专利名称：治疗或预防癌症的多肽或其衍生产品及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽及其用途，尤其涉及能治疗或预防癌症的多肽以及由该肽所衍生 的具有治疗或预防癌症功效的产品，本发明还涉及上述多肽或其衍生产品在制备抗肿瘤药 物中的用途，属于多肽抗肿瘤领域。
背景技术：
世界卫生组织发表的一项研究报告表明，全球癌症状况将日益严重，今后20年新 患者人数将由目前的每年1000万增加到1500万，因癌症而死亡的人数也将由每年600万 增至1000万，肿瘤已经成为严重威胁着人类安全和健康的主要疾病之一。中国卫生部的统 计资料表明目前中国每年新生肿瘤患者总数约220万人左右，其中，每年有121万左右的 恶性肿瘤新生患者，占中国每年新生肿瘤患者总数的55% ；同时，全国约有310万左右的肿 瘤现有患者，其中，恶性肿瘤现有患者约182万左右，占中国现有肿瘤患者总数58%，恶性 肿瘤已成为我国居民的主要死因，占死亡原因20%以上。目前恶性肿瘤的治疗方法主要有手术治疗、化疗、放疗三种，其中化疗是近年来在 肿瘤治疗中进步最快的治疗方法。但是化疗药物常“是非不清”、“敌我不分”，在杀伤肿瘤细 胞的同时，也杀伤了人体正常细胞，治疗剂量下对正常组织器官毒副作用大，给患者带来极 大痛苦且疗效欠佳，如骨髓抑制，消化道反应、心、肾等器官的损伤等。因此，新型抗肿瘤药 物研究势在必行，而在肿瘤细胞信号通路上寻找选择性的调节分子可能是新型化疗药物的 研究方向。
发明内容
本发明人根据与肿瘤发生密切相关的G3BP蛋白的一级序列，以及该蛋白的同源 蛋白(pdbID:lgy5，lgy6)，通过计算机同源模建的方法，模建了该蛋白的三维立体结构模 型。基于该蛋白与其结合蛋白RasGAP的相互作用模式，运用分子动力学原理，蛋白质对接、 分子动力学模拟、结合自由能预测、能量分解等分子模拟方法，经合理药物设计获得了一系 列能特异性促进癌细胞凋亡的活性多肽(中国专利申请号，200910163852. 1)。本发明人继续以G3BP蛋白为靶点，应用上述分子模拟方法结合多肽合成、细胞生 物检测方法，设计合成并筛选新肽段。具体是基于此前的能量分解计算结果，确定与蛋白相 互作用有重要贡献的关键残基，设计出抗癌活性多肽序列。开展抗癌多肽序列与G3BP的蛋 白质对接计算，以确定多肽一蛋白复合物三维结构，并应用前述方法(分子动力学、自由能 预测等)开展模拟计算，根据自由能计算提供的信息开展对多肽序列的虚拟突变和虚拟活 性评价，在此基础上设计出了抗癌活性更好的一系列多肽.这些肽单独使用时对癌细胞有 着明显的杀伤力，当它们与临床上常用的化疗药物如顺钼、奥沙利钼等合用，显著地增加化 疗药物对癌细胞的敏感性，增强其对癌细胞的杀伤力，降低它的使用剂量，而且我们已经在 动物肿瘤模型上证明该肽具有抗肿瘤效应。本发明人经过深入的研究后发现，一种具有下述技术方案中的所列的特征的肽可以达到上述目的。一种能治疗或预防癌症的多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。一种能治疗或预防癌症的多肽，其氨基酸序列通式1为IVHNX1X2X3X4GX5X6WX7X8一种能治疗或预防癌症的多肽，其氨基酸序列通式2为
mfivhnx9x10rrgx11mwx12x13上述肽链中单字母符号代表的氨基酸残基定义如下m为蛋氨酸，f为苯丙氨酸，i 为异亮氨酸，v为缬氨酸，h为组氨酸，n为天冬酰胺，g为甘氨酸，w为色氨酸，x1,为可变
的氨基酸残基。x1是酸性氨基酸或酰胺类氨基酸，其中优选为谷氨酸或甘氨酸；x2是脂肪族氨基 酸残基，优选为亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；x3是极性氨基酸残基，优选为谷氨酸或精氨酸； x4是极性氨基酸残基，优选为天冬氨酸或精氨酸 ’ X5是芳香类氨基酸、酸性氨基酸、酰胺类 氨基酸或脂肪族氨基酸残基，优选为色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或亮氨 酸 ’Xe是含硫氨基酸或脂肪族氨基酸残基，优选为甲硫氨酸或亮氨酸；x7是脂肪族氨基酸残 基，优选为缬氨酸、甘氨酸或丙氨酸；x8是羟基类氨基酸或脂肪族氨基酸、酸性性氨基酸残 基，优选为苏氨酸、甘氨酸或谷氨酸。X9是酸性或脂肪族氨基酸残基，优选为谷氨酸或甘氨 酸两种氨基酸残基；Xltl是脂肪族或芳香族氨基酸残基，优选为苯丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸； X11S芳香类氨基酸、酸性氨基酸、酰胺类氨基酸或脂肪族氨基酸残基，优选为色氨酸、苯丙 氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸；X12是脂肪族氨基酸残基，优选为丙氨酸或缬氨 酸；X13是羟基氨基酸或酸性氨基酸残基，优选为苏氨酸或谷氨酸。