作为检测日光照射、前列腺癌和其它癌症的诊断工具的线粒体突变及重排的制作方法

作为检测日光照射、前列腺癌和其它癌症的诊断工具的线粒体突变及重排的制作方法
【专利摘要】本发明提供了可用于对于检测癌症和日光照射的线粒体DNA缺失。具体地，提供了检测线粒体DNA缺失以用于前列腺癌、日光照射和非黑色素瘤皮肤癌的早期检测、诊断和发展的方法和试剂盒。
【专利说明】作为检测日光照射、前列腺癌和其它癌症的诊断工具的线粒体突变及重排
[0001]本申请是申请号为200680021903.1的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/CA2006/000652的中国国家阶段申请。
【技术领域】 [0002]本发明涉及线粒体基因组学领域。具体地，其涉及线粒体基因组中的突变和重排，及其作为日光照射、衰老和疾病的发生或存在的指示因子的功用，例如在一般的临床症状显现之前检测肿瘤形成前、肿瘤形成以及向潜在恶性转化的进展。
【背景技术】
[0003]当前生物科学中的大趋势是人类基因组计划以及该数据的商业开发。然而，对这些信息的利用和实行存在例外的限制，因为该数据在个体水平上不是特异性的。令人难以置信的是，该数据仅来自少量个体，难以代表人类种群中存在的变异，从而使得该数据只能用于一般应用。人类基因组惊人的复杂性使基于个体基础的应用并不实际。为了对一个人类细胞核基因组进行完整测序，美国能源部和国立卫生研究院从1988年起已投资25亿美兀(http://www.0rnl.gov/hgmis/project/budget.html)。
[0004]线粒体基因组
[0005]线粒体基因组是紧凑但却至关重要的核酸序列。线粒体基因组编码细胞呼吸所必需的酶亚基。与33亿bp的庞大核基因组相反，线粒体DNA (或“mtDNA”)是16，569个碱基对(bp)的小核酸基因组(Anderson等，1981 !Andrews等，1999)。其遗传互补体比其同细胞的核小得多(0.0005%)。然而，个体细胞带有IO3至IO4中任意数目的线粒体，这取决于特定的细胞功能(Singh and Modica-Napolitano2002)。在细胞核和线粒体基因组之间一般存在通讯或化学信号转导(Sherratt等，1997)。而且，特定的细胞核组分负责线粒体序列的维持和完整性(Croteau等，1999)。当这些细胞核区域由于指示潜在疾病的细胞核重排而失去功能时,接着mtDNA序列中也会开始出现突变。另外,可以通过线粒体基因组中由体细胞突变推动的缺失来对细胞内破坏鉴定特异性线粒体。这种理论性机制也可以用于指示将发生的疾病。线粒体需要约3，000种基因，其中只有37种由线粒体基因组编码，表明了线粒体对细胞核基因座的严重依赖(Naviaux，1997)。
[0006]一旦发生受精，由于卵细胞中线粒体的克隆扩增，给定个体中所有线粒体DNA(mtDNA)基因组是相同的。mtDNA的关键作用是产生驱动细胞代谢的细胞燃料——三磷酸腺苷(ATP)。重要地，除了由线粒体基因组提供的13种多肽以外，该线粒体基因组依赖70种细胞核编码的蛋白质来完成该生命功能所必需的氧化和还原反应(Leonard和Shapira,
1997)。不同的组织和器官对氧化磷酸化的依赖程度不同。与氧化磷酸化(0XPH0S)缺陷相关的疾病看来与mtDNA突变有紧密的联系(Byrne，1992)。由于mtDNA突变的严重性提高而导致0XPH0S降低而超出了器官特异性能量阈值，这引起多种临床表型。而且，线粒体基因组中的突变与多种慢性退行性疾病有关(Gattermann等1995)。众所周知,衰老和特定类型的疾病可以使mtDNA发生改变或突变，使细胞的能量产生能力受损。这常常导致缺陷线粒体的过表达和/或细胞通过增加糖酵解来补充ATP的缺乏(Carew和Huang，2002);因此，当以连续的间隔进行监测时，线粒体基因组中的改变或突变可以用作疾病发生和/或疾病发展的标记。
[0007]最近，Fliss等(2000)在来自肺及膀胱的癌症的原发性肿瘤中发现了天然情况下主要为同质的mtDNA发生高频率突变，表明突变mtDNA在恶性肿瘤细胞中占多数。点突变和缺失看来是氧自由基对线粒体膜和基因组造成损伤的非程序性但却不可避免的副作用(Miquel等1992)。这个理论看来言之有理，不仅因为线粒体基因组缺乏保护性组蛋白，还因为在产生氧的线粒体内膜附近发现了对氧化损伤的敏感性。而且，由于mtDNA具有紧凑的基因组并缺少内含子，因此有害事件很可能影响编码序列，引起生物化学功能异常。这种功能异常将进一步增加细胞的氧化应激，这将引起核及mtDNA的损伤，从而提高细胞进入癌化过程的可能性(Penta等，2001)。在这方面，研究表明随着年龄的增长，mtDNA的损伤增加(Cortopassi&Wangl995),呼吸功能随之衰退(Miquel等1992),最终导致细胞死亡。
