专利名称：一种Exendin9-39基因及其多肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及ー种EXendin9-39基因及其多肽的制备方法。
背景技术：
Exendin9-39基因是含有31个氨基酸残基的小肽，它是由Exendin_4的39个氨基酸残基缺失N端的前8个氨基酸残基后得到的。Exendin-4发现与美国毒蜥蜴分泌的毒液中。其作用主要是动物体内的类胰高血糖素样肽-I (glucagon-like peptide-1, GLP-I) 受体的激活剂，促进GLP-I与受体结合，诱导cAMP的产生，从而发挥出类似GLP-I的作用増加葡萄糖依赖性的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，加速葡萄糖清除，延缓胃排空和诱发饱腹感、抑制食欲；还可以改善外周胰岛素抵抗等。而缺少8个氨基酸的eXendin9-39却是GLP-I受体的抑制剂，其作用也与exendin-4完全相反降低胰岛素的分泌、增加胰高血糖素的分泌、增加食欲等(G0ke R et al. Exendin-4is a high potency agonistand truncated exendin-(9-39)-amide an antagonist at the glucagon-like peptideI-(7-36)-amide receptor of insulin-secreting beta-cells. J Biol Chem. 1993Sep15,268 (26):19650-5. Schepp W et al. Exendin_4and exendin-(9-39)NH2: agonist andantagonist, respectively, at the rat parietal cell receptor for glucagon-likepeptide-1-(7-36)NH2. Eur J Pharmacol. 19940ct 14, 269(2):183-91.Thorens B etal. Cloning and functional expression of the human islet GLP-lreceptor.Demonstration that exendin_4is an agonist andexendin-(9-39)an antagonist of thereceptor. Diabetes. 1993Nov, 42 (11):1678-82.)早在1999年，Karim Meeran等用大鼠的实验证明，exendin9_39能够提高动物食欲，并能增加动物的体重。姆天注射30nmoI的exendin9_39于大鼠的侧脑室中，连续注射3天，与注射生理盐水的对照组相比，实验组大鼠平均每天的饲料消耗是 21. 9±0. 5vs. 19. 5±0. 4g Ρ〈0· 001，最终体重增加 7±2vs. 2± lg;P〈0. 02 (MeeranK, et al. Repeated 丄ntracerebroventricular Administration of Glucagon-LikePeptide-1-(7-36)Amide or Exendin-(9-39)Alters Body Weight in the Rat. Endocrinology. 1999Jan;140(1):244-50.)。目前，exendin9_39主要采用化学合成，成本高(对原料氨基酸及仪器设备要求极高)、产量少。利用基因工程生产eXendin9-39，不仅可以实现エ业化的大規模生产、有效地降低生产成本，而且终产品污染各种有害化合物的机会绩效，产品更加安全。但关于exendin9-39的原核表达和提取纯化尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供ー种Exendin9-39基因用于原核表达生产Exendin9_39多肽。
本发明另一目的是提供制备Exendin9_39多肽的方法。根据遗传密码表，并考虑到大肠杆菌密码子的偏爱性，进行选择性优化，设计推导出exendin9_39基因的原核表达编码序列如SEQ ID NO. I所示。Exendin9_39基因的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。exendin-4失去N端的前8个氨基酸后的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。(Chen YE, Drucker DJ. Tissue-specific expression of unique mRNAs that encodeproglucagon-derived peptides or exendin 4in the lizard.J Biol Chem. 1997Feb14; 272 (7) :4108-15.)相比之下，本发明设计的exendin9_39的核苷酸序列与exendin-4失去N端的前8个氨基酸后的核苷酸序列显著不同，二者的同源性为75%。其中，所述Exendin9-39基因通过基因克隆可得到重组载体。其中，所述Exendin9-39基因或所述重组载体可导入宿主细胞。其中，所述Exendin9_39基因可应用于制备Exendin9_39多肽。将人工设计好的exendin9_39基因序列(携带BamH I和Hind III酶切位点)进行人工合成，插入到原核表达载体pET-28b (+)中，构建高效原核表达载体，转化到大肠杆菌BL-21 (DE3-plyss)中，通过诱导表达，获得表达产物并提取纯化。本发明所述Exendin9_39多肽的制备方法,包括以下步骤I)用Exendin9_39基因构建表达载体；2)将表达载体导入宿主菌中，筛选得到表达Exendin9_39多肽的工程菌；3)培养所述工程菌，并诱导Exendin9_39多肽的表达。其中，所述表达载体为原核表达载体。其中，所述宿主菌为大肠杆菌。其中，所述Exendin9-39多肽利用组氨酸标签进行亲和层析纯化，可得到目的蛋白。所述exendin9_39基因可应用于制备动物增肥产品。本发明的有益效果I)本发明利用大肠杆菌的密码子的偏爱性，人工合成了 exendin9_39的核苷酸序列，并构建成原核表达载体，进行原核表达，比人工合成价廉、方便，更加适用于动物生产领域，可显著降低应用成本。2)本发明的eXendin9-39多肽能提高动物的食欲、抑制胰岛素的分泌，可用于毛皮动物增肥。3)本发明的exendin9_39多肽用于水紹、狐狸等毛皮动物,仅利用动物的毛皮,动物尸体进行销毁，或用于生产エ业用油，不存在生物安全的问题。
