一种昆明裂腹鱼鳍细胞系的构建和超低温冷冻保存方法
【专利摘要】本发明涉及一种昆明裂腹鱼鳍细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，属淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存【技术领域】。该方法是以昆明裂腹鱼腹鳍组织为材料，采用组织块法，在含有胎牛血清和细胞生长因子，pH值为7.0-7.2的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；具体包括制备细胞培养液、原代培养及传代培养步骤。本发明的有益效果在于：1、原代培养耗时短，细胞量大，能用于染色体分析；2、构建的昆明裂腹鱼鳍细胞系形态为成纤维样，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对昆明裂腹鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要；3、该构建方法也适用于其他鱼类构建鳍细胞系。
【专利说明】一种昆明裂腹鱼鳍细胞系的构建和超低温冷冻保存方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种昆明裂腹鱼鳍细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，属淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存【技术领域】。
【背景技术】:
[0002]鱼类细胞培养起于20世纪60年代，发展至今形成了一套包括培养基、抗生素、原代培养和传代培养方法等相对完善的细胞培养体系，截止目前，已建立了 280余株细胞系。我国鱼类细胞培养历经30余年，也只建立了 50余株鱼类细胞系，涉及的种类有约30种，主要以海洋种类为主。·从以上事例可以看出，一套成熟的细胞培养技术流程并不是一株细胞系建立成功的必备条件，成熟的技术流程并不能使细胞培养获得成功，细胞培养仍然需要从提供原代细胞物种本身的生物学特性入手，经过艰苦的野外调查和大量的室内实验，对细胞培养体系的培养条件进行调整，找到最优的培养条件，才能使细胞培养获得成功。云南土著淡水鱼类近600种，占中国淡水鱼类的50%，因此，云南土著鱼类种质资源保存显得尤为重要，但细胞培养研究鲜见报道。
[0003]昆明裂腹鱼Schizothoraxgrahami(Ragen, 1904)隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)裂腹鱼属(Schizothorax),俗名细鳞鱼，白鱼，主要分布在金沙江下游支流，在IUCN(世界自然保护联盟)物种红色名录中被列为极度濒危物种。经过多年努力，昆明裂腹鱼人工繁殖技术于2013年研发成功，并计划将繁殖鱼苗放流回滇池和牛栏江等流域，但由于养殖鱼类本身的局限性，塘养环境下人工繁殖易造成染色体异常，如多倍化和异倍化，需要细胞短期培养用于核型分析以检测人工繁殖品种的质量，保证放流个体的成活率和繁殖率；另一方面，野外引种个体需要一段时间才能适应塘养环境，而此适应阶段是各种疾病的爆发期，可能会给引种个体带来灭顶之灾，如何进行病害防治显得尤为重要，而研究药物的抗病作用机理是病害防治的重要环节，在分子细胞水平研究药物的抗病作用机理不可或缺，因此，需要研究一种昆明裂腹鱼细胞系的建构建方法，建立昆明裂腹鱼细胞系。
[0004]经文献检索，未见与本发明的相同报道。
【发明内容】
:
[0005]本发明的目的是提供一种操作简便易行的昆明裂腹鱼鳍细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，以满足对昆明裂腹鱼快速核型分析、种质资源保存和理论研究的需要。
[0006]本发明的昆明裂腹鱼鳍细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，其具体步骤如下:
[0007]( I)制备PBS消毒液和细胞培养液
[0008]PBS消毒液:向PBS中加入抗生素，使青霉素浓度为200IU/ml,链霉素浓度为200 μ g/ml，庆大霉素浓度为20 μ g/ml，两性霉素B浓度为20 μ g/ml ；
[0009]基础培养液:向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10% ；
[0010]原代培养液:向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为10ng/ml，青霉素浓度为200IU/ml，链霉素浓度为200 μ g/ml，庆大霉素浓度为20 μ g/ml，两性霉素B浓度为20 μ g/ml ；
[0011]传代培养液:向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为6ng/ml，青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为100 μ g/ml，两性霉素B浓度为10 μ g/ml ；
[0012]调节上述培养液的pH值为7.0-7.2，放置于4°C冰箱中保存备用；
[0013](2)原代培养
[0014]以75%的酒精消毒昆明裂腹鱼鱼体三次，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其腹鳍，置于无菌培养皿中，PBS消毒液清洗腹鳍组织5次后，用无菌器械剪成组织小块，并将其接种于25cm2细胞培养瓶中，加入原代培养液5ml于20°C培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第2天细胞开始从组织块中迁移，20天长成细胞单层；
[0015](3)传代培养
[0016]原代腹鳍细胞铺满瓶底80%后开始传代，传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.1%的胰蛋白酶-EDTA溶液1ml，消化2min，细胞变圆后，加入传代培养液Iml以中和胰酶反应，吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按体积比1:1传，此后按体积比1:2或1:3进行传代，于20°C培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功；
