专利名称：一种快速、准确的检测杂交水稻种子纯度的方法
技术领域：
本发明属于遗传学领域，公开了一种快速、准确的检测杂交水稻种子纯度的方法。
背景技术：
种子纯度是农业生产中最重要的问题之一，它关系到国家粮食安全，是种子产业化开发中最重要、最核心的内容，因而也关系种子企业生死存亡。大部分农作物种子纯度要求都在95%以上，甚至为99. 9% (表1)，因而，需要大量统计抽样才能获得准确数据，工作量十分巨大。例如合格的杂交稻品种纯度要求达到96%，则意味着100个植株最多只允许4个杂株，那么要使检测结果可靠，至少应该检测500粒种子，工作量是巨大的。另外，由于技术缺陷，各种种子纯度检测方法还存在受环境影响、速度慢、费用高等问题，影响到了鉴定的准确性、种子及时上市、成本等重要问题。表I农作物种子纯度标准(GB4404. 1-2008)
^原种(％)大田用种# m大刚手中
大(%)_竹大_(%)(%>
常规种99 9 9θ7θ常规种99~09δΓθ~
不育系油菜亲本99.098.0
水辆保持系49 H 99.9杂交种85.0
恢复系常规种99.095.0
杂交种96.0亲木-毛籽99.097.0
常规种 99.9 97.0 職、薄■99.0
膜包衣)
自交种 99.9 99.0杂交种95.0
96.0 小麦常规种99.999.0
双父种
__三交Ι41___95. O 大麦常规种__99. 9W O种子纯度检测经历了从田间表型鉴定到实验室分子标记鉴定的发展。田W表型鉴定的操作过程是这样的从生产的种子中随机抽取一定数量的种子，田间种植并观察性状，通过与品种的真实性状比较，鉴定出杂株。例如，由100个植株构成的鉴定群体中，发现2株株高和3株颜色明显不同于该品种真实性状的植株，则该品种的纯度为(2+3)/100=95%。田间鉴定的缺陷是明显的一是需要种植一个季节，周期长、占地多、费用高，而种子从生产到销售的时间只有2-3个月时间，田间鉴定周期严重影响了种子销售上市。二是植株性状常受环境影响，如在高肥力条件下，植株更高大，从而误判为杂株，使鉴定结果不准确。分子标记鉴定种子纯度在很大程度上克服了以上问题，其理论依据可以简单描述为利用杂株与品种间特定分子的不同，鉴定杂株，计算种子纯度。依据分子标记的类型不同，可分为蛋白质(如同工酶等)和DNA分子标记鉴定。蛋白质分子标记鉴定也有明显的缺陷，一是蛋白表达同样受环境影响，使鉴定结果不准确；二是可用于鉴定的蛋白分子标记不多，使这种技术难以用于区分亲缘关系较近的品种。DNA分子标记是根据杂株与正常品种在DNA水平上的序列差异进行鉴定的，该技术在很大程度上克服了以上几种鉴定方法的不足。首先，DNA序列差异不再依赖于环境，因此，鉴定结果是准确的；第二，从理论上讲，任何杂株与正常品种DNA都存在差异，因此，可用于鉴定任意品种；第三，由于种子、幼苗、成株期的DNA都是一样的，因此，鉴定不再需要田间种子，只需要室内简单发芽提取DNA即可，缩短了检测周期，为种子推广赢得了时间。然而，企业可能需要检测多个生产地点或生产者的种子是否合格，检测工作量巨大，即使是利用DNA分子标记检测，常常也会由于工作量大而无法及时完成检测，同时，巨大的工作量也伴随着检测成本过高的问题。例如，国家法律规定，杂交水稻种子的纯度不得低于96%，因此，若要求在95%的概率保证下，种子纯度误差不超过1%，则每个样本需要抽检3000粒种子才能达到要求，若检测100个样本，则需要提取DNA、PCR、电泳分别为3000*100=30万次。在检测人员和设备有限的情况下，几乎是不可能在在种子包装与销售前完成检测工作，严重影响上市。在此情况下，只能减少抽样量，以达到减少工作量的目的。例如，一般企业抽检100粒种子，在此情况下，若依旧要求纯度误差不过1%，那么对结果的把握度(概率保证)仅为15%左右。所以，即使得到了检测结果，并没有把握判断该批次的种子是否合格，给市场销售带来巨大风险
发明内容