一种分离和纯化的核苷酸序列，其能编码氨基酸序列为SEQ ID NO. 1的肽。一种分离和纯化的核苷酸序列，其能编码氨基酸序列为通式1的肽。一种分离和纯化的核苷酸序列，其能编码氨基酸序列为通式2的肽。一种表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为seq id no. 1所示肽的核 苷酸序列。一种表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为通式1所示肽的核苷酸序 列。一种表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为通式2所示肽的核苷酸序 列。一种原核或真核宿主细胞，该宿主细胞含有上述表达载体。本发明还进一步提供了将氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所述肽及通式1或通式2所 述的肽与能增加其在细胞中积累的制剂相缀合或混合后所得到的产品。上述与所述肽缀合的制剂是能协助所述肽穿透细胞膜的载体。SEQ IDN0. 1、通式 1或通式2所述的肽和能协助肽穿透细胞膜的载体，如HIV48-57肽，FHV-外被35-49肽， HTLV-II Rex 4_16肽或BMV gag7_25肽缀合，缀合后生成的化合物可以有效的通过细胞膜， 在癌细胞局部起作用，因此具有更强的杀伤癌细胞的效果。能与SEQ ID NO. 1、通式1或通式2所述的肽缀合的制剂还可以是纳米材料、脂质 体或油性化合物。SEQ ID N0. 1、通式1或通式2所述的肽和纳米材料、脂质体等高分子材料缀合，缀合后生成的化合物可以使本发明涉及的肽在机体内更稳定地被运输到靶细胞。本发明涉及 的肽也可以和油性化合物或多种油性化合物的混合物相混合，所得到的混合物也可以使本 发明涉及的肽在机体内更稳定地被运输到靶细胞。一种治疗或预防癌症的药用组合物，包括作为活性物质的药用有效量的SEQID NO. 1、通式1或通式2所述肽，及药用载体、稀释剂和/或佐剂。本发明还提供了 SEQ ID NO. 1、通式1或通式2所述肽用于制备治疗或预防癌症的 药物中的用途。所述癌症包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、乳腺癌、白血 病、膀胱癌、子宫颈癌或鼻咽癌等。本发明还提供了将SEQ ID NO. 1、通式1或通式2所述肽用于制备增强基因毒素选 择性地杀伤癌细胞的药物中的用途。所述癌细胞包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、乳腺癌、白 血病、膀胱癌、子宫颈癌或鼻咽癌等的癌细胞。所述基因毒素包括但不限于顺钼、奥沙利钼、紫杉醇、表柔比星、多柔比星、吡柔 比星、柔红霉素、丝裂霉素、达卡巴嗪、环磷酰胺、吉西他滨或卡培他滨等。本发明的肽可以和基因毒素混合，再添加药学上可接受的辅料或载体制成新型的 更有效的抗癌药物。本发明的肽通常是以能实现预期目的的用量使用。在用于预防和治疗癌症时，所 述肽或它的药用组合物是以治疗有效量服用或使用的。对于系统性用药来说，可以根据体 外实验估算治疗有效量或用量，还可以应用本领域的常用方法通过动物模型估算出体内的 起始剂量。当然，本发明肽的具体有效量要取决于具体的治疗对象、治疗对象的体重、疾病 的严重程度、用药方式以及主治医生的临床判断。本发明人经过深入的研究以后发现上述可用于治疗或预防癌症的多肽。该肽不 仅在单独使用时对癌细胞有着明显的杀伤力，而且可以和临床上常用的化疗药物如顺钼 合用，显著地增加化疗药物对癌细胞的敏感性，增强其对癌细胞的杀伤力，降低它的使用剂 量。本发明肽能对肺癌，肝癌，胃癌，结肠癌，直肠癌，食管癌，乳腺癌，白血病等多种癌细胞 起杀伤作用。本发明涉及的肽对正常细胞无明显的毒性增强作用，且本发明涉及的肽可以 采用化学合成的方法制备得到，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠。本发明肽可以单独用于癌症的治疗和预防且有良好的效果，该肽还可以和化疗药 物(如顺钼、紫杉醇等)合用，能选择性增强化疗药物对肿瘤细胞的敏感性，明显降低了化 疗药物的起效剂量，而对正常细胞的毒性作用小，从而降低了化疗药物的毒性和副作用。
图1 SEQID NO. 5、SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8肽分别对人结肠癌细胞的抑制作
