水稻粳型杂种育性基因S5-j的分离克隆及应用的制作方法

专利名称：水稻粳型杂种育性基因S5-j的分离克隆及应用的制作方法
技术领域：
本发明是申请号200710053552.9专利申请案的分案申请。本发明涉及植物基因工程技术领域。具体 涉及一种粳型杂种育性基因S^j的分离克隆、功能验证及在水稻改良中的应用。
背景技术：
水稻属禾本科(Gram'"eae)、禾亚科(尸ooWeae)的稻属(C!rj^e站)，分为两个栽培稻种亚洲栽培 稻(Or72a sa"ra L.)和非洲栽培稻(&丁za ^Ja6em'鹏)。亚洲栽培稻又分为籼亚种(ssp. i/3o7ca) 和粳亚种(ssp.力poWca)。两个亚种在形态和遗传上存在着明显的差异，同时也存在着生殖障碍，籼粳 亚种间杂种往往表现为不育或半不育(Kato S, Kosaka H, Hara S (1928) On the affinity of rice varieties as shown by fertility of hybrid plants. 5"'尸ac /^rz'c A>us/w 〃"j>, 3:132-147;
Oka HI (1988) Origin of cultivated rice. Scientific Societies Press, Tokyo, Japan pp 181-209: Liu KD, Zhou ZQ， Xu CG, Zhang Q， Saghai Maroof MA (1996) An analysis of hybrid sterility in rice using a diallel cross of 21 parents involving i"o^ca, j'砂o"ica and wide compatibility varieties. Euphytica 90:275 - 280)。水稻籼粳亚种间具有比水稻品种间更强的杂种优势，但籼粳亚种间杂种的不育 性却限制了对其杂种优势的利用。研究者利用各种遗传标记对水稻籼粳亚种间杂种的不育现象进行了广泛 的研究。研究表明影响小穗育性的位点分别对应于胚囊育性和花粉育性，说明雄性败育和雌性败育对亚种 间杂种败育都有着很重要的作用。研究进一步表明，控制水稻籼粳杂种育性的基因在杂合状态下往往发生 不亲和互作，使雄配子败育或雌配子败育，但是这些基因在纯合状态下〔如纯和的亲本中)不影响配子的 正常发育。
Ikehashi禾口 Araki (Ikehashi H， Araki H (1986) Genetics of Fsterility in remote crosses of rice. In: IRRI (ed) Rice genetics. IRRI, Manila, pp 119-130)首先将一个影响杂种育性的位点定 位在第6染色体的色素基因C和糯性基因盯之间，并命名为55。他们通过对育性分离结果的考察，指出 S5位点是一组复等位基因Sfn (广亲和)、5fi (籼稻)、Sfj (粳稻)。所述基因符号S代表杂种不育 性(Sterility)， n、 i和j分别代表中性型(neutral)也称广亲和型(wride-compatibHity)、籼型(^7力'cs) 和粳型O'邻o/jj'ca)的复等位基因。其中，由55^n/5fn、 5^n/ 5fi、 5"5"n/ 55-j组合而成的合子，杂 种育性正常。而由5^j/S^i组成的合子，则表现为不育或半不育。
为了在杂交水稻育种中有效克服杂种不育性的问题，本发明通过图位克隆(map-based cloning)技 术获得了水稻杂种育性基因55的多个等位基因，包括广亲和型5^n、籼型5^i和粳型5^j，通过转基 因实验验证了此基因的功能。该基因的分离克隆使得水稻籼粳亚种间杂种优势的利用成为可能。其功能研 究和应用将更好的利用水稻籼粳亚种间强大的杂种优势，进一步提高杂交水稻的生物学产量。

发明内容
本发明的目的是从粳稻中分离克隆一个水稻粳型杂种育性基因S5~j，提供上述杂种育性基因所编码的 蛋白质，并对该基因进行功能验证及在水稻杂交育种中的应用。所述的基因与天冬氨酰蛋白酶基因序列高 度同源，其生物学功能为控制水稻籼稻和粳稻杂种的胚囊育性。该基因导致粳稻和籼稻杂交后代雌配子败 育，对利用籼粳亚种间的杂种优势和提高水稻的生物学产量起重要作用。
本发明涉及分离和应用一个编码天冬氨酰蛋白酶的粳型杂种育性基因S5-j的DNA片段，并对该片段 的作用机理进行阐述。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO: 2所示，或者基本上相当于SEQ ID NO: 2所 示的高度同源DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO: 2所示序列的亚片段。
可以采用己经克隆的粳型杂种育性基因&5-j的DNA片段作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本 发明的基因或同源基因。可以采用PCR技术，从栽培稻或野生稻的基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发 明的粳型杂种育性基因^W-j以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。同样也可以采取化学合成
3的方法获得本发明的基因或同源基因。采用以上技术，可以分离得到包含粳型杂种育性基因S5-j的序列， 将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，可获得对籼稻杂交后代不育 的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动 子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是 ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，伹必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。
携带有本发明粳型杂种育性基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化， 微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach (1998) Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411-463: Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology(2nd Edition))。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。


序列表SEQ ID No: 1显示的是本发明分离克隆的包含有基因编码区DNA片段序列。序列表SEQ ID No:2显示的是本发明分离克隆的包含有5f j基因编码区DNA片段序列。序列表SEQ ID No:3显示的是本 发明分离克隆的包含有i基因编码区DNA片段序列。
图l: S5基因克隆和分离鉴定流程图。
图2: 5^基因效应下籼稻、粳稻和广亲和品种杂种育性示意图。
图3:互补载体构建示意图。
图4:遗传转化载体pCAMBIA1301的结构。
图5: T,代转基因阳性植株(左)小穗不育和转基因阴性植株(右)小穗可育。 图6: T,代转基因阴性植株(a)和转基因阳性植株(b)花粉均可育。
图7: Ti代转基因阴性植株(a)胚囊可育和转基因阳性植株(b)胚囊败育。标尺长度50Wn。 图8: T。代转基因阳性植株和转基因阴性植株(a)以及L代转基因阳性植株和转基因阴性植株(b)胚囊 育性、花粉育性和小穗育性图示。
图9:广亲和品种、粳稻和籼稻55基因cDNA结构示意图。 图10:广亲和品种、粳稻和籼稻S5蛋白结构示意图。
图ll: 5^基因在水稻全生育期不同组织中表达水平示意图。使用的芯片数据包括籼稻Zhenshan97和 Minghui 63不同生长时期下的25种不同组织。
图12:体外检测S5蛋白绝对活性(a)和相对活性(b)。其中绝对活性以水为对照测定，相对活性以该 蛋白活性最高的点为对照测定。白色柱状图示意蛋白酶在不同pH条件下活性，深色柱状图示意蛋白酶活 性被p印statin A抑制。
图13: SDS-PAGE胶图显示S5蛋白在不同pH条件下自身剪接活性。
图14:原位杂交确定S5基因在水稻中的表达部位。(a)该基因在Ballila珠被和孢母细胞表达；(b) 该基因在02428珠心和孢母细胞中表达；(c)该基因在Ballila小孢子母细胞中表达。标尺长度为25Wn。
具体实施例方式
以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有S5基因完整 编码区段的DNA片段以及验证S5基因功能的方法(发明流程如图1所示)。根据以下的描述和这些实施 例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，对本发明做 出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。 实施例l :分离克隆包含有S5基因区段的DM片段
1.利用图位克隆技术鉴定水稻6^基因
本发明中构建定位群体时用到了三个亲本02428、南京11和Balilla。 02428是一个粳型的广亲和 品种，是选用两个粳稻品种云南螃蟹谷和上海汲浜稻，分别用辐射诱变处理，并经高光效筛选出的材料间 杂交，从后代中选育成的(邹江石等，广亲和选系02428在籼粳亚种间杂交的初步利用.中国农业科学，1989， 22: 6-14)。南京11为江苏农科院育成的中籼品种，属胜利籼衍生品系。巴利拉(Balilla)是引 自意大利的粳型品种。
本发明在前期工作中构建了一个包含7000个单株的三交F!大群体。1999年春在海南陵水配制02428/ 南京ll杂交组合。同年夏天在武汉种植Fi代植株，筛选阳性单株。1999年冬天，将杂种稻篼移往海南陵 水基地，并尽量分篼。在2000春天，以02428/南京11真杂种稻篼作为母本，与Balilla大量配制三交 R杂种。2000年夏天，在水稻生长季节，在华中农业大学(武汉)水稻试验田分单株植株02428/南京 11〃Balilla三交F,群体，最后共成苗7000株。
考察7000株三交F!群体中所有高结实率的单株，总共获得了 1000多株结实率在70%以上的单株。 从中随机选取202株结实率在70%以上的真杂种单株，进行DNA抽提和标记分析，对5"5区段的分子标记 进行重组交换分析。DNA的抽提按Murray和Tho即son的CTAB法进行(Murray M G, Thompson W F (1980) Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucl Acids Res. 8: 4321-4325)。分子标记 的RFLP分析，包括DNA酶切、电泳、转膜和杂交，按Liu等人(Liu K D et al. (1997) A genome-wide analysis of wide compatibility in rice and the precise location of the S5 locus in the molecular map. Theor Appl Genet. 95:809-814)的实验程序进行。S5基因限定在分子标记N29和23D12R之间，结 果如表1所示。
