多肽和其编码多核苷酸及它们在治疗缺血相关医学病症中的应用的制作方法

专利名称：多肽和其编码多核苷酸及它们在治疗缺血相关医学病症中的应用的制作方法
多狀和其编码多杨音酸及它们在治疗缺血相关医学病症中的应用本申请为分案申请，原申请的申请日为2007年7月31日，申请号为200780035863. 0 (PCT/IL2007/000959)，发明名称为“多肽和其编码多核苷酸及它们在治疗
缺血相关医学病症中的应用”。发明领域及背景本发明涉及多肽和其编码多核苷酸及它们在治疗缺血相关医学病症中的应用。血管生成是从之前存在血管上芽生新的血管。它可在多种生理条件下发生，例如女性生殖周期，以及包括肿瘤、组织缺血和伤口愈合的病理学条件。 缺血性心脏病是很多工业化国家中死亡率的主要原因，仅在美国每年引起超过500000例的死亡。当前的治疗选择包括药物治疗、冠状动脉血管成形术以及更具侵入性的冠状动脉搭桥术(CABG)。但是，在所有这些案例中，技术性问题包括所涉及动脉的大小、缺少恰当的末梢脉管系统、导致阻塞的动脉损伤的复杂性以及患者的一般临床病症经常阻止缺血组织的血管再形成。近来研发出一种侵入性较小的方法一治疗性血管生成。该术语指弓IA旨在促进缺血组织新血管形成的促血管新生因子，从而减轻缺血。已有两个主要方法用于治疗性血管生成领域；第一个是以裸露DNA形式或用病毒载体传递多种细胞因子的血管生成基因疗法，最常用的是血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。另一最新方法是用完全分化的细胞、内皮祖细胞或间充质干细胞的细胞治疗。两种方法均在动物模型和初期临床试验中显示成功。但是，在治疗性血管生成成为缺血病患者的真正临床选择之前仍然存在很多障碍需要克服。对于血管生成基因疗法，这些障碍包括转基因表达的组织特异性需求、传递载体的选择、剂量和时间的优化、给药途径的优化以及不良事件例如水肿和发生肿瘤的可能性。血管生成基因疗法成功的另一个限制是新形成血管不够成熟以及它们之后的退化，从而阻止显著而持久的治疗效果。这有可能是因为所递送的血管生成基因仅在相对较短的时间段内表达使得无法发生血管成熟和平滑肌细胞募集，或者因为血管成熟需要多种血管生成因子才能发生。可能的解决办法是使用能同时激活多种血管生成因子的上游血管生成调节剂，从而与生理学血管生成更加相似。这一因子是低氧诱导因子I (HIF-I)。低氧诱导因子(HIF-I)是一种转录因子，是缺氧响应的主要调节剂，在低氧状态下可活化多于40个基因。它是由两个亚单位组成的杂二聚体转录因子；亚单位a受到氧水平的严密调节并在低氧时被诱导，而亚单位3不论氧张力如何可组成型表达。HIF-I a包含两个转活结构域(N-TAD和C-TAD)和一个氧-依赖型降解结构域(ODDD)。在常氧条件下蛋白质von-Hippel-Lindau (VHL)与HIF-1 a的ODDD相互作用并作为E3-泛素连接酶复合物的一部分，因此将HIF-I a送至蛋白体降解。在低氧下，HIF-I a与HIF-I P 二聚体化并活化其核内目标基因的转录。
最近已显示VHL与HIF-I a的相互作用由HIF_1 a蛋白内的两个特异残基的脯氨酸轻基化作用促成(Epstein, A. C.等,2001, Cell 107,43-54. Masson, N 等,2001, Embo J20,5197-206)。已发现有三种脯氨酰羟基化酶(PHD 1-3)可在常氧下羟基化HIF-I a。PHD I和2在残基402和564处羟基化而PHD 3仅在残基564处羟基化。HIF-Ia 的第二种调控机制发现于 2002 年(Lando，D 等，2002，Science 295，858-61)并包括残基803处HIF-I a的天冬酰胺酰羟基化作用，由天冬酰胺酰羟化酶催化，也称作因子抑制HIF-I (FIH-I)。这一羟基化作用阻止HIF-I a与辅因子p300的相互作用，因此妨碍了 HIF-I a的转录活性。因此，在常氧下有两种机制与HIF-I a活性的降低有关，一种通过脯氨酰基羟基 化作用影响其稳定性，另一种通过天冬酰胺酰基羟基化作用影响其转录活化。