用结果。图2 SEQID N0. 8肽对人肺癌细胞的抑制作用结果。图3 SEQID NO. 1肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用结果。图4 SEQID N0. 2肽、SEQ ID N0. 3肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用结果。图5 SEQID N0. 4肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用结果。
6
图6 SEQ ID NO. 5肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用结果。图7 SEQ ID NO. 6肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用结果。图8 SEQ ID NO. 7肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用结果。图9 SEQ ID NO. 8肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用结果。图10 SEQ ID NO. 9肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用结果。图11 SEQ ID N0. 5肽和奥沙利钼合用对肿瘤细胞的作用结果。氨基酸序列
SEQIDN0.1IVHN
SEQIDNO.2IVHNGFRRGWM WGG
SEQIDNO.3IVHNGFRRGWM WAE
SEQIDNO.4IVHNGFRRGWM WVE
SEQIDNO.5MFIVHNELRRGWM WAE
SEQIDNO.6MFIVHNGFRRGWM WAE
SEQIDNO.7MFIVHNELRRGWM WVE
SEQIDNO.8MFIVHNELRRGWM WVT
SEQIDNO.9MFIVHNGFRRGEM WAE
SEQIDNO.10 MF]VHNEF RRGEM WAE
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1本发明多肽的合成1)实验仪器与材料二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，树脂，二氯甲烷(DCM)，Kaiser试剂盒，1_羟基苯并三 唑(HOBt)，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，二异丙基乙胺(DIEA)，甲醇，各种氨基酸，多肽固 相合成管。2)实验步骤称量树脂并投入到多肽固相合成管(以下简称反应器)中，加入适量的DMF溶胀 10分钟。抽掉DMF进行Fmoc去保护反应，即加适量含20%哌啶的DMF溶液，充分搅拌，5分 钟后抽掉溶液，重新加入20%哌啶的DMF溶液去保护7分钟。抽掉去保护液，用DMF洗涤 树脂4-5次，抽掉DMF，用DCM洗涤1_2次，从反应器中取少量树脂(约5 IOmg)于试管 中，用乙醇洗涤2次，Kaiser法检测并记录颜色，准备投料，进入氨基酸缩合反应。分别按 照SEQ. 1-SEQ. 9肽的氨基酸序列顺序取相应氨基酸、HOBt于适当的容器中，用DMF溶解，溶 解完全后加入DIEA活化5分钟，加入称量好的HBTU，冰水浴下溶解活化5分钟，投入到反 应器中，搅拌反应。90分钟后，从反应器中取少量树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，Kaiser 法检测。抽掉反应器中的液体，用DMF洗涤2次，抽掉DMF，得到第一个氨基酸缩合后的肽 树脂。对所得肽树脂重复进行以上“Fmoc去保护——氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个号为SEQ ID NO. 1-10的肽。采用上述方法，按照HIV48-57肽 的序列分别在SEQ IDN0. 1-10肽上继续化学合成连接对应的氨基酸，得到缀合了 HIV48-57 的SEQ IDN0.1-10肽。反应完毕后，DCM洗涤树脂2_3次，抽掉溶剂，加入甲醇搅拌收缩 (5min+5min)，抽掉甲醇，继续抽干15-20min。反应器中取出合成完的肽树脂，转移到圆底烧 瓶，于干燥器中抽干，在室温下裂解两小时。将树脂过滤后溶液在真空下浓缩冻干。粗肽使 用岛津LC-6AD制备型反相HPLC纯化，使用HPLC检测纯度> 90%。所得到的纯肽使用质谱 (MS, electrospray)鉴定，SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 10肽的有关理化性状如表1所示。表1 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 10肽的有关理化性状 实验例1 MTT法检测SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8肽分别对人结肠 癌细胞的抑制作用一、实验方法将人结肠癌细胞株HCT_116(购于中国科学院上海细胞库)悬浮于含10%热灭活 胎牛血清的RPMI1640培养液中，以5000-10000个/孔的密度接种于96孔板。