表1利用202株高结实率单株对广亲和基因的定位
交换单株数 68 68 55 52 52 50 51 53 53 65
选取SSR标记RM253或PCR—RFLP标记Cll和RG213对所有高结实率的单株进行了扫描，单株用到SSR 标记RM276和RM225进行筛选。其中，标记RM225、 RM253和Cll位于基因55的一侧，标记RG213和RM276 位于基因5^的另一侧。共筛选到了44株在标记之间发生重组的单株。利用S5区段的分子标记对这44株 高结实率的重组单株进行了重组分析，结果显示S5基因限定在分子标记7B1和15D2之间，两端各有一个 重组单株，部分重组单株的信息如表2所示。
表2 利用S5区段的分子标记对44株重组单株的基因型分析(部分数据)
1
2
3
4
5
F (T 0
F 0 0
F 0 0
F 1 1
F 1 1
0 0
0
1
1
0 0
0
1 1
0 0
0
1 1
0 0
0
1 1
0 0
0
1 1
0 0
0
1 1
0
0
1
0 0
0
0
1
0 0
r 1 1
0 0
1 1 1
1 1 1
1 1 1
0 0 0
0 0 0
aGenotype 0 of each locus was composed of an allele from 02428 and an allele from Balilla bGenotype 1 of each locus was composed of em allele from Nanjing 11 and an allele from Balilla 上述结果将^5基因定位在两个亚克隆分子标记7B1和15D2之间约40 kb的DNA区段上。利用 http :〃www. softberry. com网站上的FGENSH软件对分子标记7B1和15D2之间40 kb的DM片段进行了 开放阅读框(open reading frame: ORF)的预测，共检测到了 5个完整的ORFs， Blaxt X同源性分析发 现候选基因0RF5与天冬氨酸蛋白酶(eukaryotic aspartyl protease)高度同源。
R2171
RG138
RG213
23D12K
F7
N29
Cll
HM253
RZ450
RZ398
己
标
RG213
G聽
RG138
R2349
23D12R
F7
7D3
7F11
15D2
7B1
F29
34
F38
M6
N29
Cll
E23
A30
M253
Genotype
Individual
s2.遗传转化载体的构建及转基因植株的表现
本发明基因S5位点是一组复等位基因S5^n(广亲和)、i^i(籼稻)、55^j(粳稻)。其中，由5^n/55~n、 5fn/S5"i、 Sfn/j组合而成的合子，杂种育性正常。而由Sf jAS&i组成的合子，则表现为不育或 半不育(图2)。根据此基因的功能，申请人采取将籼稻片段转化粳稻植株的策略，从转基因植株(基因型 5^j/5fj+5"5"i)的肓性表型来验证。此基因将会产生不育表型。
互补载体的构建方法是根据籼稻南京11基因组序列设计PCR引物ASPHF(5'-TAMAAGCTTCATCATGGGCTGCTGCTAGATGGA-3，)和ASPHR(5' -TGCTMGCTTTACGAGGTCATGGGTTGMGTCCT-3') 将候选基因区段扩增出来，互补载体外源PCR扩增反应所用的试剂来自Takara公司，反应条件为94°C， 3 min; 94°C， 1 min， 60。C， 1 min, 68°C, 6 min' 30 cycles; 72°C, 5 rain。
互补载体构建示意图如图3所示。PCR产物直接用HindIII酶切，双元载体(图4) pCAMBIA1301 (来 自澳大禾U亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture),携带具有组成型和超量表达特征的玉米强启动子Ubiquitinl的农杆菌介导的遗传转化载 体)也采用HindIII酶切，去磷酸化后连接。转化大肠杆菌DH10fi (购自Invitrogen公司)，筛选阳性克 隆。采用农杆菌介导的方法转化，农杆菌菌株为超毒力菌株EHA105 (SunX， Cao Y， Yang Z， Xu C， Li X, Wang S， Zhang Q (2004) Ja邻 a gene conferring resistance to ZaM力o/no"as orxzae pv. orrzse in rice, encoding a LRK rec印tor kinase-like protein. Plant J 37:517-527),转基因的受体为粳稻品 种Balilla。
本发明遗传转化的主要步骤、培养基及其配制方法如下所述 (1)试剂和溶液缩写
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下6-BA (6-BenzylaminoPurine， 6-苄基腺嘌 呤);CN (Carbenicillin，羧节青霉素);KT (Kinetin，激动素);NM (Napthalene acetic acid, 萘乙酸)；IAA (Indole-3-acetic acid,卩引哚乙酸)；2， 4-D (2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid' 2, 4-二氯苯氧乙酸)；AS (Acetosringo加，乙酰丁香酮)；CH (Casein Enzymatic Hydrolysate, 水解酪蛋白)；HN (HygromycinB，潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亚砜)；N6max (N6 大量元素成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS 微量元素成分溶液) 〔2)主要溶液配方
1) N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制) 硝酸钾(KN03) 28. 3克 磷酸二氢钾(KH2P04) 4. O克
硫酸铵((NH4)2S04) 4.63克 硫酸镁(MgS04 7H20) 1. 85克
氯化钙(CaCl2 2仏0) 1. 66克
将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。
2) N6培养基微量元素母液(按照100倍浓縮液(100X)配制 碘化钾(KI) 0.08克
硼酸(H3B03) 0. 16克
硫酸锰(MnS04 4ft0) 0. 44克
硫酸锌(ZnS04 7Hz0) 0. 15克
将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至iooo毫升。
3) 铁盐(Fe2EDTA)贮存液(按照100X浓縮液配制)
将3. 73克乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA 2H20)和2. 78克FeS0r7H20分别溶解，混合并用蒸馏水定容 至1000毫升，至70'C温浴2小时，4'C保存备用。
64) 维生素贮存液(按照100X浓缩液配制) 烟酸(Nicotinic acid) 0. l克 维生素Bl (Thiamine HC1) 0. l克 维生素B6 (Pyridoxine HC1) 0. l克 甘氨酸(Glycine) 0. 2克 肌醇(Inositol) IO克 加蒸馏水定容至1000毫升，4'C保存备用。
5) MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓縮液配制) 硝酸铵(NH4N03) 16. 5克
硝酸钾 19.0克
磷酸二氢钾 1.7克
硫酸镁 3.7克
氯化钙 4.4克
将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
6) MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制) 硫酸锰(MnS04 ' 4H20 ) 2. 23克
硫酸锌(ZnS04 '7H20) 0.86克 硼酸(H3B03 ) 0. 62克
碘化钾(KI) 0.083克 钼酸钠(Na2Mo04 2H20 ) 0. 02 5克
硫酸铜(CuS04 5H20 ) 0. 00 2 5克
氯化钴(CoCl2'6H20) 0.0025克 将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
7) 2，4-D贮存液(l毫克/毫升)的配制
秤取2，4-D100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100 毫升，于室温下保存。
8) 6-BA贮存液(l毫克/毫升)的配制
秤取6-BA100毫克，用1亳升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100 毫升，室温保存。
9) 萘乙酸(NM)贮存液(l毫克/毫升)的配制
秤取NM100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100 毫升，4'C保存备用。
10) 吲哚乙酸(IM )贮存液(l毫克/毫升)的配制
秤取IM 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100 毫升，4"C保存备用。
11) 葡萄糖贮存液(0.5克/毫升〉的配制
秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4'C保存备用。
12) AS lt存液的配制
秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至l. 5毫升离心管内，4'C保存备用。
13) 1N氢氧化钾贮存液
秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。 (3)用于水稻遗传转化的培养基配方 1)诱导培养基
N6max母液(取已经制备好的10X浓縮液，下同) IOO毫升N6mix母液(取已经制备好的100X浓縮液，下同) IO毫升 Fe"EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓縮液，下同) IO毫升 维生素贮存液(取已经制备好的100X浓縮液，下同) IO毫升 2， 4-D贮存液(取上述制备好的) 2. 5毫升
脯氨酸(Proline) 0. 3克
CH 0.6克
蔗糖 30克 Phytagel 3克
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25 毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121'C下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的 灭菌方法相同)。 2)继代培养基 N6max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe"EDTA於存液(100X) 维生素贮存液(100X) 2， 4-D贮存液