这些脯氨酰基和天冬酰胺酰基羟化酶均为双加氧酶，它们为2-酮戊二酸并且不依赖铁离子，它们对细胞氧的需求可提供它们作为氧传感器活性的基础。已验证残基402和564处两个特异位点的突变可破坏HIF_1 a和VHL之间的相互作用，因此使得HIF-I a组成型稳定(Masson等，2001，Embo J 20，5197-206)。所得突变体HIF-Ia与驱动HRE-荧光素酶构建体表达中的低氧处理具有相同的活性。残基564和803的两处突变显示可给予HIF-I a完整的转录活性，与经低氧模拟铁螯合剂2，2'-联吡啶处理所得活性相似(Lando 等，2002，Science 295，858-61)。在角蛋白14启动子的调控下过表达缺失残基401-602的突变体hHIF_l a的转基因小鼠显示出皮肤血管化作用增强(Elson, D. A.等，2001，Genes Dev 15，2520-32)。这些小鼠显示出Glut-I和VEGF的mRNA上调，它们是HIF-I a的已知靶点。与VEGF过表达小鼠比较，这些小鼠血管的易漏性低并且显示出更大的成熟度。这可由HIF-I a诱导多个血管生成因子(即促红细胞生成素)的活化这一事实解释，与生理性血管生成反应相似，与单独VEGF的作用相反。此外，HIF-I a诱导VEGF许多异构形式和其它基因的活化，又一次与生理反应更相似，这通过给予单一的异构形式无法完成。2000年第一次在血管生成基因疗法中检测了 HIF-Ia的组成型活性形式(Vincent, K. A.等，2000，Circulation 102，2255-61)。它包含 DNA 结合结构域和 HIF-1 a的二聚体化结构域，其在CMV启动子的调控下与单纯疱疹病毒(HSV)的转活结构域VP16相连。所得突变体可体内诱导HIF目标基因。当以裸露DNA局部给予时，它可在小鼠后肢缺血模型中引起毛细血管密度和血液灌注增加。当頂注射大鼠MI模型时相同的构建体时也显示出治疗作用(Shyu, K. G.等，2002，Cardiovasc Res 54,576-83).在CMV启动子调控下表达缺失残基401-602的组成型活性突变体HIF-I a的腺病毒也可诱导视网膜非缺血组织中的血管生成(Kelly，B.D.等，2003 Circ Res 93，1074-81)。上述两种构建体具有HIF-I a分子的大片段缺失，并缺少天然HIF_1 a转活结构域(N-TAD和C-TAD)之一或二者，其可引起活化潜能和HIF-I a特异性降低。此外，这些构建体在CMV(通用和非特异性启动子)调控下表达HIF-I a，由于非特异性表达和潜在的副作用，限制了它的应用。已使用多种给药途径向缺血区域给予治疗基因，包括外周缺血下的血管内和肌肉内给药和心肌缺血下的心肌内、心包内和冠状动脉内给药。静脉内途径带来的优点包括易于进入而不需侵入性操作，技术安全性和低成本以及适用于大患者群。然而，尽管有这些明显的临床优点，这一给药途径并不常用，这是由于该载体的全身分布导致目标器官中转基因表达低以及在非目标器官中的不必要表达引起全身副作用，这限制了可给予的剂量。这一限制又接着限制了治疗的功效。促血管新生基因的不必要表达可诱导病理性血管生成，可能导致肿瘤形成和视网膜病，因此是不可接受的。因此，引导缺血目标器官中特异的转基因表达的能力对于有效和安全的全身给药是非常重要的。因此人们广泛认识到对将是非常有利的促血管新生因子和安全有效给药方法的需要。发明简述根据本发明的一个方面提供了分离的包含编码具有HIF-I a氨基酸序列的多肽的核酸序列的多核苷酸，该多肽可稳定表达并具有组成型活性。根据下文所述本发明优选实施方案的进一步特点，该核酸序列列于SEQ ID NO :1。根据所述优选实施方案中又进一步特点，该氨基酸序列列于SEQ ID NO :2。根据所述优选实施方案的又进一步特点，该氨基酸序列至少90%与SEQ ID NO 3同源并包含对应于SEQ ID NO 3的402脯氨酸位点的突变、对应于SEQ ID NO 3的564脯氨酸位点的突变和对应于SEQ ID NO 3的803天冬酰胺位点的突变。根据本发明的另一方面，提供了分离的包含编码具有HIF-Ia氨基酸序列的多肽的氨基酸序列的多肽，该多肽可稳定表达并具有组成型活性。根据所述优选实施方案中又进一步特点，该氨基酸序列列于SEQ ID NO :2。