培养24小 时后，分别加入顺钼、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8肽，其中每种药物的浓度梯 度均为 90 μ mol/L、30 μ mol/L、10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、1. 1 μ mol/L、0 μ mol/L,每个浓度设3个复孔。继续培养20小时后每孔加入MTT (5mg/ml) 20μ 1,4小时后吸去培养液，每孔加入 DMSO 150 μ 1，震荡10分钟使紫色结晶充分溶解。酶标仪570nm测定吸光度。细胞抑制率按下式计算细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值X 100 %二、实验结果由图1可以看出，SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8肽单独作用于人结 肠癌HCT-116细胞时对细胞有明显的抑制作用，且当药物浓度小于ΙΟμπιοΙ/L，上述肽的作 用强于使用顺钼。说明本发明的肽单独使用对肿瘤细胞有作用，可以作为治疗和预防癌症 的药物。实验例2MTT法检测SEQ ID NO. 8肽对人肺癌细胞的抑制作用一、实验方法将人肺癌细胞株A549(购于中国典型培养物保藏中心)悬浮于含10%热灭活胎 牛血清的F-12K培养液中，以5000-10000个/孔的密度接种于96孔板。培养24小时后， 分别加入顺钼和SEQ ID NO. 9肽，其中每种药物的浓度梯度均为90ymol/L,30ymol/L, 10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、1. 1 μ mol/L、0 μ mol/L,每个浓度设3个复孔。继续培养20小时后 每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小时后吸去培养液，每孔加入DMSO 150 μ 1，震荡10分钟使 紫色结晶充分溶解。酶标仪570nm测定吸光度。细胞抑制率按下式计算细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值X 100%二、实验结果由图2可以看出，SEQ ID N0. 8肽单独作用于人肺癌A549细胞时对细胞有明显的 抑制作用，说明本发明的肽单独使用对肿瘤细胞有作用，可以作为治疗和预防癌症的药物。实验例3MTT法检测SEQ ID NO. 1肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用一、实验方法将人结肠癌细胞株HCT-116悬浮于含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液 中，以5000-10000个/孔的密度接种于96孔板。培养24小时后，分别加入顺钼、顺钼和 SEQ ID NO. 1所述肽混合液。其中每种混合液中顺钼浓度梯度为10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽终浓度均为 20 μ mol/L,每个浓度 设3个复孔。继续培养20小时后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小时后吸去培养液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震荡10分钟使紫色结晶充分溶解。酶标仪570nm测定吸光度。细胞抑制率按下式计算细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值X 100 %二、实验结果由图3可以看出，当顺钼与SEQ ID NO. 1合用，它们对HCT-116细胞的抑制作用明 显强于单独使用顺钼，说明本发明肽可以增加顺钼对人结肠癌细胞HCT-116的敏感性，增 强其对HCT-116细胞的抑制作用。实验例4MTT法检测SEQ ID N0. 2肽、SEQ ID N0. 3肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作 用一、实验方法