CH
蔗糖
Phyt3gel
IOO毫升 IO毫升 IO毫升 IO毫升 2. O毫升 0. 5克 0. 6克 30克 3克
加蒸馏水至900毫升，1N氧氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25 毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
3) 预培养基
N6max母液(10X) 12. 5毫升
N6mix母液(100X) 1. 25毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X) 2. 5毫升
维生素贮存液(100X) 2.5毫升
2， 4-D贮存液 0. 75毫升
CH 0. 15克
蔗糖 5克
琼脂粉 1.75克 加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升 /皿)。
4) 共培养基
N6max母液(10X) 12. 5毫升
N6mix母液(100X) 1.25毫升
Fe2+EDTA je存液(100X) 2. 5毫升
维生素贮存液(100X) 2.5毫升
2， 4-D贮存液 0. 75毫升
CH 0.2克
蔗糖 5克
琼脂粉 1.75克加蒸馏水至250毫升，IN氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/ 每皿)。
5) 悬浮培养基
N6max母液(10X) 5毫升 N6mix母液(100X) 0. 5毫升
Fe2'EDTA Jt存液(100X) 0. 5毫升
维生素贮存液UOOX) l毫升 2， 4-D C:存液 0. 2毫升
CH 0.08克
蔗糖 2克
加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。 使用前加入l毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。
6) 选择培养基
25毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 625毫升
0. 15克 7.5克
1. 75克
加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，加入250微升HN (50毫克/毫升)和400微升CN (250毫克/毫升)分装倒入培养皿 中(25毫升/皿)。(注第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养 基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。
7) 预分化培养基 N6max母液(10X) N6mix母液(100X) Fe2tEDTA !C存液(100X) 维生素贮存液(100X) 6-BA贮存液 KT贮存液 NM贮存液 IAA贮存液 CH 蔗糖 琼脂粉
N6隨母液(10X)
N6mix母液GOOX)
Fe2'EDTA JC存液(100X)
维生素贮存液(100X)
2, 4-D lt存液CH
蔗糖
琼脂粉
25毫升 2.5毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 5毫升 0. 5毫升 50微升 50微升 0. 15克 7. 5克 1.75克
加蒸馏水至250毫升，1 N氢氧化钾调节pH值到5. 9,封口，按上述方法灭菌。 使用前溶解培养基，250微升HN (50毫克/毫升)250微升CN (250毫克/毫升) 毫升/皿)。 8)分化培养基
N6max母液(10X) IOO毫升 N6mix母液(100D IO毫升
分装倒入培养皿中(25Fe"EDTA贮存液(100X) IO毫升 维生素贮存液(100X) IO毫升 6-BA贮存液 2毫升 KT ti存液 2毫升 NM !C存液 0. 2毫升
IAA C:存液 0. 2毫升
C H l克 蔗糖 30克 Phytagel 3克 加蒸馏水至900毫升，1 N氢氧化钾调节pH值到6. 0。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。 9)生根培养基
MSmax母液(10X) 50毫升 MSmix母液(100X) 5 Fe2+EDTA Jt存液(100X) 5 维生素贮存液(100X) 5 蔗糖 2 Phytagel 3 加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5. 8。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升Z管)，封口，按上述方法灭菌。 (4)农杆菌介导的遗传转化步骤 4. 1愈伤诱导
1) 将成熟的Ballila水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0. 15%氯化汞(HgCl2)种子 表面消毒15分钟；
2) 用灭菌水洗种子4-5次；
3) 将种子放在诱导培养基上；
4) 将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25士rC。 4. 2愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25土rc。 4. 3预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25土rc。 4.4农杆菌培养
1) 在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南， 第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002,北京)上预培养农杆菌f朋705 (该菌株来自CAMBIA公 司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28'C;
2) 将农杆菌转移至悬浮培养基里，28'C摇床上培养2-3小时。 4. 5农杆菌侵染
1) 将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；
2) 调节农杆菌的悬浮液至OD咖0.8-1.0;
3) 将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；
4) 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-2(TC。 4. 6愈伤洗漆和选择培养
1) 灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
2) 浸泡在含400毫克/L潮霉素的灭菌水中30分钟；
S毫新魄克3) 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
4) 转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。 4.7分化
1) 将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；
2) 转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26'C。 4.8生根
1)剪掉分化时产生的根
然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26°C 。 4.9移栽
洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
本发明共获得独立转基因T。代水稻植株33株，包括29株阳性单株和4株阴性单株。所获得的1\代 水稻植株以B10家系为例，包括15株阳性单株和14株阴性单株。
转基因水稻阳性和阴性植株小穗育性(图5)差异显著(f7.4, /M).0000);转基因水稻阴性植株小 穗平均育性(53.3%)远高于转基因水稻阳性植株2. 8%的小穗育性。申请人亦检测了 T。代转基因水稻植株 的胚囊育性和花粉育性，其中花粉育性在转基因阳性和阴性水稻植株中无显著差异(见图6)，而转基因阴 性植株胚囊育性显著高于转基因阳性植株胚囊育性(图7) (t=12.33， P=0.0000)。 T。代转基因阳性植株和 转基因阴性植株以及T,代转基因阳性植株和转基因阴性植株胚囊育性、花粉育性和小穗育性如图8所示， 结果表明本发明克隆的粳型杂种育性基因5fj参与决定粳稻和籼稻亚种间杂交后代的雌配子育性，将导 致胚囊败育，进而导致杂种育性降低。
3.含有S5基因区段的DNA片段的分离克隆
分别使用cDNA末端快速扩增(RACE)和PCR引物延伸的方法获得该基因全长cDNA。使用材料为籼稻 南京ll，粳稻Ballila和广亲和品种02428幼穗发育的五期叶片，液氮冷冻后于-7(TC冰箱待用。按照TRIZ0L 说明书所述步骤提取RNA (注TRIZOL Reagent, Invitrogen Cat. No. 15596-018),稀释浓度至1 y g/ti 1 ， -70(保存待用。
RACE具体步骤使用Clontech的SMART RACE cDNA Amplification Kit,步骤参照该试剂盒说明书。 5'端RACE引物S5-GSP1: CCGTTCCMCCAGMTAGTCGTGCT
S5-Rl: ACCCGAACATGAGATCCAT缀CGA 3，端RACE引物S5~GSP2: MGATGGTGACAGACACGCTGAGGA
S5-RACE4: CMTCMCAGGCCAACCTACTCAC UPM: Long (0.4M): CTMTACGACTCACTATAGGGCMGCAGTGGTA TCAA CGCAGAGT
Short (2uM): CTMTACGACTCACTATAGGGC NUPM: MGCAGTGGTATCMCGCAGAGT 其中UPM和NUPM由上述试剂盒提供。 第一轮PCR反应条件 94。C变性30秒，72'C3分钟，5个循环； 94。C变性30秒，7(TC退火30秒，72。C延伸3分钟，5个循环； 94'C变性30秒，65'C退火30秒，72'C延伸3分钟，27个循环； 72'C最终延伸10分钟。 5， 1 ^￡使用引物1^11+ S5-GSP1 3'貼〔￡使用引物1) 11+ S5-GSP2 第二轮PCR反应条件 94'C预变性4分钟；
1194'C变性1分钟，59'C退火1分钟，72'C延伸1分钟20秒，35个循环；
72'C最终延伸IO分钟。
5' 1^ ^使用引物1 ^11+ S5-Rl
3' 1^0￡使用引物1^^+ S5-RACE4