根据所述优选实施方案的又进一步特点，该氨基酸序列至少90%与SEQ ID NO 3同源并包含对应于SEQ ID NO 3的402脯氨酸位点的突变、对应于SEQ ID NO 3的564脯氨酸位点的突变和对应于SEQ ID NO 3的803天冬酰胺位点的突变。根据本发明的另一方面提供了包含本发明多核苷酸的核酸构建体。根据所述优选实施方案的又进一步特点，该核酸构建体进一步包含顺式-调控元件。根据所述优选实施方案的又进一步特点，该顺式-调控元件包含启动子元件。根据所述优选实施方案的又进一步特点,该该启动子元件为内皮特异性启动子元件。根据所述优选实施方案的又进一步特点，该内皮特异性启动子元件包含至少一个PPE-I启动子拷贝。根据所述优选实施方案的又进一步特点，该PPE-I启动子列于SEQ ID NO :4。根据所述优选实施方案的又进一步特点，该顺式-调控元件进一步包含低氧反应元件。根据本发明又另一方面提供了包含该核酸构建体的细胞。根据本发明又另一方面提供了包含作为活性物质的该核酸构建体和药学可接受载体的药用组合物。根据本发明的附加方面提供了治疗与低氧或缺血、组织灌注内含物减少(reducedtissue perfusion inclusion)或“低血流”相关的医学病症的方法,该方法包括给予需要治疗的受试者治疗有效量的可上调受试者细胞中本发明多肽的药剂，藉此治疗血管生成-相关疾病。根据所述优选实施方案的又进一步特点该药剂为多肽。根据所述优选实施方案的又进一步特点该药剂为核酸构建体。根据所述优选实施方案的又进一步特点所述给药具有全身作用。根据所述优选实施方案的又进一步特点该与缺血相关的疾病或病症选自创伤愈合、缺血性发作、缺血性心脏病、外周血管疾病、肾动脉疾病、胃肠道损伤、烧伤、皮肤移植、血管移植物、器官修复、骨修复病症、肝病症、子宫病症、眼睛血管生成病症、骨再生病症、软骨修复病症和平滑肌细胞病症。本发明通过提供与缺血相关的医学病症的新颖治疗成功克服了目前已知构型的缺点。 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管可使用与本发明所述者相似或等同的方法和材料实施或检测本发明，下文描述了适当的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考均以其完整内容以参考形式并于本文。如有冲突，以本专利说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法和实施例仅为示例性并不具有限制性。附图简述在本文中参考附图仅举例描述本发明。现具体参考详细的附图，应强调的是所显示的详细说明仅为举例而言并仅用于本发明优选实施例的说明性讨论，并以提供被认为是本发明原理和概念方面最有用和最易理解的描述为由而展示。就此而言，并未试图以比基本理解本发明所需更多的细节显示本发明的结构细节，对附图的描述使得本领域技术人员可显而易见如何实施本发明的数种形式。在这些图中图IA-E为说明与P402A P564G和P564A N803A双突变体相比三突变体HIF-I a转录活性的线条图和照片。用p2. I HRE-Iuc和不同的HIF-I a质粒或pcDNA3对照共转染后在HEK293(