将人结肠癌细胞株HCT-116悬浮于含10 %热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中， 以5000-10000个/孔的密度接种于96孔板。培养24小时后，分别加入顺钼、顺钼和SEQ ID NO. 2所述肽混合液、顺钼和SEQ ID NO. 3所述肽混合液。其中每种混合液中顺钼浓度梯度 为 10ymol/L、3. 3ymol/L、l. Iymol/L、0. 37ymol/L、0. 12 μ mol/L、0 μ mol/L，各肽终浓度 均为20ymol/L，每个浓度设3个复孔。继续培养20小时后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1， 4小时后吸去培养液，每孔加入DMSO 150 μ 1，震荡10分钟使紫色结晶充分溶解。酶标仪 570nm测定吸光度。细胞抑制率按下式计算细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值X 100 %二、实验结果由图4可以看出，当顺钼与SEQ ID NO. 2合用以及顺钼与SEQ ID NO. 3合用，它们 对HCT-116细胞的抑制作用明显强于单独使用顺钼，说明本发明的SEQID N0. 2肽或SEQ ID N0. 3肽可以增加顺钼对人结肠癌细胞HCT-116的敏感性，增强其对HCT-116细胞的抑制作用。实验例5MTT法检测SEQ ID N0. 4肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用一、实验方法将人结肠癌细胞株HCT-116悬浮于含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液 中，以5000-10000个/孔的密度接种于96孔板。培养24小时后，分别加入顺钼、顺钼和 SEQ ID N0. 4所述肽混合液。其中每种混合液中顺钼浓度梯度为10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽终浓度均为 20 μ mol/L,每个浓度 设3个复孔。继续培养20小时后每孔加入MTT (5mg/ml) 20μ 1,4小时后吸去培养液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震荡10分钟使紫色结晶充分溶解。酶标仪570nm测定吸光度。细胞抑制率按下式计算细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值X 100%二、实验结果由图5可以看出，当顺钼与SEQ ID N0. 4合用，它们对HCT-116细胞的抑制作用明 显强于单独使用顺钼，说明本发明肽可以增加顺钼对人结肠癌细胞HCT-116的敏感性，增 强其对HCT-116细胞的抑制作用。实验例6MTT法检测SEQ ID N0. 5肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用一、实验方法将人结肠癌细胞株HCT-116悬浮于含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液 中，以5000-10000个/孔的密度接种于96孔板。培养24小时后，分别加入顺钼、顺钼和 SEQ ID N0. 5所述肽混合液。其中每种混合液中顺钼浓度梯度为10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽终浓度均为 20 μ mol/L,每个浓度 设3个复孔。继续培养20小时后每孔加入MTT (5mg/ml) 20μ 1,4小时后吸去培养液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震荡10分钟使紫色结晶充分溶解。酶标仪570nm测定吸光度。细胞抑制率按下式计算细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值X 100%二、实验结果
由图6可以看出，当顺钼与SEQ ID NO. 5合用，它们对HCT-116细胞的抑制作用明 显强于单独使用顺钼，说明本发明肽可以增加顺钼对人结肠癌细胞HCT-116的敏感性，增 强其对HCT-116细胞的抑制作用。实验例7MTT法检测SEQ ID NO. 6肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用一、实验方法将人结肠癌细胞株HCT-116悬浮于含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液 中，以5000-10000个/孔的密度接种于96孔板。培养24小时后，分别加入顺钼、顺钼和 SEQ ID NO. 6所述肽混合液。其中每种混合液中顺钼浓度梯度为10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽终浓度均为 20 μ mol/L,每个浓度 设3个复孔。