[0008]mtDNA作为诊断工具
[0009]mtDNA序列动力学情况是重要的诊断工具。mtDNA中的突变常常是正在发展中疾病的先期指示，常常与细胞核突变有关，并作为与疾病特异性相关的生物标志物，所述疾病例如但不仅限于:吸烟和接触二手烟引起的组织损伤和癌症(Lee等，1998 ；ffei, 1998);基于从约20岁开始并在之后逐渐提高的线粒体基因组突变累积的寿命((von ffurmb,1998)；由突变或接触致癌物、诱变剂、紫外线辐射照射而引起的转移性疾病(Birch-Machm，2000)；骨关节炎；心血管疾病、阿尔茨海默病、帕金森病(Shoffner等，1993 ;Sherratt等，1997 ；Zhang等，1998);与年龄相关的听力丧失(Seidman等，1997);视神经退化和心率失常(Brown 等，1997 ;Wallace 等，1988);慢性进行性 external exophthalmoplegia (Taniike等，1992);动脉硬化(Bogliolo等，1999);乳头状甲状腺癌和甲状腺瘤(Yeh等，2000)等等(例如 Naviaux, 1997 ；Chinnery and Turnbull, 1999)。
`[0010]线粒体基因组特定位点的突变可与某些疾病相关。例如，在4216、4217和4917位的突变与 Leber' s 遗传性视神经病变(LHON) (Mitochondrial Research Society ；Huoponen(2001) ；MitoMap)相关。在5/5个泛醇细胞色素C还原酶(复合体III)缺陷的患者中发现了 15452位的突变(Valnot等1999)。然而，还未这些位点的突变与前列腺癌有关。
[0011]具体地，这些改变包括点突变(转换、颠换)、缺失(一个碱基至数千个碱基)、倒位、复制(一个碱基至数千个碱基)、重组以及插入(一个碱基至数千个碱基)。另外，特定的碱基对改变、缺失或其组合与前列腺癌、皮肤癌和肺癌的早期发作以及衰老(例如Polyak等，1998)、提如裳老、接触致癌物(Lee等，1998)等有关。
[0012]因为mtDNA仅通过卵细胞向后代传递，所以急需通过这种遗传手段了解线粒体序列。mtDNA的序列在母系谱系之间有广泛的变异(Ward等，1991)，因此，必须与这种变异相比清楚地了解与疾病相关的突变。例如，若干个体的序列中与特定癌症相关的特定T向C的转换实际上可能是在给定的特定地理区域或与种族相关的母系谱系中广泛的天然变异。例如，北美本地人表现出异常高的成年糖尿病发病频率。另外，所有的北美本地人在遗传上可表征为5个基本的母系谱系，命名为A、B、C、D和X(Schurr等，1990 ；Stone和Stoneking，1993 ;Smith等，1999)。谱系A的特点是具有单个点突变，导致线粒体基因组的663bp处出现Hae III位点，然而在这种突变与成人糖尿病发病之间没有因果关系。另外，即使在谱系簇中也存在序列变异。
[0013]在与特定谱系相关的特定标记之外，种群内序列变异多于种群间序列变异(Easton等，1996 ;Ward等，1991，1993)。为了最佳地鉴定与疾病相关的突变，就必须了解这种趋异性，因此必须使用模拟纵向设计能力(即长期跟踪受试者)的母系研究法(Parsons等，1997)鉴定与疾病直接相关的突变，而不是物疾病相关性的突变。而且，特定的物质例如二手烟、低水平的石棉、铅、在许多环境中低水平的所有已知诱变剂可能是特定点突变的原因，但却不一定是疾病特异性标志物。因此，丰富的mtDNA序列数据库是准确预测潜在疾病为自然过程或是由于接触致病物质而引起的明确的必要条件。而且，必须对整个分子进行测序以得到其完整的信息内容。必须在整个线粒体基因组上将完整的点突变(转换、颠换)、缺失(一个碱基至数千个碱基)、倒位、复制(一个碱基至数千个碱基)、重组以及插入(一个碱基至数千个碱基)表征为一个整体。这可确保所获得线粒体基因组中所有可能的可用信息。尽管与其核副本一样，胞质线粒体基因组(16，569bp)已在个体水平进行了测序，但是还未在种群水平对线粒体基因组进行测序以用作诊断工具。