PCR引物延伸具体步骤反转录釆用20y 1体系，按照DNaseI说明书所述步骤去除RNA中痕量DNA 后，按Superscript II说明书所述步骤操作，产物于-2(TC保存待用。(注Deoxyribonuclease I， Invitrogen Cat. No. 18068-015; Superscript II Reverse Transcriptase ， Invitrogen Cat. No. 18064-022)使用上述反转录产物1 u 1为模板做PCR。使用Tafera & r邵(Takara code: DRR01AM)做 PCR, PCR所用试剂均来自7Mara & 7ag包装。
PCR所用引物如下 F5-3: ATCMCCCATTTCCTTTCCTACG F5-2: CTGCCCCTGAGCMGCAAGAAAG F19-3: AGCCGACGACGAGTTGGAGTGT 5F2: CCMGATCTGCCGACGACGAGTTGGAGTGT BDF2: GACGACGAGTTGGAGTGT S5-F11: CAGCCGACGACGAGTTGGAGT S5-F2: GTGCGGCGAGCTGAGGTACGAT S5-GSP2: MGATGGTGACAGACACGCTGAGGA S5-RACE4: CAATCMCAGGCCMCCTACTCAC Rll: ATGTGTAGGATCTGCCGGGATCGA 臓CATTAGGMCAGGMGTCGT S5-R11: CTCTGCCCGTTGGCGATMGC S5-R2: TCTGGGTGGCAAAGCGAGTGC S5—R33: ATGGCGGCACGGTCGTATCTT
R3--1ACGTAAACATCTAGTAGTGGCTCA
R3-2TTGGCACGAACGGTTCMGAG
R3--3GATCAGTTATTTGGGCAAACCAG
R3--4GGTCCCAAATCMGTACCGCTAG
R3--5GCTCAACMTTAGGACATACGAt
分别对RACE产物和PCR产物测序获得所需全长基因。
实施例2: 55基因在水稻不同亚种的结构分析
对实施例1中测序得到的序列进行分析水稻品种02428 (广亲和)、Ballila (粳稻)和南京11 (籼 稻)的全长cDNA分别是1778bp、 1912bp和1911bp，其结构由三个外显子和两个内含子组成(图9)。籼 稻和粳稻有且仅有三个碱基的差异，其中南京11在3'非翻译区有一个单碱基的缺失，南京11和Ballila 在编码区有两个单碱基多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),这两个SNP在编码蛋白中形 成两个错义突变(图10) 。 M基因编码一个472氨基酸的蛋白质，BLASTp分析 (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/ )表明该蛋白与天冬氨酰蛋白酶高度同源。PROSITE (http:〃丽.expasy.ch/cgi-bin/prosite/)分析发现该蛋白在第129-140个氨基酸和334-345个氨基 酸存在两个活性位点。SignalP 3.0 (http:〃www. cbs. dtu. dk/cgi-bin/)软件分析表明S5蛋白存在一 个信号肽，它在蛋白成熟过程中被切除。
实施例3:利用芯片数据检测S5基因在水稻全生育期中表达水平
本发明禾,芯片数据(Database of the National Center of Plant Gene Research, available at
12http:〃cr印.ncpgr.cn/.)检测53基因在水稻全生育期不同组织中表达水平，使用的芯片数据包括籼稻Zhenshan 97和Minghui 63不同生长时期下的25种不同组织(表3)的表达谱(图11)。结果表明55基因在全生育期都极低水平表达。
表J_芯片数据对应水稻组织名称_
1 Calli:15 day after induction
2 Resistant calli-screening stage
3 Seed: germination (72 h after imbibition)
4 Seedling: 3 days after sowing
5 Seedling: trefoil stage
6 Shoot: seedling with 2 tillers
7 Root: seedling with 2 tillers
8 Panicle: secondary branch primordium differentiation stage
9 Leafr secondary branch primordium differentiation stage
10 Sheath: secondary branch primordium differentiation stage
11 Panicle: 4-5 cm young panicle
12 Leaf: 4-5 cm young panicle
13 Shea>th: 4-5 cm young panicle
14 Panicle: pistil/staiDen primordium differentiation stage
15 Panicle: pollen-mother cell formation stage
16 Stem: 5 days before heading
17 Flag leaf: 5 days before heading
18 Stem: heading stage
19 Panicle: heading stage
20 Glume: one day before flowering
21 Stamen: one day before flowering
22 Spikelet: 3 days after pollination
23 Endosperm: 7 days after pollination
24 Endosperm: 14 days after pollination
25 Endosperm: 21 days after pollination实施例4: S5蛋白具有天冬氨酰蛋白酶活性
天冬氨酰蛋白酶在酸性条件下被激活且其活性为p印statin A所抑制(Rawlings ND， Barrett AJ (1995)Families of aspartic peptidases, and those of unknown catalytic mechanism. Methods Enzymol.248:105-20)。而本发明基因与天冬氨酰蛋白酶高度同源，为了验证本发明基因S5是否编码一个典型的天冬氨酰蛋白酶，本实例设计一个体外实验来验证S5蛋白是否具有这一功能。
具体实施步骤为
(1) 原核表达载体构建
设计引物5F1 (5， - GGGAGATCTATGGTGATCTTGGAGCAGCCA-3，， 接头加BglII酶切位点)和5R (5，-AGGCTCGAGCGACGATCAGCAMCGGCA-3， 接头加Xhol酶切位点)，以日本晴全长cDNA (来自北京凯拓公司)为模板PCK扩增全长。PCR扩增反应所用的试剂来自Takara公司。反应条件为；94°C, 5min; 94°C， 1 min,59°C， 1 min, 72'C, 1.5min, 30 cycles; 72°C, 5 min。产物构建到PGEM ~T (购自Promega)载体中，测序验证。然后分别将外源构建到pMAL-c2x载体中(购自载体用BamHI和Xhol酶切。
(2) 蛋白诱导表达将构建好的表达载体转化表达菌株BL21 (购自Invitrogen公司)，等菌液0D值达到0. 6时，加入终浓度为0. 5raM的IPTG(isopropyl 1-thio- e galactopyranoside)，然后37。C诱导表达3hrs。收集菌体，加入一倍体积的PBS悬浮，置-20 'C过夜。第二天溶解，立即放在冰上，加入终浓度为l爐的PMSF，超声处理，整个超声过程在冰上进行，以保证蛋白处于天然状态。超声处理完成之后12000rpm， 4'C冷冻离心。收集上清，用Amylose Resin (购自万io"6s)纯化。纯化步骤参照pMAL Protein Fusion and PurificationInstruction Manual, Catalog fflE8000S
(3) 蛋白酶活性检测
20ii 1 (10yg)纯化的蛋白，加入等体积的pH缓冲液与20u 1 FITC-casein(Protease FluorescentDetection Kit), 37。C下反应15小时后加入lOOul 0. 6N TCA (三氯乙酸)沉淀，12000rpm离心lOmin，吸上清100ul,加入2ml assay buffer,用荧光分光光度计(Fluorescence spectrophotometer, Hitachi850)测量。水为对照。
pH缓冲液配方
0. 1M Gly-HCl， pH2. 5
0. 1M 0.1 M sodium citrate, pH3. 0, pH3. 5, pH 4.0;0. 1M sodium acetate, pH 5.0:0. 1 M sodi咖phosphate, pH 6.0;
(4) 检测ASP是否被p印statin A抑制剂抑制
实验步骤8ug纯化的目标蛋白中加入终浓度为0.15mM p印statin A， 4°C孵育1.5小时后，加入pH=3的缓冲液至终体积40w 1，然后再加入底物FITOCasein 20 n 1 (sigma， PF0100), 37 'C下孵育12小时后，加入100y 10.6NTCA沉淀，吸上清100ul，加入2ml assay buffer，用荧光分光光度计(HitachiM850 fluorescence spectrophotometer ， Japan)测量。只含有标签MBP (麦芽糖结合蛋白)的纯化蛋白作为对照，每个做三次重复。
(5) 天冬氨酸蛋白酶的自身剪接，形成成熟蛋白的初步分析
原核表达纯化的力印iowi(20ng)，加入i/2体积的ra缓冲液，37r反应过夜，加入一倍体积的
loading buffer,水煮5min， 12%SDS-PAGE电泳,考马斯蓝染液染胶。
结果表明该蛋白在pH3.0的条件下活性最高(图12)，且被p印statin A完全抑制(图12)。实验同时表明该蛋白pH 2.5-4.0的条件下通过自身剪接，形成成熟蛋白(图13)。
上述结果表明本发明基因确实编码一个典型的天冬氨酰蛋白酶。实施例5: S5基因的表达部位
为了确定S5基因的表达部位，本实例使用了 RNA原位杂交技术。根据RNA探针杂交信号确定本发明基因在珠心、珠被、孢母细胞和小孢子母细胞中表达(图14)。
RNA原位杂交流程参见Drews (Drews GN (1998) In situ hybridization. Methods Mol Biol 82:353-71Drews GN (1998) In situ hybridization. Methods Mol Biol 82:353-71)。
14<110>〈120><130><141〉<160><170><210〉<211〉〈212><213〉<220><221><222><223>〈220〉〈221><222〉<223><220><221><222><223><220>〈221>〈222〉<223><400>
华中农业大学
粳型杂种育性基因5"fj的分离克隆及应用
2007-10-107
Patentln version 3. 11
1778■
7JC稻(0ryza sativa)
g6H6
(l).. (1778)
5'證(1441).
