一种利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法
【专利摘要】本发明属于水稻遗传改良与生物技术应用，具体涉及一种利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法。其方法包括如下步骤：S1.野生稻基因组DNA的提取；S2.DNA导入；S3.筛选性状具有变异的植株；S4.对筛选的变异植株进行分子鉴定。本发明提供了一种切实可行的创新水稻种质的途径，将野生稻DNA导入粳型水稻，获得具有野生稻性状的导入后代材料，其导入效率高达6.8%、变异广泛，选择群体大，缩短育种年限，适合育种需要，且稳定快，导入的第3代就稳定了，创制的新种质可以作为粳稻育种的亲本材料利用或经定向选育后成为新品种应用于水稻生产。
【专利说明】一种利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水稻遗传改良与生物技术应用，具体涉及一种利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法。
【背景技术】
[0002]水稻是世界上重要的粮食作物，全球约站50%的人口以稻米为主粮，我国是世界上最大的水稻生产和消费国，播种面积和产量占我国粮食作物的首位。水稻在驯化为栽培稻和栽培稻现代育种过程中，由于选择压力和追求高产，造成许多基因丢失，现代栽培品种的遗传基础日趋狭窄和单一，未来的育种工作能否取得持续进展和突破，很大程度上取决于种质资源的利用。
[0003]野生稻在长期的自然选择过程中形成了无数特异优良性状和遗传多样性，是水稻育种的宝贵遗传资源。Sun的研究发现，栽培稻的等位基因数约为野生稻的60%，国际水稻所(IRRI)的研究表明，从野生稻中寻找抗性基因的机会比栽培稻多约50倍，而且野生稻中还含有与产量性状有关的QTL基因，是水稻育种新基因的主要来源之一。然而由于野栽杂交的不亲和性，且优劣性状连锁遗传、后代疯狂分离，使得野生稻与栽培稻杂交育种难度大，时间长。
[0004]《水稻分子育种法一穗茎注射法》中公开了穗茎注射法导入外源DNA在黑麦中获得转基因植株后，Croughan.T.P等立即在水稻上获得了外源质粒转基因植株(1988，1989)。我国黄兴奇、周建林等报道用穗茎注射法将动旺谷、云南野生稻及稗草等材料的总DNA导入水稻品种，获得了一批性状变异并稳定遗传的材料。目前粳型水稻栽培品种的遗传基础狭窄、抗逆性差，野生稻与粳型栽培稻杂交存在花期不遇、杂交不结实、杂交后代不育等问题，利用野生稻改良粳型水稻育种难度大，时间长。进行野生稻的DNA导入粳型水稻栽培品种的技术研究，利用穗颈`节导入法，将江西普通野生稻的DNA片段导入宁夏水稻栽培品种，创新粳稻种质和育种新方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法。
[0006]本发明利穗茎节导入法，将普通野生稻(AA)DNA导入宁夏水稻栽培品种宁粳16号和宁粳23号，创造粳稻育种新材料和新方法。宁夏水稻栽培品种宁粳16号和宁粳23号，这两个品种由宁夏农林科学院农作物研究所利用常规育种方法选育而成，分别于1995年和2002年通过宁夏自治区品种审定定名。
[0007]本发明一种利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法，包括如下步骤:
[0008]S1.野生稻基因组DNA的提取
[0009](a)剪取孕穗期的叶片5g放入50ml研钵；
[0010](b)向步骤(a)的研钵中加入液氮,每次加入50ml,总共3次到4次,快速研磨成细粉，将细粉倒入50ml塑料离心管；[0011](C)向步骤(b)的离心管中加入预热提取缓冲液25ml及β -巯基乙醇25 μ 1，混匀后65°C水浴30min ；
[0012](d)向步骤(c)的离心管中加5mol/L醋酸钾溶液5ml，温和混匀，冰浴20min ；
[0013](e)向步骤(d)的离心管中加入等体积氯仿和异戊醇混合液，氯仿与异戊醇的体积比为 24:1，在 4°C 4500 Xg 离心 15min ；
[0014](f)吸出步骤(e)中的上清液,加_20°C预冷的等体积异丙醇,静止3min-5min至出现白色DNA线团；