[0014]最近，由于其在凋亡和其它肿瘤生物学方面中的作用(Green&Reed，1998，Penta等，2001)，尤其是已在许多人类肿瘤中观察到mtDNA的体细胞突变(mtDNA) (Habano等1998 ；Polyak等1998 ；Tamura等1999 ；Fliss等2000),因此已经将线粒体与致癌过程相联系。特定的mtDNA突变似乎是同质的(Habano等1998 ；Polyak等1998 ；Fliss等2000)，这些后面的发现更有意义。另外，研究者已发现，紫外线辐射(UV)对于非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)的发生和发病是重要的(Weinstock 1998 ;ReeS，1998)，并且UV在人类皮肤中诱发mtDNA 损伤(Birch-Machin, 2000a)。
[0015]而且，线粒体序列随时间失去完整性。例如，4977bp缺失的频率随年龄增长而提高(Fahn等，1996)。从20岁开始,该缺失开始在少量线粒体中发生。至80岁时,大量的分子已发生缺失。该缺失表征了`正常衰老的过程，并作为该过程的生物标志物。对这种衰老过程的定量允许使用医学或其他方式的干预来延缓该过程。
[0016]这种线粒体基因组在医学中的应用受到了忽视，是因为mtDNA先前主要用作种群遗传学工具，最近用于取证；然而，越来越明显地，mtDNA的信息内容在医学诊断领域中具有重要的应用。而且,在最近高容量的高通量机器DNA测序系统出现之前，对全部mtDNA互补体进行测序是一项艰巨的任务。另外，种群遗传学家能够收集来自控制区中的两个高度可变区的重要数据；然而，这些小区域代表整个基因组中10%以下的一小部分，意味着该数据中90%的辨别力没有得到使用。很重要地，许多疾病相关地改变在控制区之外。为了精确并且高辨别地进行诊断，应该考虑整个基因组的特征，以包括所有的序列信息。
[0017]非黑色素瘤皮肤癌
[0018]人类非黑色素瘤皮肤癌(匪SC)在许多白种人群中是最普遍的癌症(Wemstock，1998 ；Rees,1998) 0这些肿瘤中多数为基底细胞癌(BCC)和鳞状细胞癌(SCC)。BCC为局部侵袭性并可导致显著的发病率，但几乎不转移。SCC显示显著的转移潜力，并且免疫抑制的患者中多发性匪SC的发生导致严重的治疗问题(Rees，1998)。尽管BCC没有临床上可检测的恶化前损伤，但一些SCC认为是由前体损伤引起，也就是光化性角化病(AK)或鲍恩病(原位癌)(Rees，1998)。
[0019]SCC显示出影响某些染色体的杂合性丢失，提示某些肿瘤抑制子基因参与其发生。有趣的是，在AK中，这些前体损伤中观察到的基因丢失水平与SCC相比相同或更高(Rehman等1994 ；Rehman等1996)。这对于本发明是很重要的，因为这提示除了肿瘤抑制子基因失活以外，在SCC的发生中还可能涉及其他机制。
[0020]在发现肿瘤细胞的呼吸系统受损并具有高糖酵解活性时，最先提出了线粒体在肿瘤发生发挥作用的假说(Shay&Werbin，1987)。最近的发现阐明了线粒体在凋亡中的作用(Green&Reed, 1998),与结肠癌(Habano 等 1998 ；Polyak 等 1998, reviewed in Penta 等，2001)、膀胱、颈和肺(Fliss等2000)的原发性肿瘤以及胃肿瘤(Tamura等1999)同质mtDNA突变的高发生率一起进一步支持了这种假说。而且，已经提出，这些线粒体突变可影响活性氧类别(ROS)的水平，已经显示ROS具有高促有丝分裂能力(Polyak等1998 ；Li等1997)。