图1A)和BAEC (图1B)中测量HRE-介导的转录。数据以荧光素酶比值表示并标准化至P -gal (平均值土 S. D)。与双突变体相比*p < 0. 001。图IC为用HIF-I a质粒或pcDNA3对照转染后48小时分离自HeLa细胞的mRNA的RT-PCR分析。2，2'-联吡啶{2,2' -DP)处理显示于图ID。用p2. I HRE-Iuc和不同的HIF-I a质粒或pcDNA3对照共转染后在VL-缺陷肾细胞癌细胞中测量HRE介导转录。数据以荧光素酶比值表示并标准化至 e -gal (平均值土 S. D)。*p < 0. 001 并且 +P = 0. 003 比 P402A P564G 突变体。用 p2. IHRE-荧光素酶、HIF-Ia质粒和所指量的FIH-I反义(图1E)共转染HEK293细胞。数据以荧光素酶比值表示并标准化至P -gal (平均值土 S. D)。图2A-H为说明三突变体HIF-I a比P402A P564G和P564A N803A双突变体显示出更大血管生成潜能的照片和条线图。图2A-F为在被pcDNA3(图2A)、wt-HIF-1 a (图2B)、P402A P564G(图 2C)、P564A N803A (图 2D)、三突变体(图 2E)或 VEGF (图 2F)转染的HUVECs中体内血管生成测定的代表性照片。图2G为说明已转染HUVECs管形成的条线图，其通过计数每高倍显微镜视野的毛细血管分支数量定量。结果以5个随机显微镜视野的平均值土S. D表示。图2H为说明已转染HUVECs的VEGF蛋白浓度的条线图，用ELISA测定，结果以平均值土 s. D表示。*p = 0. 029比P402A P564G。图3A-H为说明PPE1-3X启动子的内皮和缺血特异性的荧光显微镜切片的照片。图3A-F显示了使后肢缺血或进行假操作的小鼠腓肠肌的荧光显微镜切片，7天后经尾静脉向这些小鼠系统注射生理盐水(图3A和3D)、Ad-CMV-GFP (图3B和3E)或Ad-PPEl-3x_GFP (图3C和3F)。图3G-H显示了用Ad-PPE-1-3X-GFP处理的小鼠腓肠肌的切片，如显示由表达GFP的内皮细胞组成的毛细血管中的红细胞(箭头所指)的荧光显微镜(图3G)下或相差显微镜下(图3H)所见。图4A-F说明了局部Ad-CMV-三突变体和Ad-PPE-三突变体处理可增强缺血后血管生成。图4A为左股动脉结扎后即刻和第7、14、21和28天缺血肢中血流的条线图。数据以左(缺血)与右(非-缺血)肢灌注的比值表示。生理盐水，n = 8 ；Ad-CMV-Luc, n = 11 ；Ad-CMV-wt, n = 11 ；Ad-CMV-三突变体，n = 12 ；Ad-PPE-三突变体，n = 11。图 4B 为手术28天后缺血(左)和非缺血(右)肢的代表性激光多普勒血流影像。在颜色编码影像中，红色表示正常灌注而蓝色表示低和/或无灌注。图4C为手术后21天小鼠后肢的代表性照片。图4D为说明手术后21天出现趾坏死的小鼠比例的条线图。图4E-F显示股动脉结扎后28天腓肠肌切片的毛细血管的代表性⑶31染色(图4E)和定量(图4F)。*p < 0. 01。图5A-N说明了系统给药之后Ad-PPE-三突变体的毒性小于Ad-CMV-三突变体。图5A为说明系统注射生理盐水或腺病毒后一段时间小鼠体重变化的点状图。图5B-D为说明系统注射生理盐水或腺病毒5和21天后血清胆红素(图5B)、AST (图5C)和ALT (图5D)水 平的条线图。图5E-N为系统注射生理盐水(图5E-F) ,AdCMV-Luc (图5G_H)、AdCMV_wt (图51-J)、AdCMV-三突变体(图 5K-L)、AdPPE-三突变体(图 5M-N) 5 (图 5E、G、I、K 和 M)和21天(图5F、H、J、L和N)后小鼠肝的组织切片。图6A-F说明了系统Ad-PPE-三突变体而不是Ad-CMV-三突变体处理可增强缺血后血管生成。图6为左股动脉切除后即刻和7、14、21和28天测量的缺血肢的血流的点状图。数据以左(缺血)和右(非缺血)肢灌注的比值表示。盐水，n = 9 ；Ad-CMV-Luc,n =8 ；Ad-CMV-wt, n = 9 ；Ad-CMV-三突变体，n = 7 ；Ad-PPE-三突变体，n = 8。图 6B 为显示手术后21天出现趾坏死小鼠的百分比的条线图。图6C显示了手术后21天小鼠后肢的代表性照片。图6D为手术后28天缺血(左)和非缺血(右)肢的代表性激光多普勒血流影像。在颜色编码的影像中，红色表示正常灌注而蓝色表示低和/或无灌注。图6E-F显示股动脉结扎后28天腓肠肌切片的毛细血管的代表性CD31染色(图6E)和定量(图6F)。