(1778)
3'隱(l).. (21)
CDS(22).
1
(1440)
atcaacccat ttcctttcct a cgt
Arg1
ess gaa aga犯g aa i gaa gggGin Glu Arg Lys Lys Glu Gly15
gC3 gCC gaC g8C g3g ttg gag
Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu30
gtg aac tct caa ggc gcc attVal Asn Ser Gin Gly Ala lie45
caa tgc etc cgc cca tgg tctGin Cys Leu Arg Pro Trp Ser60
ttg act gccLeu Thr Ala
attlie
tgtCys
Gin
gtcVal65
Lys Phe20ccc tccPro Ser35
ttc cccPhe Pro50
Cgt gC3
Arg Ala
tgcCys5
getAla
tccSer
ctgLeu
taa
atelie
ccc ctgPro Leu
gtg ttcVal Phe
Thr Gin
tccSer
ttcPhe
CELC
His
gC￡l
Ala70
ggcGly
gatAsp
肌g
Lys
55
tcc
Ser
eigcSer
gccAla
His40卿Lys
a^gLys10
Thr25getAla
His
teg accSer Thr
51
99
147
195
243
15ggs gca tea gga gca ggs aaa gga gga gga ttg幼c aat eta csg g犯 291Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asn Leu Gin Glu
75 80 85
gag gag ate set tea tea 3gt 3gt scs aaa stc gsc gtg stc gas gac 339Glu Glu lie Thr Ser Ser Ser Ser Thr Lys lie Asp Val lie Glu Asp90 95 100 105
age age ate aac gac ttc ctg ttc eta atg gcc gtc agt ctg ggc aag 387Ser Ser lie Asn Asp Phe Leu Phe Leu Met Ala Val Ser Leu Gly Lys
110 115 120
cca ccg gtt gtg aac ctg gtg gcg ate gac acg gga tec acc etc teg 435Pro Pro Val Val Asn Leu Val Ala lie Asp Thr Gly Ser Thr Leu Ser
125 130 135
tgg gtg cas tgc cag ccg tgc gcg gtg cac tgc cac scg csg tec gcg 483Trp Val Gin Cys Gin Pro Cys Ala Val His Cys His Thr Gin Ser Ala
140 145 150
aag gcc ggc ccg ata ttc gat ccc ggc aga tec tac aca tec egg cga 531Lys Ala Gly Pro lie Phe Asp Pro Gly Arg Ser Tyr Thr Ser Arg Arg
155 160 165
gtt cgc tgc teg teg gtc犯g tgc ggc gag ctg agg tac gat ctg egg 579Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg Tyr Asp Leu Arg170 175 180 185
etc csg caa gcc sat tgc 3tg gsg aag g33 gac 3gc tgc 3cg t3C age 627Leu Gin Gin Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu Asp Ser Cys Thr Tyr Ser
190 195 200
gtc acg tac ggg sac ggg tgg gcg tac age gtg ggc犯g atg gtg aca 675Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp Ala Tyr Ser Val Gly Lys Met Val Thr
205 210 215
gac acg ctg agg att ggg gac teg ttt atg gat etc atg ttc ggg tgc 723Asp Thr Leu Arg lie Gly Asp Ser Phe Met Asp Leu Met Phe Gly Cys
220 225 230
age atg gat gtc aag tac age gaa ttc g3g gcc ggc ate ttt ggt ttc 771Ser Met Asp Val Lys Tyr Ser Glu Phe Glu Ala Gly lie Phe Gly Phe
235 240 245
ggc age age age ttc tct ttc ttc gag cag ctg gca ggg tac cct ga/t 819Gly Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe Glu Gin Leu Ala Gly Tyr Pro Asp250 255 260 265
att ctg agt tac aag gca ttc age tac tgc ttg ccc act gac gag acc 867lie Leu Ser Tyr Lys Ala Phe Ser Tyr Cys Leu Pro Thr Asp Glu Thr
270 275 280
aag ccc gga tac stg ate ctg gga aga tac gac cgt gcc gcc atg gat 915Lys Pro Gly Tyr Met lie Leu Gly Arg Tyr Asp Arg Ala Ala Met Asp
285 290 295
ggg ggt tac act cct etc ttc egg tea ate aac agg cca acc tac teaGly Gly Tyr Thr Pro Leu Phe Arg Ser lie Asn Arg Pro Thr Tyr Ser300 305 310
ctg acg atg gag atg ctt ate gcc aac ggg cag aga ttg gtg aca tcg 1011 Uu Thr Met Glu Met Leu lie Ala Asn Gly Gin Arg Leu Val Thr Ser
315 320 325
tct tcg gag atg ate gtc gat tec ggg gcc cag agg acg tec ctg tgg 1059 Ser Ser Glu Met lie Val Asp Ser Gly Ala Gin Arg Thr Ser Leu Trp 330 335 340 345
cct tec act ttt get etc ctt gac aag acc ate acg cag gca atg tcg 1107 Pro Ser Thr Phe Ala Leu Leu Asp Lys Thr lie Thr Gin Ala Met Ser
350 355 360
tcg att ggg tat cac egg aca tea aga gcg cgc caa gaa tea tac ate 1155 Ser lie Gly Tyr His Arg Thr Ser Arg Ala Arg Gin Glu Ser Tyr lie
365 370 375
tgc tac tta tcg gag cac gac tat tct ggt tgg aac ggc acc ate acg 1203 Cys Tyr Leu Ser Glu His Asp Tyr Ser Gly Trp Asn Gly Thr lie Thr
380 385 390
ccc ttc tec aac tgg tec gcc ttg cct ctg ctg gag ate ggc ttc gcc 1251 Pro Phe Ser Asn Trp Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu lie Gly Phe Ala
395 400 405
ggc ggt get gca etc get ttg cca ccc aga aac gtc ttc tac犯c gat 1299 Gly Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Arg Asn Val Phe Tyr Asn Asp 410 415 420 425
cca cac cgc ggt ttg tgc atg acc ttt get cag aat cct get etc agg 1347 Pro His Arg Gly Leu Cys Met Thr Phe Ala Gin Asn Pro Ala Leu Arg
430 435 440
tct cag ata ctg ggg aac agg gtt act cga tec ttc gga aca acc ttc 1395 Ser Gin lie Leu Gly Asn Arg Val Thr Arg Ser Phe Gly Thr Thr Phe
445 450 455
gac ate cag ggg aaa caa ttc ggc ttc aaa tat gcc get tgc tga 1440 Asp lie Gin Gly Lys Gin Phe Gly Phe Lys Tyr Ala Ala Cys
460 465 470
tegtcgatta ttcctcatcc tatgatatat cttatagctt gegggtcgat taattagctg 1500 gtttgcccaa ataactgatc ggattggagt cttctcccgc gctacactac ccctagctgc 1560 gategtatea caagctagcg gtacttgatt tgggacctaa ttcgttcaaa aaaaacttgg 1620 cagcttaatt tgggacctag tagctagctg agccactact agatgtttac gtaccagcta 1680 tccgtcgttt gtttgtgtct cctgtgcttg tgetaaaect atctcttgaa ccgttcgtgc 1740 caacttaatt atttggtcgt atgtcctaat tgttgatc 1778 〈210〉 2 〈211〉 21 〈212〉 PRT
〈213〉 水稻(Oryza sativa) 〈400〉 2
Arg Leu Thr Ala Cys Leu Pro Leu Ser Lys Gin Glu Arg Lys Lys Glu 15 10 15Gly lie Lys Phe Ala 20
〈210〉 3
〈211> 450
<212> PRT
<213> 水稻(0ryza sativa)
<400> 3
Ser Gly AlaThrAlaAlaAspAspGluLeuGluCysProSerSerlie
151015
Phe Asp HisAlaValAsnSerGinGlyAlalieGinPheProValPhe
202530
His Lys LysHisGinCysLeuArgProTrpSerValArgAlaThrGin
354045
Ala Ser SerThrGlyAlaSerGlyAlaGlyLysGlyGlyGlyLeuAsn
505560
Asn Leu GinGluGluGlulieThrSerSerSerSerThrLyslieAsp
65707580
Val lie GluAspSerSerlieAsnAspPheLeuPheLeuMetAlaVal
859095
Ser Leu GlyLysProProValValAsnLeuValAlalieAspThrGly
100105110
Ser Thr LeuSerTrpValGinCysGinProCysAlaValHisCysHis
115120125
Thr Gin SerAlaLysAlaGlyProliePheAspProGlyArgSerTyr
130135140
Thr Ser ArgArgValArgCysSerSerValLysCysGlyGluLeuArg
145150155160