[0021]本发明人及其它人在先前的研究中已显示mtDNA中的突变以及相关的线粒体功能异常是导致人类退行性疾病的重要促进因素(Birch-Machin等1993 ;Chinnery等1999 ；Birch-Machin等2000b)。这是因为，该细胞器中产生的大量ROS使线粒体基因组特别容易突变，同时与核相比缺乏保护性组蛋白并且mtDNA修复的速率很低(Pascucci等1997 ；Sawyer&van Houten ；LeDoux等1999)。实际上，mtDNA的突变率约比细胞核DNA高10倍(Wallace, 1994) 0在最近的人类肿瘤研究中鉴定的多数mtDNA突变表明可能接触了 ROS衍生的诱变剂。这对于匪SC中mtDNA突变研究十分重要，因为最近有证据表明UV诱导的ROS直接参与人类皮肤细胞mtDNA缺失的产生(Berneburg等1999, Lowes等,2002)。另外,无保护性色素沉着或遗传素因(genetic predisposition)的个体中NMSC的主要决定因素是UV(WeinstOCk，1998)。还发现SCC推定的前体损伤主要发生在经常接受日光照射的部位上。这之所以重要，是因为Birch-Machin实验室的工作已经显示，取自接受不同日光照射的身体部位的皮肤中线粒体DNA损伤的发生频率之间存在不同的差异。发现绝大多数损伤位于经常接受日光照射的位点上(Krishanan等,2002)。
[0022]本发明的发明人之一首先定量显示了 UV照射诱导mtDNA损伤(Birch-Machin等
1998)。作为分子标记，mtDNA用于研究人类皮肤中自然老化与光老化之间的关系。利用3-引物定量PCR(qPCR)方法研究与人类皮肤的日光照射和自然老化相关的4977bp缺失mtDNA与野生型mtDNA比例的改变。与避光部位(1.1% [1/90])相比，日光照射部位的高水平4977bp缺失mtDNA的发生率(27%，[27/100])显著提高(即> 1% ) (Fishers精确检验，P < 0.0001)。因此，mtDNA的缺失或突变可以用作累积性紫外线照射的标志物。
[0023]而且,使用针对胸腺喃唳二聚体的单克隆抗体进行South-Western印迹法进行的研究为纯化的mtDNA中存在UV诱导的损伤提供了直接的证据(Ray等1998)。
[0024]本发明人的研究组在最近的工作中使用了长延伸PCR(LX-PCR)技术扩增完整的线粒体基因组，以确定U V照射继发的mtDNA完整缺失谱(Ray等2000)。对71个分散的皮肤样品就其与日光照射的关系进行了长PCR分析，其中将表皮与下面的真皮分离。随着UV照射的增加，表皮中的缺失数显著增加(Kruskal-Walhs检验，p = 0.0015)。表皮中的该发现不会与也通过长PCR技术检测的年龄依赖性mtDNA缺失提高混淆。大光谱的已鉴定缺失使得与UV照射有关的mtDNA的普遍性质和高突变复合更加明了。与使用竞争性PCR检测单缺失相比，该研究显示长PCR是一种灵敏的技术，因此可以提供更全面的(尽管不是定量的)皮肤总体mtDNA损伤指标。上述发明人之一的研究清楚地显示，mtDNA是UV的重要革巴标，这与线粒体在皮肤病中的功能一起于最近进行了综述(Birch-Machin, 2000)。
[0025]已对UV敏感性和人类皮肤癌的主要共变体的人类毛发及皮肤色素沉着进行了研究。这些研究关注于黑皮质素I受体基因变体与个体和种群中日光敏感性与皮肤癌易感性相关的联系(Smith 等 1998 ；Healy 等 1999 ；Flanagan 等 2000 ；Healy 等 2000 ；Harding 等2000 ；Flanagan等，2002)。然而，这些研究没有强调mtDNA序列种群水平的变异与特定皮肤类型和/或毛发颜色的关系。 [0026]最近人类肿瘤中mtDNA突变的研究在很大程度上仍未回答的一个问题是线粒体基因组中缺失的发生率与这些肿瘤的关系。这是一个有待解决的重要问题，因为人类皮肤单个患者的初步研究已经显示，在某些肿瘤(AK和SCC)和正常皮肤之间存在普遍mtDNA缺失发生率的差异(Pang等1994)。本发明人自己的初步数据也显示，与正常皮肤相比肿瘤中mtDNA缺失的数目增加。最后,Birch-Machin及其他人已显示,mtDNA缺失以及复制的发生率随 UV 照射的增加而提高(Berneburg 等 1999 ;Birch_Machin 等 1998 ；Ray 等 1998 ；Ray等 1999 ;Ray 等 2000), Lindsey 等，2001 ;Birch_Machin 等，2001 ;Lowes 等，2002, Krishnan等，2002)。