*p< 0. 01。图7A为在BAEC中表达HIF-I a的腺病毒的HRE-介导转录的比较。用p2. IHRE-Luc转染BAEC，24小时后用腺病毒以MOI 20或MOI 200感染。数据以荧光素酶光单位(平均值土 S. D)表不。图7B为HeLa细胞中HIF-1 a的蛋白质印迹分析。用Ad-CMV-GFP、AD-CMV-wtHIF-1 a ,Ad-CMV-三突变体或Ad-PPEl_3x-三突变体或模拟感染对HeLa进行感染。感染后48小时进行蛋白质印迹分析。图7C-G :在HUVEC中表达HIF_1 a的腺病毒的体外血管生成测定。模拟感染(C)或用 Ad-CMV-GFP(D)、Ad-CMV-WtHIF-1 a (E)、Ad-CMV-三突变体(F)或 Ad-PPEl_3x-三突变体(G)感染HUVEC。48小时之后进行体外血管生成测定。图C-G为管形成的代表性照片。
图7H :为说明经ELISA测定的被感染HUVECs的VEGF蛋白浓度的条线图，以平均值土 S. D 表示。*p = 0. 01 比 Ad-CMV-wtHIF-1 a。优选实施方案的描述本发明涉及HIF-I a多肽和其编码多核苷酸，包含它们的药用组合物及其生产和使用方法。具体而言，本发明可用于治疗与缺血相关的疾病。在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应理解的是本发明的应用不受限于下文描述或由实施例例证的细节。本发明可有其它的实施方案并以各种方法实施或进行。而且，应当理解的是本文使用的措辞和术语仅用于描述性目的并不应被认为具有限制 性。低氧-诱导因子I a (HIF-1 a )为异二聚体转录因子和对低氧水平响应的关键调节剂，其已被建议作为治疗性血管生成的潜在候选物。可通过点突变P402A和P564G达到HIF-Ia的稳定化[Masson等，2001，Embo J 20，5197-206]，而通过点突变N803A达到其C-转活结构域(C-TAD)的组成型活性[Lando 等，2002，Science 295，858-61]。在将本发明付诸实践的过程中，发明人通过基因工程构建了结合三个点突变P402A P564G N803A的HIF-1 a突变形式(三突变体)，使HIF-1 a既稳定又具有组成型活性。令人惊讶的是与两个已知的HIF-1 a双突变体相比三突变体对与低氧响应元件相连的报告基因的表达表现出协同作用，如图IA-B所示。因此，发明人表明HIF-1 a C-转活结构域的组成型活化而不仅仅是HIF-1 a分子的稳定性对最佳HIF-介导转录和促血管新生作用是必要的。因此，本发明的三突变体HIF-1 a或其编码多核苷酸可用于治疗与血管生成相关的疾病或病症。如图2G-H所示，如体外血管生成测定所表明，本发明的三突变体比P402A P564G和P564A N803A双突变体显示出更强的血管生成功效。此外，如图4A-F所示，在小鼠后肢缺血模型中与表达野生型HIF-1 a的腺病毒和对照相比表达本发明三突变体HIF-1 a的腺病毒显示出血液灌注增强和毛细血管密度增高。经修饰的前内皮素原-I启动子显示允许在缺血内皮细胞中的特异表达(图3C和3F)。在这一启动子调控下表达三突变体HIF-1 a比在组成型活性启动子调控下表达三突变体(图5A-N和6A-D)降低了异位表达和全身副作用。因此，根据本发明的一个方面，提供了包含编码具有HIF-1 a氨基酸序列的多肽的氨基酸序列的分离多肽，该多肽可稳定表达并具有组成型活性。如本文所使用，短语"HIF-Ia "指至少一个HIF-Ia的活性部分(即，具有HIF-Ia活性的部分)。优选本发明HIF-1 a为人HIF-Ia，例如GenBank登录号NM001530。如本文所使用短语“HIF-1 a活性”指至少HIF-1 a的转录因子活性，即，HIF-1 a转录性上调目标血管生成基因的能力。为了以转录因子发挥作用，HIF-Ia与HIF-13 二聚体化并与辅-因子例如P300结合。因此本发明HIF-1 a优选包含功能性DNA结合结构域和功能性辅-因子和HIF-1 P结合结构域。本发明HIF-1 a不必要包含例如氨基或羧基端氨基酸，因为这些末端序列对于HIF-1 a活性不是必须的。如本文所使用，短语“组成型活性”指包含不被细胞低氧状态调控的转录活性的HIF-1 a。