本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种能够准确、快速检测杂交种子纯度的方法。为了实现上述目的本发明采取的技术方案是一种快速、准确的检测杂交水稻种子纯度的方法，包括以下步骤根据种子纯度要求，计算抽样样本量；等量抽样并混合提取DNA或分别提取DNA后再等量混合；按检测位点的碱基序列，设计PCR引物扩增检测位点；回收并纯化PCR扩增产物；利用扩增产物建库并进行高通量测序；根据检测位点序列比例，计算种子纯度。本发明提供更优选的技术方案是一种快速、准确的检测杂交水稻种子纯度的方法，包括以下步骤(I)计算最小抽样样本量根据商品种子纯度要求、设定的概率保障和允许的误差，确定最小的样本抽样量；(2) DNA提取对每一植株，选取相同部位的等量材料混合后提取DNA ;或者，提取每一植株的DNA，再对DNA进行定量抽取后再等量混合；(3)扩增并回收检测位点按检测位点的碱基序列，设计引物，对检测位点进行PCR扩增，扩增产物应包含等位位点的差异序列，对PCR产物进行回收纯化；(4)建库与高通量测测序按高通量测序流程分别构建亲本基因DNA文库，ePCR并高通量测序；(5)种子纯度的确定根据测序的结果，获得父本与母本序列的片段数，由此推算种子纯度。本发明实施例的有益效果是(I)减少了工作量，加快了检测速度。采用分子标记检测，若I个样本抽样3000个植株，则DNA提取、PCR扩增与电泳检测都需要做3000次，因此工作量大，速度慢，常常无法在种子收获到包装上市短短两三个月内完成。采用本方案，不论每一样本抽样多少植株，均将这些植株等量混合成I个样品，DNA提取、建库和测序时都只做I次，工作量大为减少，同时速度大为加快，很好地满足了种子及时上市销售的要求。(2)提高了准确率。如上所述，分子标记检测由于工作量大，常常只能减少每一样本中抽样的植株数，达到加快进度的目的，这就导致了检测结果不准确的情况。采用本方案，现有高通量测序通量都在100G以上，即使检测的基因序列长达1K，也可检测到超过I亿条序列，每2条序列可代表I个植株，则可检测超过5000万个植株。如此大的样本容量，我们几乎可以在每一样本中抽取任意多的植株进行检测，很好地保证了检测结果的准确性。(3)保持了 DNA检测的优势。本技术方案应归于DNA分子标记检测范畴。因此，与田间检测和蛋白质分子标记检测比较，他们具有不受环境影响，不受季节限制，不占用土地等优势。本发明的突出特点是很好地满足了商品杂交种子纯度检测中对检测速度与准确性的要求。
图I是本发明实施例提供的杂交水稻品种“科优73”种子纯度检测示意图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。实施例I杂交水稻品种“科优73”种子纯度检测方法(参见图I)(I) “科优73”杂交种子抽样
“科优73”是一种选育的杂交水稻新品种，并申请了新品种保护，其父本为R7723，母本为金科1A。对127份批次的“科优73”种子纯度抽样分析。利用DPS(Data ProcessingSystem:数据处理系统。)2000软件中的“二项分布总体均数置信区间”功能，计算出抽样样本需要达到3000个样本才能满足检测的误差不超过1%的要求。因此利用种子抽样器，按随机取样的原则，从每一批次的种子中，大约抽取4500粒种子。(2)种子发芽、样品混合与DNA提取将5层报纸铺于40cmX 80cm的瓷盘中，加少量水分至报纸完全湿润但不露明水为止。将4500粒种子均匀撒播于瓷盘中，用另一瓷盘将其盖住以保持水分。于室内(温度约30°C左右)自然发芽，期间检查并适当补充水份。种子发芽生长至第7-10天时，已有I片叶片长出，此时选取3000个小苗，每棵小苗取I片叶片，将叶片叠放整齐，统一切取大致相等的量混合。按植物基因组DNA提取试剂盒(DP305，天更，北京)操作手册分离纯化基因组DNA,利用ND2000超微量分光光度计测定样品浓度与纯度。共获得127份混合DNA样品，分别代表了 127个抽样样本。(3) PCR扩增与回收父本R7723与母本金科IA在株高基因HD不同，父本为高杆，含有该基因的显性基因，其序列为序列表中的SEQ ID NO. 1，而母本为矮杆，含有该基因的隐性基因，其序列为序列表中的SEQ ID NO. 2。其中，显性与隐性位点为单碱基突变，即在第203个碱基位点，R7723中为T，而金科IA中为G。利用Primer5软件设计引物扩增HD基因在R7723与金科IA之间的差异位点，引物设计时采用软件的默认参数进行。其中，Sense Primer (正向引物)为序列表中的SEQ ID NO. 3ο Antisense Primer(反向引物)为序列表中的SEQ ID NO. 4，获得的PCR产物为272bp，为序列表中的SEQ ID NO. 5 (与R7723完全匹配)和SEQ ID NO. 6 (与金科 IA 完全匹配)。PCR 扩增体系按试剂盒 DreamTaq Green PCR Master Mix(2X) (K1081,Fermentas)推荐比例配比，即PCR混合物501、模板15ng、引物21(浓度0. 