即完成了带有基因表达盒p-miRB的载体的制备。实施例2带基因表达盒p-miRB的腺病毒对肿瘤细胞Bcl2基因表达的抑制取对数生长期的人肺癌细胞A549、肠癌细胞LoVo和宫颈癌细胞Hela，分别按2X 105、4X IO5和2X IO5细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养16-18小时使其贴壁并达到50-60%的汇合度。用含低血清的培养液稀释带有基因表达盒p-miRB的腺病毒，以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为 100 pfu/cell 感染细胞，96hr 后中止作用，提取细胞总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(10%分离胶，5%浓缩胶)，然后将蛋白转至PVDF 膜，封闭后与 I : 100 稀释的抗 Bcl2 的抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.,美国，sc-509)于4°C结合过夜，用TBST洗膜3次，再与I : 5000稀释HRP标记的ニ抗(杭州联科生物技术有限公司)结合，室温2小时后，用TBST洗膜3次，然后用化学发光试剂盒(Millipore公司，美国)显影，在化学发光凝胶成像仪上拍照、分析。用带绿突光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的腺病毒以感染复数100感染和无腺病毒感染的细胞作对照。结果如图2所示，感染带有表达盒p-miRB的腺病毒的肺癌细胞A549、肠癌细胞LoVo及宫颈癌细胞Hela中的Bcl2表达明显受到抑制。图中I为无病毒感染的Bcl2基因表达情况；2为带GFP的腺病毒以MOI 100感染肺癌、肠癌、宫颈癌细胞96小时后Bcl2基因表达情况；3为带p-miRB的腺病毒以MOI 100感染肺癌、肠癌、宫颈癌细胞96小时后Bcl2基因表达情況。实施例3带基因表达盒p-miRB的腺病毒对肿瘤细胞体外生长抑制试验(MTT法)取对数生长期的肺癌细胞A549、肠癌细胞LoVo和宫颈癌细胞Hela，按IX IO4细胞/孔的密度接种于24孔板中，同时将带GFP和p-miRB的腺病毒以MOI为100 pfu/cell分别感染细胞。分别在病毒感染24、48、72和96小时后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 50ul,37°C继续培养4hr，中止培养。弃去培养上清液，每孔加入DMSO 250ul，振荡lOmin，使结晶物充分溶解，取IOOul在酶联免疫检测仪上测定各样品570nm波长OD值。每组设立4复孔。结果如图3 5所示，基因表达盒p-miRB对肺癌细胞A549、肠癌细胞LoVo和宫颈癌细胞Hela的生长均有不同程度的促进作用。 细胞存活率=(病毒作用组OD值/病毒未作用组OD值)X 100%。
权利要求
1.一种抑制Bcl2基因表达的表达盒，其特征在于，所述表达盒包括依次连接的癌胚抗原CEA启动子、至少一个人工microRNA编码序列和终止子，所述人工microRNA编码序列的碱基序列如SEQ ID NO 5所示。
2.根据权利要求I所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒还包括位于所述癌胚抗原CEA启动子前的人巨细胞病毒增强子。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含有5 10个串联的人工microRNA编码序列。
4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含有10个串联的人工microRNA编码序列。
5.根据权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述终止子为牛生长激素基因多聚腺苷酸信号区。
6.根据权利要求5所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒的碱基序列如SEQID NO6所示。
7.一种含有如权利要求I 6任一权利要求所述表达盒的重组质粒。
8.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的原始质粒为pDC312。
9.一种含有如权利要求I 6任一权利要求所述表达盒的腺病毒载体。
全文摘要
本发明公开了一种抑制Bcl2基因表达的表达盒及含有该表达盒的载体，所述表达盒具有如SEQ ID NO6所示的核苷酸序列，包括依次连接的癌胚抗原CEA启动子、至少一个人工microRNA编码序列和终止子，所述人工microRNA编码序列的碱基序列如SEQ ID NO5所示。本发明中所述表达盒依次该表达盒的产物能够有效抑制Bcl2基因的表达，但却能够减缓肿瘤细胞的凋亡，在肿瘤细胞对药物的耐受机制研究及肿瘤细胞基因治疗药物的研究中具有重要意义。
文档编号C12N15/113GK102703451SQ201210211518
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者曹江, 贾振宇, 陈琼姜 申请人:浙江省医学科学院