如本文所使用，短语“稳定表达”指对低氧响应时蛋白体降解不增加的多肽。因此该多肽的半衰期不被Von-Hippel-Lindau(VHL)的存在所改变。优选地，本发明多肽的半衰期至少比野生型多肽半衰期(即不包含突变)大约2倍，更优选大5倍。根据本发明这一方面的优选实施方案，本发明多肽与SEQ ID NO :3至少50%同源，更优选至少60%同源，更优选至少70%同源，更优选至少80%同源，最优选至少90%同源并包含对应于SEQ ID NO 3脯氨酸402位点的突变、对应于SEQ ID NO 3脯氨酸564位点的突变和对应于SEQ ID NO :3天冬酰胺803位点的突变。如本文所使用，术语“突变”指与野生型序列(GenBank登录号NM001530(GI 31077212)相比氨基酸序列的改变。突变可包含缺失或替换。示例性突变包括对应于402位脯氨酸的丙氨酸、对应于564位脯氨酸的甘氨酸和对应于803位天冬酰胺的丙氨酸。
因此，根据优选实施方案本发明多肽列于SEQ ID N0:2。此外，本发明多肽可包含SEQ ID NO : 3的其它保守改变。本文使用的短语“保守改变”指氨基酸残基被另一种生物学相似残基替换。保守改变的实例包括亲水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸替换另一亲水残基，或极性残基替换另一极性残基，例如精氨酸替换赖氨酸、谷氨酸替换天冬氨酸或谷氨酰胺替换天冬酰胺。术语“保守改变”也包括使用被替换的氨基酸取代未被替换的母体氨基酸，只要已替换多肽的抗体也可与未替换多肽发生免疫反应。可使用蛋白质工程方法，例如展示技术发现其它可使本发明HIF-Ia以及HIF-1 a活性部分具有稳定性和组成型活性的突变。构建展示文库的方法为本领域已知。这些方法描述于，例如，Young AC等，“多糖结合抗体至新型隐球菌及其与噬菌体展示文库的肽的复合物的三维结构对鉴定肽模拟位的意义，，(〃 The three-dimensional structures of a polysaccharide binding antibodyto Cryptococcus neoformans and its complex with a peptide from a phage displaylibrary !implications for the identification of peptide mimotopes" )J Mol Biol1997 Dec 12 ；274(4) :622-34 ;Giebel LB等，“筛选环形肽噬菌体文库鉴定以高亲和性与抗生物素蛋白链菌素结合的配体”("Screening of cyclic peptide phage librariesidentifies ligands that bind streptavidin with high affinities" )Biochemistry1995 Nov28 ;34(47) :15430-5 ;Davies EL等，“使用衍生自鸡免疫球蛋白基因的文库筛选特异性嗷菌体展不抗体” ("Selection of specific phage-display antibodies usinglibraries derived from chicken immunoglobulin genes" )J Immunol Methods 1995Oct 12 ；186(1) :125-35 Jones C RT等，“分子识别和生物分离的现有趋势”Currenttrends in molecular recognition and bioseparation" )J Chromatogr A 1995 Jul14；707(1) :3-22 ；Deng