继续培养20小时后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小时后吸去培养液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震荡10分钟使紫色结晶充分溶解。酶标仪570nm测定吸光度。细胞抑制率按下式计算细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值X 100 %二、实验结果由图7可以看出，当顺钼与SEQ ID N0. 6合用，它们对HCT-116细胞的抑制作用明 显强于单独使用顺钼，说明本发明肽可以增加顺钼对人结肠癌细胞HCT-116的敏感性，增 强其对HCT-116细胞的抑制作用。实验例8MTT法检测SEQ ID N0. 7肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用一、实验方法将人结肠癌细胞株HCT-116悬浮于含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液 中，以5000-10000个/孔的密度接种于96孔板。培养24小时后，分别加入顺钼、顺钼和 SEQ ID NO. 1所述肽混合液。其中每种混合液中顺钼浓度梯度为10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽终浓度均为 20 μ mol/L,每个浓度 设3个复孔。继续培养20小时后每孔加入MTT (5mg/ml) 20μ 1,4小时后吸去培养液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震荡10分钟使紫色结晶充分溶解。酶标仪570nm测定吸光度。细胞抑制率按下式计算细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值X 100 %二、实验结果由图8可以看出，当顺钼与SEQ ID N0. 7合用，它们对HCT-116细胞的抑制作用明 显强于单独使用顺钼，说明本发明肽可以增加顺钼对人结肠癌细胞HCT-116的敏感性，增 强其对HCT-116细胞的抑制作用。 实验例9MTT法检测SEQ ID N0. 8肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用一、实验方法将人结肠癌细胞株HCT-116悬浮于含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液 中，以5000-10000个/孔的密度接种于96孔板。培养24小时后，分别加入顺钼、顺钼和 SEQ ID N0. 8所述肽混合液。其中每种混合液中顺钼浓度梯度为10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽终浓度均为 20 μ mol/L,每个浓度 设3个复孔。继续培养20小时后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小时后吸去培养液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震荡10分钟使紫色结晶充分溶解。酶标仪570nm测定吸光度。
细胞抑制率按下式计算细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值X 100 %二、实验结果由图9可以看出，当顺钼与SEQ ID NO. 8合用，它们对HCT-116细胞的抑制作用明 显强于单独使用顺钼，说明本发明肽可以增加顺钼对人结肠癌细胞HCT-116的敏感性，增 强其对HCT-116细胞的抑制作用。实验例10MTT法检测SEQ ID NO. 9肽和顺钼合用对肿瘤细胞的作用一、实验方法将人结肠癌细胞株HCT-116悬浮于含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液 中，以5000-10000个/孔的密度接种于96孔板。培养24小时后，分别加入顺钼、顺钼和 SEQ ID NO. 9所述肽混合液。其中每种混合液中顺钼浓度梯度为10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽终浓度均为 20 μ mol/L,每个浓度 设3个复孔。继续培养20小时后每孔加入MTT (5mg/ml) 20μ 1,4小时后吸去培养液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震荡10分钟使紫色结晶充分溶解。酶标仪570nm测定吸光度。细胞抑制率按下式计算细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值X 100 %二、实验结果由图10可以看出，当顺钼与SEQ ID N0. 