5M/1)，加去离子水 至总体积为1001。扩增程序如下94°C预变性4分钟；94°C，I分钟，54°C，I分钟，72°C，2分钟，循环20次；72°C延伸8分钟。扩增产物用3%的琼脂糖凝胶检测并用PCR产物按琼脂糖凝胶回收试剂盒(K0691，Fermentas)操作手册回收并纯化目的DNA片段。(4)建库与高通量测序由于PCR产物不足400bp长度，因此，对获得的127份DNA扩增产物按SOLiD 5500高通量测序操作手册中的扩增子串联法进行建库。建库过程中，采用BarCoding(条形码)对样品进行区分，共采用64个条形码。测序时共占用2个测序通道，获得数据22. 7G，平均每个样本获得数据O. 18G，127个样本的变异幅度为O. 15G-0. 21G。加上接头等序列，每500bp可代表I个检测片断，则平均每个样本被检测到了 37. 48万次，127个样本的变异幅度为31. 45万次-44. 04万次。如此大的检测频率保证了检测结果的准确性。(5)种子纯度的计算按完全匹配的原则，将R7723中与金科IA中的差异序列与测序结果进行比较，在每一个样本中分别获得与R7723和金科IA完全匹配的片段数量。按种子纯度=2x/(x+y) X 100% (x与y分别代表R7723与金科IA检测到的片段数量)计算每一样本的种子纯度。按上述公式计算，这127个品种的平均纯度为98. 67%，变异幅度为94. 72%_99. 98%。共有4个样本的纯度低于96%，为不合格种子，应转为商品粮食销售，其余123个样本纯度均大于96%，可以进入正常的种子销售环节。实施例2本实施例的检测方法与实施例I基本相同，所不同的是步骤(2)中DNA提取的步骤是种子发芽生长至第7-10天时，已有I片叶片长出，此时选取3000个小苗，每棵小苗取I片叶片，按植物基因组DNA提取试剂盒(DP305，天更，北京)操作手册分离纯化基因组DNA，提取每一叶片的DNA，再对DNA进行定量抽取后再等量混合；利用ND2000超微量分光光度计测定样品浓度与纯度。共获得127份混合DNA样品，分别代表了 127个抽样样本。以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式
的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种快速、准确的检测杂交水稻种子纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤根据种子纯度要求，计算抽样样本量；等量抽样并混合提取DNA或分别提取DNA后再等量混合；按检测位点的碱基序列，设计PCR引物扩增检测位点；回收并纯化PCR扩增产物；利用扩增产物建库并进行高通量测序；根据检测位点序列比例,计算种子纯度。
2.根据权利要求I所述的快速、准确的检测杂交水稻种子纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤 (O计算最小抽样样本量根据商品种子纯度要求、设定的概率保障和允许的误差，确定最小的样本抽样量； (2)DNA提取对每一植株，选取相同部位的等量材料混合后提取DNA ;或者，提取每一植株的DNA，再对DNA进行定量抽取后再等量混合； (3 )扩增并回收检测位点按检测位点的碱基序列，设计引物，对检测位点进行PCR扩增，扩增产物应包含等位位点的差异序列，对PCR产物进行回收纯化； (4)建库与高通量测测序按高通量测序流程分别构建亲本基因DNA文库，ePCR并高通量测序； (5)种子纯度的确定根据测序的结果，获得父本与母本序列的片段数，由此推算种子纯度。
全文摘要
本发明公开了一种快速、准确的检测杂交水稻种子纯度的方法，包括以下步骤根据种子纯度要求，计算抽样样本量。等量抽样并混合提取DNA或分别提取DNA后再等量混合。按检测位点的碱基序列，设计PCR引物扩增检测位点。回收并纯化PCR扩增产物。利用扩增产物建库并进行高通量测序。根据检测位点序列比例，计算种子纯度。本发明的突出特点是很好地满足了商品杂交种子纯度检测中对检测速度与准确性的要求。
文档编号C12Q1/68GK102912010SQ20121021081
公开日2013年2月6日 申请日期2012年6月25日 优先权日2012年6月25日
发明者彭海, 张静, 周俊飞 申请人:海南广陵高科实业有限公司, 江汉大学