SJ等，“从合成基因文库中筛选改良的碳水化合物-结合单链抗体的基石出，，(〃 Basis for selection of improved carbohydrate-binding single-chainantibodies from synthetic gene libraries" )Proc Natl Acad Sci USA 1995 May23 ；92(11) :4992-6 ;以及Deng SJ等，“通过噬菌体展示筛选碳水化合物结合改进的抗体单链可变区片段，，("Selection of antibody single-chain variable fragments withimproved carbohydrate binding by phage display" )J Biol Chem 1994 Apr I;269(13) :9533-8,均以参考形式并于本文。也可使用计算机生物学发现可使本发明HIF-Ia具有稳定性和组成型活性的其它突变。举例而言，可使用各种三维计算机工具用计算机分析各种突变HIF-1 a肽序列赋予稳定性和组成型活性的能力。可使用可用于展示三维结构模型的软件程序例如RIBBONS(Carson, M. ,1997. Methods in Enzymology 277,25)、0 (Jones, TA.等，1991. ActaCrystalIogr A47,110)、DINO(DINO !Visualizing Structural Biology(2001)http://www. dino3d. org) ； QUANTA, I NS IGHT、SYBYL、MACR0M0DE、I CM、M0LM0L、RASMOL 和 GRASP (综述于Kraulis, J. , 1991. Appl Crystallogr. 24,946)建模预期突变肽序列以鉴定可用突变。如本文所使用，术语“多肽”涵盖天然多肽(或是降解产物，或是合成性合成多肽或是重组多肽)和模拟肽(通常为合成型合成多肽)以及类肽和半类肽(其为多肽类似物)，它们具有的一些修饰可使多肽在体内更稳定或更容易进入细胞。这些修饰包括但不
限于N端修饰、C端修饰、多肽键修饰，包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S = 0、0 = C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S = C_NH、CH = CH或CF = CH、骨架修饰和残基修饰。制备模拟肽化合物的方法为本领域已知并描述于例如Quantitative Drug Design, C. A. Ramsden Gd. , 17. 2章，F. Choplin Pergamon Press (1992),其以参考形式并于本文如同完整列于本文。这一方面的进一步细节提供于下文。该多肽内的多肽键(-C0-NH-)可通过以下方式替换，例如N-甲基化键(-N (CH3) -CO-)、酯键(-C (R) H-C-0-0-C (R) -N-)、酮亚甲基键(-C0-CH2-)、a -氮杂键(-NH-N(R)-CO-)，其中R为烷基，例如甲基、亚甲基氨基键(carba bonds) (-CH2-NH-)、羟亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代碳酰胺键(-CS-NH-)、烯属双键(_CH = CH-)、逆酰胺键(-NH-C0-)、多肽衍生物(-N(R)-CH2-C0_)，其中R为"正常"侧链，天然存在于碳原子上。这些修饰可发生在沿着多肽链的任何键上甚至同时发生在数个键上(2-3)。天然芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可替换成合成非天然酸,例如苯胺乙酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物或O-甲基-Tyr。