9合用，它们对HCT-116细胞的抑制作用 明显强于单独使用顺钼，说明本发明肽可以增加顺钼对人结肠癌细胞HCT-116的敏感性， 增强其对HCT-116细胞的抑制作用。实验例IlMTT法检测SEQ ID N0. 5肽和奥沙利钼合用对肿瘤细胞的作用一、实验方法将人结肠癌细胞株HCT-116悬浮于含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液 中，以5000-10000个/孔的密度接种于96孔板。培养24小时后，分别加入奥沙利钼、奥沙 利钼和SEQ ID N0. 5所述肽混合液。其中每种混合液中奥沙利钼浓度梯度为90 μ mol/L、 30ymol/LU0ymol/L、3. 3ymol/LU. Iymol/L、0. 37ymol/L、0. 12 μ mol/L、0 μ mol/L，各 肽终浓度均为20 μ mol/L,每个浓度设3个复孔。继续培养20小时后每孔加入MTT (5mg/ ml) 20 μ 1，4小时后吸去培养液，每孔加入DMSO 150 μ 1，震荡10分钟使紫色结晶充分溶解。 酶标仪570nm测定吸光度。细胞抑制率按下式计算细胞抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值X 100%二、实验结果由图11可以看出，当奥沙利钼与SEQ ID N0. 5合用，它们对HCT-116细胞的抑制作 用明显强于单独使用奥沙利钼，说明本发明肽可以增加奥沙利钼对人结肠癌细胞HCT-116 的敏感性，增强其对HCT-116细胞的抑制作用。实验例12SEQ ID N0. 5肽体内抗肿瘤作用实验用18-22克重的BALB/c种雄性小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限 公司)。结肠癌26肿瘤组织(中国医学科学院)与0.85%生理盐水按1 10研磨成细 胞悬液，无菌操作在动物右侧腋窝皮下接种肿瘤，每只动物接种0. 2ml。接种肿瘤24小时腔给药，每天1次，共10次。顺钼经腹腔给药，隔天1次，共5次；SEQ ID NO. 5肽和顺钼用0. 85%生理盐水溶解，腹腔给药量为0. 2ml/20g体重。实验设对照组 (0. 85%生理盐水)、SEQ ID NO. 5肽不同剂量组、顺钼组及SEQ ID NO. 5肽不同剂量与顺钼 联合用药组。接种肿瘤后11天结束实验，称体重，处死动物，剥取肿瘤，称重量。按下式计 算肿瘤抑制率，并经统计学处理，判断有无显著性差异。肿瘤抑制率=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重X 100%药 物联合作用评价两药联合指数(combine index,Cl)CI = AB/(AXB)。AB为两药联合作用组的T/ C比值，A和B是药物单独作用的T/C比值(理论上当CI < 1时两药有协同作用)。实验结果SEQ ID N0. 5肽和顺钼联合用药对结肠癌26显示剂量依赖性肿瘤抑制作用。SEQ ID N0. 5肽剂量10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg与顺钼剂量lmg/kg联合用药均有不同程度的抑 瘤作用。SEQ ID N0. 5肽10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg与顺钼lmg/kg联合用药的抑瘤率分别 为51%，61%和66% (P <0.01)；两药联合指数(Cl)分别为0. 88，0. 73和0. 79，显示有协 同作用，20mg/kg联合用药组显示显著协同作用(表2)。体内试验结果表明，SEQ ID N0. 5肽和顺钼联合用药对小鼠移植性肿瘤结肠癌26 肿瘤生长有剂量依赖性抑制作用，SEQ ID N0. 5肽和顺钼联合用药显示有协同作用。表2. SEQ ID N0. 5肽与顺钼联合用药对小鼠结肠癌26的作用
权利要求
一种具有杀伤癌症细胞效应的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.一种具有杀伤癌症细胞效应的肽，其特征在于，其通式为IVHNX1X2X3X4GX5X6WX7X8其中，I为异亮氨酸，V为缬氨酸，H为组氨酸，N为天冬酰胺，G为甘氨酸，W为色氨酸， Xm为可变的氨基酸残基。