Tyr Asp LeuArgLeuGinGinAlaAsnCysMetGluLysGluAspSer
165170175
Cys Thr TyrSerValThrTyrGlyAsnGlyTrpAlaTyrSerValGly
180185190
Lys Met ValThrAspThrLeuArglieGlyAspSerPheMetAspLeu
195200205
Met Phe GlyCysSerMetAspValLysTyrSerGluPheGluAlaGly
210215220
lie Phe GlyPheGlySerSerSerPheSerPhePheGluGinLeuAla
225230235240
Gly Tyr ProAsplieLeuSerTyrLysAlaPheSerTyrCysLeuPro
245250255
Thr Asp GluThrLysProGlyTyrMetlieLeuGlyArgTyrAspArg
260265270
Ala Ala MetAspGlyGlyTyrThrProLeuPheArgSerlieAsnArg
275280285
Pro Thr TyrSerLeuThrMetGluMetLeulieAlaAsnGlyGinArg
18290
Leu Val Thr Ser Ser 305
Thr Ser Leu Trp Pro 325
Gin Ala Met Ser Ser 340
Glu Ser Tyr lie Cys 355
Gly Thr lie Thr Pro 370
lie Gly Phe Ala Gly 385
Phe Tyr Asn Asp Pro 405
Pro Ala Leu Arg Ser 420
Gly Thr Thr Phe A印 435
Ala Cys 450 〈210> 4 <211> 1912 〈212>腿 〈213〉 水稻(Oryza 〈220〉
〈221〉 gene <222〉 (1)..(1912) 〈223> 〈220〉
〈221> 5' UTR <222> (1577).. (1912) <223〉 <220>
〈221 > 3'UTR 〈222> (1)..(157) 〈223> 〈220>
〈221〉 CDS
<222〉 (158).. (1576)
<223>
<400> 4
atcaacccat ttcctttcct acgtttgact gcctgcctgc ccctgagcaa gcaagaaaga 60 aagaaagaag ggattaaatt tgctcgctcc tacgaatcct gcccctgagt aacaatgact 120
Ser 310 Ser
lie
Tyr
Phe
Gly 390 His
Gin
lie
295 Glu
Thr
Gly
Leu
Ser 375 Ala
Arg
lie
Gin
Met
Phe
Tyr
Ser 360 Asn
Ala
Gly
Leu
Gly 440
lie
Ala
His 345 Glu
Trp
Leu
Leu
Gly 425 Lys
Val
Leu 330 Arg
His
Ser
Ala
Cys 410 Asn
Gin
Asp 315 Leu
Thr
Asp
Ala
Leu 395 Met
Arg
Phe
300 Ser
Asp
Ser
Tyr
Leu 380 Pro
Thr
Val
Gly
Gly
Lys
Arg
Ser 365 Pro
Pro
Phe
Thr
Phe 445
Ala
Thr
Ala 350 Gly
Leu
Arg
Ala
Arg 430 Lys
Gin
lie 335 Arg
Trp
Leu
Asn
Gin 415 Ser
Tyr
Arg 320 Thr
Gin
Asn
Glu
Val 400 Asn
Phe
Ala
sativa)
19gacttttaat ttgtttgcag ctagggtggg gatcgag atg gtg ate ttg gag cag 175
Met Val lie Leu Glu Gin 1 5
cca cag ctg etc ctt ctt ctt ctt ctt ctt gta gca get gca get gca 223 Pro Gin Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Ala Ala
10 15 20
acc ggc gcc aca gca gcc gac gac gag ttg gag tgt ccc tec tec ate 271 Thr Gly Ala Thr Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu Cys Pro Ser Ser lie
25 30 35
ttc gat cac get gtg aac tct caa ggc gcc att cag ttc ccc gtg ttc 319 Phe Asp His Ala Val Asn Ser Gin Gly Ala lie Gin Phe Pro Val Phe
40 45 50
cac aag aag cac caa tgc etc cgc cca tgg tct gtc cgt gca acc cag 367 His Lys Lys His Gin Cys Leu Arg Pro Trp Ser Val Arg Ala Thr Gin 55 60 65 70
gca tec teg acc gga gca tea gga gca gga aaa gga gga gga ttg aac 415 Ala Ser Ser Thr Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn
75 80 85
aat eta cag gaa gag gag ate act tea tea agt agt aca aaa ate gac 463 Asn Leu Gin Glu Glu Glu lie Thr Ser Ser Ser Ser Thr Lys lie Asp
90 95 100
gtg ate gaa gac age age ate aac gac ttc ctg ttc eta atg gcc gtc 511 Val lie Glu Asp Ser Ser lie Asn Asp Phe Leu Phe Leu Met Ala Val
105 110 115
agt ctg ggc犯g era ccg gtt gtg aac ctg gtg gcg ate gac acg gga 腳 Ser Leu Gly Lys Pro Pro Val Val Asn Leu Val Ala lie Asp Thr Gly
120 125 130
tec acc etc teg tgg gtg caa tgc cag ccg tgc gcg gtg cac tgc cac 607 Ser Thr Leu Ser Trp Val Gin Cys Gin Pro Cys Ala Val His Cys His 135 140 145 150
acg cag tec gcg etag gcc ggc ccg ata ttc gat ccc ggc aga tec tac 655 Thr Gin Ser Ala Lys Ala Gly Pro lie Phe Asp Pro Gly Arg Ser Tyr
155 160 165
aca tec egg cga gtt cgc tgc teg teg gtc aag tgc ggc gag ctg agg 703 Thr Ser Arg Arg Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg
170 175 180
tac gat ctg egg etc cag caa gcc aat tgc atg gag aag gaa gac age 751 Tyr Asp Leu Arg Leu Gin Gin Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu Asp Ser
185 190 195
tgc acg tac age gtc acg tac ggg aac ggg tgg gcg tac age gtg ggc 799 Cys Thr Tyr Ser Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp Ala Tyr Ser Val Gly
200 205 210
aag atg gtg aca gac acg ctg agg att ggg gac teg ttt atg gat etc 847 Lys Met Val Thr Asp Thr Leu Arg lie Gly Asp Ser Phe Met Asp Leuatg ttc ggg tgc 3gc 3tg gat gtc卿tsc ￡tgc gaa ttc gag gcc ggc 舰
Met Phe Gly Cys Ser Met Asp Val Lys Tyr Ser Glu Phe Glu Ala Gly
235 240 245
ate ttt ggt ttc ggc age age age ttc tct ttc ttc gag cag ctg gca 943 lie Phe Gly Phe Gly Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe Glu Gin Leu Ala
250 255 260
ggg tac cct gat att ctg agt tac aag gca tta age tac tgc ttg ccc 991 Gly Tyr Pro Asp lie Leu Ser Tyr Lys Ala Leu Ser Tyr Cys Leu Pro
265 270 275
act gac gag acc aag ccc gga tac atg ate ctg gga aga tac gac cgt 1039 Thr Asp Glu Thr Lys Pro Gly Tyr Met lie Leu Gly Arg Tyr Asp Arg
280 285 290
gcc gcc atg gat ggg ggt tac act cct etc ttc egg tea ate aac agg 1087 Ala Ala Met Asp Gly Gly Tyr Thr Pro Leu Phe Arg Ser lie Asn Arg 295 300 305 310
cca acc tac tea ctg acg atg gag atg ctt ate gcc aac ggg cag aga 1135 Pro Thr Tyr Ser Leu Thr Met Glu Met Leu lie Ala Asn Gly Gin Arg
315 320 325
ttg gtg aca tcg tct tcg gag atg ate gtc gat tec ggg gcc cag agg 1183 Leu Val Thr Ser Ser Ser Glu Met lie Val Asp Ser Gly Ala Gin Arg
330 335 340
acg tec ctg tgg cct tec act ttt get etc ctt gac aag acc ate acg 1231 Thr Ser Leu Trp Pro Ser Thr Phe Ala Leu Leu Asp Lys Thr lie Thr
345 350 355
cag gca atg tcg tcg att ggg tat cac egg aca tea aga gcg cgc caa 1279 Gin Ala Met Ser Ser lie Gly Tyr His Arg Thr Ser Arg Ala Arg Gin
360 365 370
gaa tea tac ate tgc tac tta tcg gag cac gac tat tct ggt tgg aac 1327 Glu Ser Tyr lie Cys Tyr Leu Ser Glu His Asp Tyr Ser Gly Trp Asn 375 380 385 390
ggc acc ate acg ccc ttc tec aac tgg tec gcc ttg cct ctg ctg gag 1375 Gly Thr lie Thr Pro Phe Ser Asn Trp Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu
395 400 405
ate ggc ttc gcc ggc ggt get gca etc get ttg cca ccc aga aac gtc 1423 lie Gly Phe Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Arg Asn Val
410 415 420