[0015](g)挑起步骤(f)中DNA线团，70%乙醇洗涤，晾干，溶于0.1ml 1XSSC，4°C保存；
[0016]S2.DNA 导入
[0017]在孕穗后期，花粉发育到单核中晚期，外部形态表现为穗顶部离剑叶叶枕2cm，利用微量注射器将DNA导入水稻穗颈节，从上向下呈45度角刺入穗下颈节处，注入DNA液，DNA浓度为400 μ g/ml，缓冲液为添加了 2mg/ml CaClJ^0.1 X SSC缓冲液，注射时间为上午9点至上午10点，每株导入10 μ 1，重复导入3次；待导入株成熟后分别收获导入穗，下年种植选择变异株；
[0018]S3.筛选性状具有变异的植株
[0019]将收获的导入穗按穗及对照穗进行无土育秧，当秧苗长至IOcm左右，分别按穗行单株植入田间，以受体材料作为对照筛选性状具有变异的植株，并将变异株继续种植，直到后代性状稳定；
[0020]S4.对筛选的变异植株进行分子鉴定
[0021]将筛选的具有变异性状的植株利用SSR分子标记进行分子鉴定，以供、受体为对照，鉴定变异植株中有无供体野生稻`的DNA片段进入。
[0022]本发明中提取缓冲液100mmol/LTris-HCl ρΗ8.0，500mmol/L NaCl，50mmol/L EDTApH8.0，质量浓度为1.5% SDS0
[0023]本发明的优点和有益效果如下:
[0024]本发明提供了一种切实可行的创新水稻种质的途径，获得具有野生稻性状的导入后代材料。
[0025]本发明提供的育种方法可以将野生稻DNA导入水稻中，导入效率高达6.8% ;后代性状变异范围广，引起了水稻株高、叶片、叶色、叶角度、粒形、粒重、抗病性等性状的变化；选择群体大，后代稳定快，缩短育种年限，适合粳型水稻种质创新及育种需要，具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0026]以下结合实施例对本发明做进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。实施例1
[0027]本实施例的实验材料为野生稻DNA、宁粳16号和宁粳23号。本实施例中利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法，包括以下步骤:
[0028]本发明一种利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法，包括如下步骤:
[0029]S1.野生稻基因组DNA的提取
[0030](a)剪取孕穗期的叶片5g放入50ml研钵；[0031](b)向步骤(a)的研钵中加入液氮,每次加入50ml,总共3次到4次,快速研磨成细粉，将细粉倒入50ml塑料离心管；
[0032](c)向步骤(b)的离心管中加入预热提取缓冲液25ml及β -巯基乙醇25 μ 1，混匀后 65°C水浴 30min ;提取缓冲液 100mmol/L Tris-HCl pH8.0,500mmol/L NaCl, 50mmol/LEDTA ρΗ8.0，质量浓度为 1.5% SDS。
[0033](d)向步骤(c)的离心管中加5mol/L醋酸钾溶液5ml，温和混匀，冰浴20min ；
[0034](e)向步骤(d)的离心管中加入等体积氯仿和异戊醇混合液，氯仿与异戊醇的体积比为 24:1，在 4°C 4500 Xg 离心 15min ；
[0035](f)吸出步骤(e)中的上清液,加_20°C预冷的等体积异丙醇,静止3min_5min至出现白色DNA线团；
[0036](g)挑起步骤(f)中DNA线团，70%乙醇洗涤，晾干，溶于0.1mll X SSC，4°C保存；
[0037]S2.DNA 导入
[0038]在孕穗后期，花粉发育到单核中晚期，外部形态表现为穗顶部离剑叶叶枕2cm，利用微量注射器将DNA导入水稻穗颈节，从上向下呈45度角刺入穗下颈节处，注入DNA液，DNA浓度为400 μ g/ml，缓冲液为添加了 2mg/ml CaClJ^0.1 X SSC缓冲液，注射时间为上午9点至上午10点，每株导入10 μ 1，重复导入3次；待导入株成熟后分别收获导入穗，下年种植选择变异株；
[0039]S3.筛选性状具有变异的植株