除以上所述，本发明多肽也可包括一个或多个经修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如，脂肪酸、复合碳水化合物等)。如说明书和下文的权利要求部分所使用，术语“氨基酸”或“多个氨基酸”应理解为包括20种天然氨基酸；那些氨基酸常常被体内转录后修饰，包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其它罕见氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链赖氨素、原缬氨酸、己氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D和L-氨基酸二者。以下表I和2列出了可用于本发明的天然氨基酸(表I)和非常规或经修饰的氨基酸(表2)表I
权利要求
1.包含编码具有HIF-Iα氨基酸序列的多肽的核酸序列的分离多核苷酸，所述多肽可稳定表达并具有组成型活性。
2.权利要求I的分离多核苷酸，其中所述核酸序列列于SEQID NO: I。
3.权利要求I的分离多核苷酸，其中所述氨基酸序列列于SEQID NO: 2。
4.权利要求I的分离多核苷酸，其中所述氨基酸序列与SEQID NO: 3至少90%同源并包含对应于SEQ ID NO: 3的402位脯氨酸的突变，对应于SEQ ID NO: 3的564位脯氨酸的突变和对应于SEQ ID NO: 3的803位天冬酰胺的突变。
5.包含编码具有HIF-Ia氨基酸序列的多肽的氨基酸序列的分离多肽，所述多肽可稳定表达并具有组成型活性。
6.权利要求5的分离多肽，其中所述氨基酸序列列于SEQID NO: 2。
7.权利要求5的分离多肽，其中所述氨基酸序列与SEQID NO: 3至少90%同源并包含对应于SEQ ID NO: 3的402位脯氨酸的突变，对应于SEQ ID NO: 3的564位脯氨酸的突变和对应于SEQ ID NO: 3的803位天冬酰胺的突变。
8.包含权利要求I的多核苷酸的核酸构建体。
9.权利要求8的核酸构建体，其进一步包含顺式-调控元件。
10.权利要求9的核酸构建体,其中所述顺式-调控元件包含启动子元件。
11.权利要求10的核酸构建体，其中所述启动子元件为内皮特异性启动子元件。
12.权利要求11的核酸构建体，其中所述内皮特异性启动子元件包含至少一个PPE-I启动子拷贝。
13.权利要求12的核酸构建体，其中所述PPE-I启动子列于SEQID NO: 4。
14.权利要求9的核酸构建体，其中所述顺式-调控元件进一步包含低氧响应元件。
15.包含权利要求8的核酸构建体的细胞。
16.药用组合物，包含作为活性物质的权利要求8的核酸构建体和药学可接受载体。
17.治疗与低氧或缺血、组织灌注内含物减少或“低血流”相关的医学病症的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者治疗有效量的能在受试者细胞中上调权利要求5的多肽的药剂，藉此治疗血管生成相关疾病。
18.权利要求17的方法，其中所述药剂为权利要求5的多肽。
19.权利要求17的方法，其中所述药剂为权利要求8的核酸构建体。
20.权利要求14的方法，其中所述给药具有系统作用。
21.权利要求17的方法，其中所述缺血相关医学病症选自创伤愈合、缺血性发作、缺血性心脏病、外周血管疾病、肾动脉疾病、胃肠道损伤、烧伤、皮肤移植、血管移植、器官修复、骨修复病症、肝病症、子宫病症、眼睛血管生成病症、骨再生病症、软骨修复病症和平滑肌细胞病症。
全文摘要
多肽和其编码多核苷酸及它们在治疗缺血相关医学病症中的应用。本文公开了包含编码具有HIF-1α氨基酸序列的多肽的核酸序列的分离多核苷酸，该多肽可稳定表达并具有组成型活性。也公开了其编码的分离多肽及其应用。
文档编号C12N15/63GK102796741SQ20121021064
公开日2012年11月28日 申请日期2007年7月31日 优先权日2006年7月31日
发明者E.布赖特巴特, L.班乔, R.塔尔 申请人:脉管生物生长有限公司