ttc tac aac gat cca cac cgc ggt ttg tgc atg acc ttt get cag aat 1471 Phe Tyr Asn Asp Pro His Arg Gly Leu Cys Met Thr Phe Ala Gin Asn
425 430 435
cct get etc agg tct cag ata ctg ggg aac agg gtt act cga tec ttc 1519 Pro Ala Leu Arg Ser Gin lie Leu Gly Asn Arg Val Thr Arg Ser Phe
440 445 450
gga aca acc ttc gac ate cag ggg aaa caa ttc ggc ttc aaa tat gcc 1567Gly Thr Thr Phe A印lie Gin Gly Lys Gin.Phe Gly Phe Lys Tyr Ala
455 460 465 470
gtt tgc tga tcgtcgatta ttcctcatcc tatgatatct tatagcttgc 1616
Val Cys
gggtcgatta attagctggt ttgccc犯st aactgatcgg attgg3gtct tctcccgcgc 1676 tacactaccc ctagctgcga tcgtatcaca agctagcggt acttgatttg ggacctaatt 1736 cgttcaaaaa aaacttggca gctt幼tttg ggacctagta gctagctgag ccactactag 1796 atgtttacgt accagctatc cgtcgtttgt ttgtgtctcc tgtgcttgtg ctaaacctat 1856 ctcttgaacc gttcgtgcca acttaattat ttggtcgtat gtcctaattg ttgatc 1912 〈210〉 5 〈211> 472 <212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa) <400> 5
Met Val lie Leu Glu Gin Pro Gin Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
15 10 15
Val Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Thr Ala Ala Asp Asp Glu Leu
20 25 30
Glu Cys Pro Ser Ser lie Phe Asp His Ala Val Asn Ser Gin Gly Ala
35 40 45
lie Gin Phe Pro Val Phe His Lys Lys His Gin Cys Leu Arg Pro Trp
50 55 60
Ser Val Arg Ala Thr Gin Ala Ser Ser Thr Gly Ala Ser Gly Ala Gly 65 70 75 80
Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asn Leu Gin Glu Glu Glu lie Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Lys lie Asp Val lie Glu Asp Ser Ser lie Asn Asp Phe
100 105 110
Leu Phe Leu Met Ala Val Ser Leu Gly Lys Pro Pro Val Val Asn Leu
115 120 125
Val Ala lie Asp Thr Gly Ser Thr Leu Ser T卬Val Gin Cys Gin Pro
130 135 140
Cys Ala Val His Cys His Thr Gin Ser Ala Lys Ala Gly Pro lie Phe 145 150 155 160
Asp Pro Gly Arg Ser Tyr Thr Ser Arg Arg Val Arg Cys Ser Ser Val
165 170 175
Lys Cys Gly Glu Leu Arg Tyr Asp Leu Arg Leu Gin Gin Ala Asn Cys
180 185 190
Met Glu Lys Glu Asp Ser Cys Thr Tyr Ser Val Thr Tyr Gly Asn Gly
195 200 205
Trp Ala Tyr Ser Val Gly Lys Met Val Thr Asp Thr Leu Arg lie Gly
210 215 220
Asp Ser Phe Met Asp Leu Met Phe Gly Cys Ser Met Asp Val Lys Tyr225 Ser
Phe
Leu
Leu
Phe 305 lie
Asp
Leu
Thr
Asp 385 Ala
Leu
Met
Arg
Glu
Phe
Ser
Gly 290 Arg
Ala
Ser
Asp
Ser 370 Tyr
Leu
Pro
Thr
Val 450
Phe
Glu
Tyr 275 Arg
Ser
Asn
Gly
Lys 355 Arg
Ser
Pro
Pro
Phe 435 Thr
Glu
Gin 260 Cys
Tyr
lie
Gly
Ala 340 Thr
Ala
Gly
Leu
Arg 420 Ala
Arg
Ala 245 Leu
Leu
Asp
Asn
Gin 325 Gin
lie
Arg
Trp
Leu 405 Asn
Gin
Ser
230 Gly
Ala
Pro
Arg
Arg 310 Arg
Arg
Thr
Gin
Asn 390 Glu
Val
Asn
Phe
lie
Gly
Thr
Ala 295 Pro
Leu
Thr
Gin
Glu 375 Gly
lie
Phe
Pro
Gly 455
Phe Gly Phe Lys Tyr Ala Val465470
〈210〉6
<211〉1911
<212〉■
<213〉tK稻(Oryza sativa)
<220>
<221>g6I16
<222>(l)..(则
〈223〉
〈220>
<221>5'UTR
<222〉(1577).. (1911)
<223〉
〈220>
Phe
Tyr
Asp 280 Ala
Thr
Val
Ser
Ala 360 Ser
Thr
Gly
Tyr
Ala 440 Thr
Cys
Gly
Pro 265 Glu
Met
Tyr
Thr
Leu 345 Met
Tyr
lie
Phe
Asn 425 Leu
Phe 250 Asp
Thr
Asp
Ser
Ser 330 Trp
Ser
lie
Thr
Ala 410 Asp
235 Gly
lie
Lys
Gly
Leu 315 Ser
Pro
Ser
Cys
Pro 395 Gly
Pro Arg Ser Thr Phe Asp
240
Ser Ser Ser Phe Ser 255
Leu Ser Tyr Lys Ala 270
Pro Gly Tyr Met lie 285
Gly Tyr Thr Pro l>eu 300
Thr Met Glu Met Leu 320
Ser Glu Met lie Val 335
Ser Thr Phe Ala Leu 350
lie Gly Tyr His Arg 365
Tyr Leu Ser Glu His 380
Phe Ser Asn Trp Ser 400
Gly Ala Ala Leu Ala 415
His Arg Gly Leu Cys 430
Gin lie Leu Gly Asn 445
lie Gin Gly Lys Gin 460
23<221〉 <222> <223> <220〉 〈221> 〈222> <223〉 <400>
3'UTR (l).. (157)
CDS
(158).. (1576) 6
atcaacccat ttcctttcct acgtttgact gcctgcctgc ccctgagcaa gcaagaaaga aag肌agaag ggattaaatt tgctcgctcc tacgaatcct gcccctgagt aacaatgact gactttt组ttgtttgc3g ctsgggtggg g3tcgag atg gtg 3tc ttg gag cag
Met Val lie Leu Glu Gin
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acc Thr
ttc Phe
His 55 gca Ala
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gtg Val
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3Cg
Thr
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Gin
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Asp 40 a^g Lys
tec Ser
eta Leu
ate lie
ctg Leu 120 acc Thr
ctg Leu
gcc
Ala
25
cac
His
犯g Lys
teg Ser
Gin
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etc Leu
etc Leu 10
Thr
get AlaC3C
His
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gas
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90
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Asp
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teg Ser
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aca tec egg cga gtt
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tgc
Cys
60
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gtg Val 140 gcc Ala
ctt Leu
gsc Asp
tct
Ser
45
etc
Leu
tea Ser
ate lie
ate lie
gtt Val 125 caa Gin
ctt Leu
gsc
Asp
30
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Gin
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gga Gly
act Thr
aac Asn 110 gtg Val
tgc Cys
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15
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Gin
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ctg Leu
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cgc tgc teg teg gtc
1
Val
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65
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gtg Val
tgc Cys 145 gat Asp
Ala
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cag
Gin
50
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gga Gly
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gcg Ala 130 gcg Ala
get Ala
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Phe
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gtg Val