[0040]将收获的导入穗按穗及对照穗进行无土育秧，当秧苗长至IOcm左右，分别按穗行单株植入田间，以受体材料作为对照筛选性状具有变异的植株，并将变异株继续种植，直到后代性状稳定。`
[0041 ] 对照试验:在孕穗后期，利用微量注射器将添加了 2mg/ml CaCl2的0.1 X SSC缓冲液导入宁粳16号和宁粳23号同一株的另一个穗作为对照。
[0042]统计宁粳16号和宁粳23号杂交后代水稻变异材料的农艺性状表现(见表1 )，变异材料的叶形及叶夹角(见表2)，变异材料的粒长变化(见表3)，变异材料的粒宽变化(见表4)，野生稻DNA导入宁夏水稻品种后的抗病性调查(见表5)，统计抗病性导入后代与对照的比较(见表6)。
[0043]S4.对筛选的变异植株进行分子鉴定
[0044]将筛选的具有变异性状的植株利用SSR分子标记进行分子鉴定，以供、受体为对照，鉴定变异植株中有无供体野生稻的DNA片段进入。
[0045]表1、变异材料的农艺性状表现
[0046]
【权利要求】
1.一种利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.野生稻基因组DNA的提取 Ca)剪取孕穗期的叶片5g放入50ml研钵； (b)向步骤(a)的研钵中加入液氮，每次加入50ml，总共3次到4次，快速研磨成细粉，将细粉倒入50ml塑料离心管； (c)向步骤(b)的离心管中加入预热提取缓冲液25ml及β-巯基乙醇25yL，混匀后65°C 水浴 30min ； (d)向步骤(c)的离心管中加5mol/L醋酸钾溶液5ml,温和混匀,冰浴20min； (e)向步骤(d)的离心管中加入等体积氯仿和异戊醇混合液，氯仿与异戊醇的体积比为24:1，在 4°C 4500 Xg 离心 15min ； (f)吸出步骤(e)中的上清液,加等体积_20°C预冷的异丙醇,静止3min-5min至出现白色DNA线团； (g)挑起步骤(f)中DNA线团，70%乙醇洗涤，晾干，溶于0.1ml 1XSSC，4°C保存； 52.DNA导入 在孕穗后期，花粉发育到单核中晚期，外部形态表现为穗顶部离剑叶叶枕2cm，利用微量注射器将DNA导入水稻穗颈节，从上向下呈4`5度角刺入穗下颈节处，注入DNA液，DNA浓度为400 μ g/ml，缓冲液为添加了 2mg/ml CaCl2的0.1 X SSC缓冲液，注射时间为上午9点至上午10点，每株导入10 μ 1，重复导入3次；待导入株成熟后分别收获导入穗和对照穗，下年种植选择变异株； 53.筛选性状具有变异的植株 将收获的导入穗按穗及对照穗进行无土育秧，当秧苗长至IOcm左右，分别按穗行单株植入田间，以受体材料作为对照筛选性状具有变异的植株，并将变异株继续种植，直到后代性状稳定； 54.对筛选的变异植株进行分子鉴定 将筛选的具有变异性状的植株利用SSR分子标记进行分子鉴定，以供、受体为对照，鉴定变异植株中有无供体野生稻的DNA片段进入。
2.根据权利要求1所述利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法，其特征在于:所述粳型水稻是宁粳16号或宁粳23号。
3.根据权利要求1所述利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法，其特征在于:所述提取缓冲液是 100mmol/L Tris-HCl pH8.0,500mmol/L NaCl, 50mmol/L EDTAρΗ8.0，质量浓度为1.5% SDS0
4.根据权利要求1所述利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法，其特征在于:提取DNA的材料为孕穗期的叶片，DNA导入时期在孕穗后期，花粉发育到单核中晚期，外部形态表现为穗顶部离剑叶叶枕2cm ;导入部位为水稻穗颈节；DNA缓冲液为添加了 2mg/mlCaCl2 的 0.1 X SSC 缓冲液。
【文档编号】A01H5/00GK103820499SQ201410051828
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月17日 优先权日:2014年2月17日
【发明者】李树华, 杨庆文, 吕学莲, 白海波, 韩国敏, 李华, 马静, 郑国宝, 朱永兴, 张万霞, 孔德杰, 严奉坤, 王娜, 张岩, 关雅静 申请人:宁夏农林科学院