[0027]除了与肿瘤进展相关的问题之外，最近在人类肿瘤中的mtDNA研究在很大程度上也没有回答其他重要问题(Habano等1998 ；Fiiss等2000)。首先，由于技术的局限性，mtDNA突变是否真的是同质的还不清楚，因为变化的异质性水平也可指示重要的疾病转换(Habano 等 1998 ;Polyak 等 1998 ;Fliss 等 2000);其次，除了一个研究以外(Tamura 等1999)，还未研究过mtDNA缺失的发生率及其作为匪SC的潜在生物标志物的作用。研究者们研究了常见的缺失并忽视了剩余的约100个缺失。此外，研究者们着眼于突变的鉴定，而非对其定量。以定量方式精确评估缺失的发生率是很重要的，因为mtDNA损伤对ATP产生以及由此引起的细胞功能具有阈值效应。另外，缺失很难于表征。
[0028]通常使用长PCR，其产生随后需要表征的缺失梯状条带。
[0029]现有的匪SC诊断是对切除组织的病理评估。因此，需要使个体易感于WSC的UV所诱发DNA损伤的早期标记物。还需要基于遗传学的诊断工具，其允许进行早期检测，并具有诊断精确性。
[0030]前列腺癌
[0031]前列腺癌是经常被诊断出的实体瘤，非常可能来源于前列腺上皮(Huang等
1999)。在1997年，对近一千万美国男性筛选了前列腺特异性抗原(PSA)，其存在提示患有前列腺癌(Woodwell，1999)。事实上，这表明通过初步的直肠指检(DRE)会筛选出更大数目的男性。同一年，三千一百万男性进行了 DRE(Woodwell，1999)。此外，美国每年新诊断出的前列腺癌病例数目估计为179，000 (Landis等，1999)。它是加拿大男性中第二最常诊断出的癌症以及导致癌症死亡的第二主因。在1997年，前列腺癌在加拿大男性新诊断出的癌症中占19，800例(28% )(加拿大国家癌症研究所)。据估计，所有49岁以上的男性中30%至40%具有一些癌性前列腺细胞，然而这些男性中只有20%至25%有临床显著形式的前列腺癌(SpringNet-CE Connection, internet, www.springnet.com/ce/i803a.htm) ? 前列腺癌表现为多种组织学行为，包括性因素和外在因素，即社会经济状况、饮食、地理环境、激素失衡、家族史以及遗传成分(Konishi等1997 ;Hayward等1998)。[0032]就风险的观点而言，家族性和遗传性前列腺癌不认为是同义术语。家族性癌症指在家族内发生，但是不会遗传。这种形式占前列腺癌的最多25% (ffalsh&Partin, 1997)。遗传性指具有易感基因孟德尔遗传性的前列腺癌亚型，占所报道病例的约9%。这种疾病的前列腺癌家族史提示这些易感基因在前列腺癌的发生和发展中起重要的作用。最近，已将I号和X号染色体上的易感性基因鉴定为使男性易感于前列腺癌，提供了遗传性癌症病因学深入的了解(Berthon 等 1998 ；Xu 等 1998)。
[0033]前列腺癌预后主要依赖于诊断时的肿瘤阶段和分级。只有局部前列腺癌能够通过放射性治疗被治愈。标准化检测仍依赖于直肠指检、PSA检测和对前列腺活检组织的组织病理学检查。活检用于确认恶性，这不是一种早期检测技术。不幸的是，一些早期肿瘤不可能在直肠检查中鉴定出来。PSA检测的特异性为60%至70%，灵敏度为70%至80%(personal communication,Dr.Sunil Gulavita,Northwestern Ontario Cancer Centre)。改善普通组织学分级肿瘤的诊断的一种较新技术是使用流式细胞术进行倍性DNA分析(Shankey等1995);然而，该技术测量仅在癌症发展后期显现的染色体变化，对于早期癌症中DNA结构的小变化或染色体倒位或交互易位不够灵敏。本发明着眼于早期检测，因为预后严重依赖于诊断时疾病阶段。
[0034]我们对于前列腺癌中的遗传异常的认识并不够。对于前列腺癌的研究着眼于以下领域认识的发展:1)原癌基因(Buttyan等1987) ；2)肿瘤抑制基因(p53、p73、KAll和MMACI/PTEN ;Dong等1995 ;Cairns等1997)以及3)端粒/端粒酶在转移中的活性。前列腺细胞中端粒酶的上调和端粒DNA的扩增可以提供有效的诊断标志物。而且，端粒可作为治疗位点(Ozen等1998)。许多小组已证实了 I号染色体短臂中的“前列腺癌基因”(Berthon等1998)。需要更多的工作来鉴定该区域内的特异性基因座。已经提出，该标志物仅是使男性易感于家族性前列腺癌的若干可能基因之一。其他研究已显示了 X号染色体上可能的标志物基因座(Xu等1998)。如果某些前列腺癌是多基因的，那么mtDNA将成为重要的诊断工具，因为在这样的情况下鉴定和了解所有相关核基因之间的互作是很困难的。