gca
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20
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Ala
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gsc Asp
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tec Ser
gtg Val
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Leu
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Thr
tgc Cys
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aag tgc ggc gag ctg
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a/tc lie
ttc Phe
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Asn
gac Asp
gtc Val
Gly
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60 120 175
223
271
319
367
415
463
511
559
607
655
703Thr Ser Arg Arg Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg
170 175 180
tac gat ctg egg etc cag caa gcc aat tgc atg gag aag gaa Tyr Asp Leu Arg Leu Gin Gin Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu
185 190 tgc acg tac age gtc ￡icg tac ggg犯c ggg tgg Cys Thr Tyr Ser Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp
犯g Lys 215 3tg Met
acg Thr 200 atg Met
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ttg Leu
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ate lie
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Gin 325 cag Gin
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鄉
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799
847
895
943
991
1039
1087
1135
1183
1231
1279
1327
1375
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C3g
Gin
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gcc Ala 470
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gggtcgatt3 attsgctggt ttgeccasett sactgstegg tacactaccc ctagctgcga tcgtatcaca agctagcggt cgttc肪犯3 aacttggcsg cttaatttgg gacctagtag tgtttacgta ccagctatcc gtcgtttgtt tgtgtctcct tcttgaaccg ttcgtgccaa cttaattatt tggtcgtatg <210> 7
<211> 472 <212> PKT 〈213〉 水稻 <400> 7 Met Val lie
(Oryza sativa) Leu Glu Gin Pro
1
Val
Glu
lie
Ser
65
Lys
Ser
Leu
Val
Cys
Ala
Cys
Gin
50
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Gly
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Phe
Ala 130 Ala
Ala
Pro
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Arg
Gly
Thr
Leu 115 lie
Val
Ala
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Ser
lie
lie
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1423
1471
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1567
1616
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acttgatttg ggacctaatt 1736
ctagctgagc cactactaga 1796
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Gly
Gly
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Phe
Phe
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Tyr 275 Arg
Ser
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Gly
Lys 355 Arg
Ser
Pro
Pro
Phe 435 Thr
Phe
Arg
Glu 180 Glu
Ser
Met
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Gin 260 Cys
Tyr
lie
Gly
Ala 340 Thr
Ala
Gly
Leu
Arg 420 Ala
Arg
Lys
Ser 165 Leu
Asp
Val
Asp
Ala 245 Leu
Leu
Asp
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Gin 325 Gin
lie
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Trp
Leu 405 Asn
Gin
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150 Tyr
Arg
Ser
Gly
Leu 230 Gly
Ala
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Arg
Arg 310 Arg
Arg
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Asn 390 Glu
Val
Asn
Phe
Ala 470
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Tyr
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Lys 215 Met
lie
Gly
Thr
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Leu
Thr
Gin
Glu 375 Gly
lie
Phe
Pro
Gly 455 Ala
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Asp
Thr 200 Met
Phe
Phe
Tyr
Asp 280 Ala
Thr
Val
Ser
Ala 360 Ser
Thr
Gly
Tyr
Ala 440 Thr
Cys
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Gly
Gly
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Phe
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Ser
Thr
Cys
Phe 250 Asp
Thr
Asp
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Ser 330 Trp
Ser
lie
Thr
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Arg
Phe
155 Val
Leu
Val
Asp
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lie
Lys
Gly
Leu 315 Ser
Pro
Ser
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Pro 395 Gly
Pro
Ser
Asp
Arg
Gin
Thr
Thr 220 Met
Ser
Leu
Pro
Gly 300 Thr
Ser
Ser
lie
Tyr 380 Phe
Gly
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Gin
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Cys
Gin
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Asp
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Ser
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Met
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Gly 365 Leu
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Ala
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lie 445 Gin
Ser
Ala 190 Gly
Arg
Val
Ser
Tyr 270 Tyr
Thr
Glu
Met
Phe 350 Tyr
Ser
Asn
Ala
Gly 430 Leu
Gly
Ser 175 Asn
Asn
lie
Lys
Phe 255 Lys
Met
Pro
Met
lie 335 Ala
His
Glu
Trp
Leu 415 Leu
Gly
Lys
160 Val
Cys
Gly
Gly
Tyr 240 Ser
Ala
lie
Leu
Leu 320 Val
Leu
Arg
His
Ser 400 Ala
Cys
Asn
Gin
权利要求
1、分离克隆的粳型杂种育性基因S5-j，它是(a)SEQ ID NO2中第1-1912位所示的核苷酸序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的核苷酸序列，或(c)序列中替换、缺失、或添加一个或几个核苷酸形成的具有相同基因功能的核苷酸序列。
2、 权利要求l所述的基因在水稻杂交育种和改良中的应用。。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻粳型杂种育性基因S5-j的分离克隆、功能验证及其在改良水稻中的应用。本发明包括粳型杂种育性基因的DNA序列和其编码的天冬氨酰蛋白酶。水稻籼稻和粳稻两个亚种之间具有比水稻品种间更强的杂种优势，但籼粳亚种间杂种的不育性却限制了对其杂种优势的利用。本发明克隆的粳型杂种育性基因对克服水稻籼粳亚种间杂种的不育性起重要作用。
文档编号C12N15/29GK101649322SQ20091014886
公开日2010年2月17日 申请日期2007年10月15日 优先权日2007年10月15日
发明者丁寄花, 刘克德, 张启发, 欧阳亦聃, 陈炯炯 申请人:华中农业大学