3.根据权利要求2所述的肽，其特征在于=X1是酸性氨基酸或酰胺类氨基酸，优选为谷 氨酸或甘氨酸；x2是脂肪族氨基酸残基，优选为亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；x3是极性氨基 酸残基，优选为谷氨酸或精氨酸-J4是极性氨基酸残基，优选为天冬氨酸或精氨酸；x5是芳 香类氨基酸、酸性氨基酸、酰胺类氨基酸或脂肪族氨基酸残基，优选为色氨酸、苯丙氨酸、酪 氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸；x6是含硫氨基酸或脂肪族氨基酸残基，优选为甲硫氨酸 或亮氨酸；x7是脂肪族氨基酸残基，优选为缬氨酸、甘氨酸或丙氨酸；x8是羟基类氨基酸或 脂肪族氨基酸、酸性性氨基酸残基，优选为苏氨酸、甘氨酸或谷氨酸。
4.根据权利要求2所述的肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQID NO. 2,SEQ ID NO. 3 或 SEQ ID NO. 4 所示。
5.一种具有杀伤癌症细胞效应的肽，其特征在于其通式为MFIVHNX9X10RRGX11MWX12X13其中，M为蛋氨酸，F为苯丙氨酸，I为异亮氨酸，V为缬氨酸，H为组氨酸，N为天冬酰 胺，R为精氨酸，G为甘氨酸，W为色氨酸，X9_13为可变的氨基酸残基。
6.根据权利要求5所述的肽，其特征在于X9是酸性或脂肪族氨基酸残基，优选为谷氨酸或甘氨酸；X10是脂肪族或芳香族氨基酸残基，优选为苯丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸；X11为芳香类氨 基酸、酸性氨基酸、酰胺类氨基酸或脂肪族氨基酸残基，优选为色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、 谷氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸；X12是脂肪族氨基酸残基，优选为丙氨酸或缬氨酸；X13是羟基氨 基酸或酸性氨基酸残基，优选为苏氨酸或谷氨酸。
7.根据权利要求5或6所述的肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 或 SEQ ID NO. 10 所示。
8.编码权利要求1、2、5所述肽的核苷酸序列。
9.一种表达载体，其特征在于含有至少一个拷贝的如权利要求8所述的核苷酸序列。
10.含有权利要求9所述表达载体的宿主细胞。
11.权利要求1、2、5所述的肽与能增加该肽在细胞中积累的制剂相缀合或混合所得到 的产品。
12.如权利要求11所述的产品，其特征在于所述的制剂是能协助肽穿透细胞膜的载体。
13.如权利要求12所述的产品，其特征在于所述的能协助肽穿透细胞膜的载体选自 下列富含精氨酸的肽Η ν48_57肽，FHV-外被35_49肽，HTLV-II Rex4^16肽或BMV gag7_25肽。
14.如权利要求12所述的产品，其特征在于所述制剂选自纳米材料，脂质体或油性化 合物，或者由多种油性化合物所组成的混合物。
15.一种治疗或预防癌症的药用组合物，其特征在于由治疗或预防上有效量的权利2要求1、2、5所述的肽和药学上可接受的辅料或载体所组成。
16.权利要求1、2、5所述的肽在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其特征在于所述癌症选自肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、 直肠癌、食管癌、乳腺癌、白血病、膀胱癌、子宫颈癌或鼻咽癌。
18.权利要求12所述的产品在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。
19.权利要求1、2、5所述的肽在制备用于增强基因毒素选择性地杀伤癌细胞的药物中 的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于所述基因毒素选自顺钼、奥沙利钼、紫杉 醇、表柔比星、多柔比星、吡柔比星、柔红霉素、丝裂霉素、达卡巴嗪、环磷酰胺、吉西他滨或 卡培他滨。
全文摘要
本发明公开了治疗或预防癌症的多肽或其衍生产品及应用。所述肽的氨基酸序列可以为SEQ ID NO.1所示，或选自以下两个通式(1)IVHNX1X2X3X4GX5X6WX7X8；(2)MFIVHNX9X10RRGX11MWX12X13；本发明多肽在单独使用时对癌细胞有着明显的杀伤力，当其和临床上常用的化疗药物如顺铂合用，能显著地增加化疗药物对癌细胞的敏感性，增强其对癌细胞的杀伤力，降低使用剂量。本发明肽能对多种癌细胞起杀伤作用，对正常细胞无明显的毒性增强作用，且本发明涉及的肽可以采用化学合成的方法制备得到，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠。
文档编号A61K38/10GK101921313SQ20101014003
公开日2010年12月22日 申请日期2010年4月7日 优先权日2010年4月7日
发明者熊俊宇, 陈建华, 陈彩虹, 黄毅 申请人:武汉凯泰新生物技术有限公司