[0035]当然，前列腺癌 研究中的关键问题是鉴定能有效确定和区分肿瘤发展的分子标记物。分子标志物能够在前列腺癌病例中区分出将迅速发展为转移性疾病的以及几乎不会导致肿瘤发生的情况。分子标志物或突变的比较能确定肿瘤途径是潜伏性的还是攻击性的。直至本研究都主要着眼于核基因组中所隐藏的秘密；然而，小得多的mtDNA基因组看来是作为细胞核中事件的晴雨表，从而提供了早期检测人类前列腺癌的手段(Zeviani等1990)。重要的是，在这方面中，由于其在凋亡和肿瘤生物学其他方面中的作用，线粒体已经与癌症发生过程相联系(Green&Reedl998)。具体地，已在许多人类肿瘤中观察到mtDNA的体细胞突变(Polyak等1998，Tamura等1999，Fliss等2000)。然而，先前的研究完全是横断式的(cross-sectional),因为它们未考虑母系中mtDNA的无性系性质。这些有限的横断研究仅显示在一个时间点的突变。这可能给出在突变和相应疾病状态之间的准确联系，也可能不能给出。应用母系的横断式研究具有随时间跟踪mtDNA中突变的优点，从而模拟了纵向设计的能力。是常见种群变体的突变以及与其相对的疾病相关突变均能够被鉴定。
[0036]衰老
[0037]衰老由累积的分子和细胞水平上随时间的变化组成；然而，衰老过程背后的特定分子机制还有待阐明。为了尝试解释衰老过程，将来自较年老受试者的线粒体基因组与同一母系谱系中较年轻受试者的线粒体基因组进行比较。与衰老有关的一个缺失称为普遍缺失或4977-bp缺失。衰老研究局限于该普遍缺失以及控制区中的多态性。为了清楚地了解这些突变，必须分析整个基因组。其他缺失参见表1，改自Wei，1992。
[0038]表1
[0039]
【权利要求】
1.用于检测跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸的缺失的方法，其中所述缺失与皮肤癌和/或UV照射有关，所述方法包括检测生物样品的mtDNA中所述缺失的存在情况。
2.权利要求1的方法，其中所述生物样品是来自受试者的皮肤样品。
3.权利要求1的方法，其中所述生物样品是组织培养样品。
4.权利要求3的方法，其还包括在检测所述缺失的存在情况的步骤前将所述组织培养样品暴露于至少一个亚致死剂量的紫外线辐射(UVR)。
5.权利要求4的方法，其中将所述生物样品暴露于一系列重复性亚致死剂量的UVR。
6.权利要求5的方法，其中所述系列包括将所述生物样品暴露于日剂量的UVR。
7.权利要求4的方法，其中所述UVR来自模拟太阳的UVR源。
8.权利要求4的方法，其中所述UVR包含UVA、UVB或UVA/UVB。
9.权利要求1的方法，其中所述方法用于检测皮肤癌。
10.用于测定累积性UV照射的方法，所述方法包括在生物样品中检测跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸的缺失的存在情况。
11.用于监测临床UV光疗方案的长期安全性的方法，所述方法包括在生物样品中检测跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸的缺失的存在情况。
12.用于监测日光照射或相关的非黑色素瘤皮肤癌(匪SC)的方法，所述方法包括在经一段时间间隔获得的生物样品中检测跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸的缺失的存在情况。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述缺失为约3895bp。
14.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述缺失包含从D-环中的mtTFl结合位点左右至tRNA甲硫氨酸的mtDNA段。
15.权利要求1的方法，其中所述缺失基本上包含12srRNA基因、16s rRNA基因、NDl基因以及用于H和L链转录的启动子。
16.权利要求1至12中任一项的方法，其中检测mtDNA中所述缺失的存在情况的步骤包括扩增所述mtDNA。
17.权利要求1至12中任一项的方法，其中检测mtDNA中所述缺失的存在情况的步骤包括选自以下的PCR分析:缺失特异性PCR分析，放射性PCR分析，定量PCR，实时PCR(RT-PCR)分析或使用重组、热稳定Taq DNA聚合酶的RT-PCR。