图 I 为 Exendin9-39 多肽 Tricine-SDS-PAGE 电泳图，其中 I 泳道Marker，2、3、4泳道为纯化后的样品。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。pET_28b ( + )表达载体购自Novagen公司；BL21 (DE3)pLysS宿主菌购自北京百泰克生物技术有限公司；基因序列由上海生エ生物工程公司合成。DH5a感受态细菌购自天根生物技术有限公司。实施例I人工设计合成exendin9_39的核苷酸序列根据已发表的exendin-4的核苷酸序列和大肠杆菌的密码子的偏爱性特点，人エ设计合成eXendin9-39的核苷酸序列。完整的表达框序列如SEQ ID NO. I所示。在exendin9-39基因N端加上BamH I酶切位点ggatcc和C端加上Hind III酶切位点aagctt。加入酶切位点的序列如下GGATCCATGGATCTGAGCAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTCATTGAATGGCTGAAAAACGGCGGTCCGAGCAGCGGCGCGCCGCCGCCGAGCAAGCTT实施例2构建原核表达载体
将合成的核苷酸序列经BamH I和Hindm酶切并回收，同时将空载体pET-28b( + )也用BamH I和Hind III酶切，回收大片段，再按摩尔比(I :5)加入回收的合成序列，同时添加T4连接酶，16°C连接4小时以上。将连接产物转化DH5a感受态细菌，铺氨苄青霉素平板，37°C过夜培养后，挑选单菌落进行筛选，鉴定大小和方向，最后测序确定所得质粒为含有exendin9-39基因的原核表达载体。命名为pET_EX9_39。测序结果如下GATCCATGGATCTGAGCAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTCATTGAATGGCTGAAAAACGGCGGTCCGAGCAGCGGCGCGCCGCCGCCGAGCAAGCT证实插入序列为人工合成的eXendin9-39的核苷酸序列，所得质粒正确。实施例3exendin9_39的原核表达将上述pET-EX9-39转入大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS菌中取I μ I质粒DNA加入到200 μ I冰浴融化的大肠杆菌感受态细胞DH5 a中，继续冰浴40分钟，42°C热冲击120秒，迅速取出返回到冰水浴中10分钟，然后加入800 μ I的LB培养基37°C培养I小时，取100 μ I铺氨苄青霉素平板进行筛选,挑单菌落加入到IOml的含工作浓度的氨苄青霉素的LB培养基中，培养过夜，然后取过夜培养物，按1%体积接种到500ml LB培养基中，待0D600=0. 5-0. 7左右吋，加入工作浓度为lmmol/L的IPTG诱导，约5_7小时后收菌，提取纯化。实施例4exendin9_39多肽的纯化及鉴定诱导后收集菌体，利用超声处理，破坏菌壁，可得粗制品，然后利用组氨酸标签进行Ni+-NTA亲和层析柱(北京慧德易科技有限责任公司，BIO-RAD产品；Ni+_NTA agarose,QIAGEN公司产品)纯化，得到目的蛋白，经Tricine-SDS-PAGE得到单一条带。电泳结果如图I所示。得到的目的蛋白约占菌体总蛋白的28%，纯化后的蛋白纯度达到93%。实施例5exendin9_39多肽生物活性测定取20只健康成年Wistar大鼠(10周龄),公母各半,实验组和对照组各10只。姆天注射30nmol的exendin9_39于实验组大鼠的侧脑室中，连续注射3天,实验组大鼠与注射生理盐水的对照组大鼠相比，平均每天的饲料消耗是22±0. 5vs. 18±0. 4g(P〈0. 001)，最终体重増加 8±2vs. 3±lg (P〈0. 02)。
权利要求
1.Exendin9-39基因，其具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求I所述基因的重组载体。
3.含有权利要求I所述基因或权利要求2所述重组载体的宿主细胞。
4.权利要求I所述基因在制备EXendin9-39多肽中的应用。
5.权利要求I所述基因在制备动物增肥产品中的应用。
6.一种制备Exendin9-39多肽的方法,包括以下步骤1)用权利要求I所述的基因构建表达载体；2)将表达载体导入宿主菌中，筛选得到表达Exendin9-39多肽的工程菌；3)培养所述工程菌，并诱导Exendin9-39多肽的表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表达载体为原核表达载体。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对所述Exendin9-39多肽进行分离纯化。
全文摘要
本发明涉及一种Exendin9-39基因及其多肽的制备方法。所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的exendin9-39多肽可用于制备毛皮动物增肥产品。采用本发明方法，使Exendin9-39多肽在原核细胞中表达，比人工合成价廉、方便，更加适用于动物生产领域，可显著降低应用成本。
文档编号C12N15/63GK102703459SQ20121021077
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者刘维全, 王吉贵 申请人:中国农业大学