18.权利要求1至12中任一项的方法，其中检测mtDNA中所述缺失的存在情况的步骤包括使用跨过mtDNA接合处的引物的PCR分析，所述接合处由跨越约547至4443位核苷酸的所述缺失形成。
19.权利要求17的方法，其中使用跨过mtDNA接合处的PCR引物进行所述PCR分析，所述接合处由跨越约547至4443位核苷酸的所述缺失形成。
20.权利要求17的方法，其中所述PCR分析是定量PCR分析，其包括使用跨过mtDNA接合处的引物，所述接合处由跨越约547至4443位核苷酸的所述缺失形成。
21.权利要求17的方法，其中使用具有根据SEQID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ IDNO:151或SEQ ID NO:152之核酸序列的引物检测所述缺失。
22.权利要求2的方法，其中所述生物样品来自非损伤皮肤。
23.权利要求2的方法，其中所述生物样品来自所述受试者的真皮或表皮层。
24.权利要求1的方法，其中所述生物样品包括偶尔接受日光照射的组织、经常接受日光照射的组织或几乎不接受日光照射的组织。
25.权利要求24的方法，其还包括比较所述生物样品与参照样品中所述缺失的存在情况的步骤。
26.权利要求25的方法，其中所述参照样品是:几乎不接受日光照射的组织、偶尔接受日光照射的组织、经常接受日光照射的组织或血液样品。
27.跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸的缺失在检测生物样品的UV损伤中的用途。
28.权利要求27的用途，其中所述生物样品是皮肤样品或组织培养样品。
29.跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸的缺失作为用于皮肤癌或UV损伤的生物标记物的用途。
30.包含一个或更多个核酸成员以及固体基质的阵列，其中至少一个所述核酸成员具有特异性结合人mtDNA片段的核酸序列，所述片段具有跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸的缺失，并且其中所述至少一个核酸成员在所述阵列上具有独有的位置且与所述固体基质稳定结合。
31.权利要求30的阵列，其中所述至少一个核酸成员是核酸探针。
32.权利要求31的阵列，其中所述核酸探针具有根据SEQID NO:153的核酸序列。
33.用于检测与皮肤癌、UV损伤`或非黑色素瘤皮肤癌(匪SC)相关的mtDNA缺失的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求30至32中任一项所述的阵列以及选自以下的至少一种成员:固体支持物、支持所述固体支持物的手段、提取线粒体DNA的手段、引物、试剂和说明书。
34.用于诊断皮肤癌、UV损伤或非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)的试剂盒，所述试剂盒包含用于扩增mtDNA区段的至少一种引物，所述区段包含跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸的缺失。
35.权利要求34的试剂盒，其中所述至少一种引物具有根据SEQID NO:145、SEQ IDNO: 146、SEQ ID NO:151 或 SEQ ID NO:152 的核酸序列。
36.用于诊断皮肤癌、UV损伤或非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)的试剂盒，所述试剂盒包含特异性结合人mtDNA片段的核酸探针，所述片段具有跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸的缺失。
37.权利要求36的试剂盒，其中所述核酸探针具有根据SEQID NO:153的核酸序列。
【文档编号】C12Q1/68GK103789405SQ201310399746
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2006年4月18日 优先权日:2005年4月18日
【发明者】瑞安·帕尔, 罗伯特·塞耶, 加百利·道库博, 珍妮弗·克里德, 克里·鲁宾逊, 安德烈娅·马格拉, 布赖恩·赖古伊, 安德烈·哈博特尔, 马克·比尔克-马金 申请人:米托米克斯公司