[0017](4)细胞冻存与复苏
[0018](a)配制细胞冻存保护液:冻存液包括DMEM/F12培养液，胎牛血清和DMS0，按7:2:1的体积比混合，现用现配；
[0019](b)细胞冻存:取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心8min，弃掉上清液，向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度为I 乂106个/ml，将Iml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，_80°C过夜，然后放入液氣中长期保存；
[0020](c)细胞复苏:将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融化，然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量基础培养液，IOOOrpm离心8min，除上清液，用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，20°C培养箱中培养，7天细胞即长成单层。
[0021]本发明的各步骤中所用百分比均为体积百分比
[0022]本发明的显著效果在于:
[0023]1、操作简便易行。
[0024]2、腹鳍组织块中刚迁移出来的细胞具有活性，且细胞量大，能用于染色体分析。
[0025]3、构建的昆明裂腹鱼腹鳍细胞系形态为成纤维样，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对昆明裂腹鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要；
[0026]4、该 构建方法也适用于其他鱼类构建腹鳍细胞系。
【具体实施方式】:
[0027]本实施例的昆明裂腹鱼鳍细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，其具体步骤如下:[0028]( I)制备PBS消毒液和细胞培养液
[0029]PBS消毒液:向PBS中加入抗生素，使青霉素浓度为200IU/ml,链霉素浓度为200 μ g/ml，庆大霉素浓度为20 μ g/ml，两性霉素B浓度为20 μ g/ml ；
[0030]基础培养液:向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10% ；
[0031]原代培养液:向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为10ng/ml，青霉素浓度为200IU/ml，链霉素浓度为200 μ g/ml，庆大霉素浓度为20 μ g/ml，两性霉素B浓度为20 μ g/ml ；
[0032]传代培养液:向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为6ng/ml，青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为100 μ g/ml，两性霉素B浓度为10 μ g/ml ；
[0033]调节上述培养液的pH值为7.0或7.2，放置于4°C冰箱中保存备用；
[0034](2)原代培养
[0035]以75%的酒精消毒昆明裂腹鱼鱼体三次，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其腹鳍，置于无菌培养·皿中，PBS消毒液清洗腹鳍组织5次后，用无菌器械剪成组织小块，并将其接种于25cm2细胞培养瓶中，加入原代培养液5ml于20°C培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第2天细胞开始从组织块中迁移，20天长成细胞单层；
[0036](3)传代培养
[0037]原代腹鳍细胞铺满瓶底80%后开始传代，传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.1%的胰蛋白酶-EDTA溶液1ml，消化2min，细胞变圆后，加入传代培养液Iml以中和胰酶反应，吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按体积比1:1传，此后按体积比1:2或1:3进行传代，于20°C培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功；
[0038](4)细胞冻存与复苏
[0039](a)配制细胞冻存保护液:冻存液包括DMEM/F12培养液，胎牛血清和DMS0，按7:2:1的体积比混合，现用现配；
[0040](b)细胞冻存:取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心8min，弃掉上清液，向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度为I 乂106个/ml，将Iml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，_80°C过夜，然后放入液氣中长期保存；
[0041](c)细胞复苏:将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融化，然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量基础培养液，IOOOrpm离心8min，除上清液，用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，20°C培养箱中培养，7天细胞即长成单层。
[0042](5)各步骤中所用百分比均为体积百分比。
【权利要求】
1.一种昆明裂腹鱼鳍细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，其特征在于该方法的具体步骤如下: (1)制备PBS消毒液和细胞培养液 PBS消毒液:向PBS中加入抗生素,使青霉素浓度为200IU/ml,链霉素浓度为200 μ g/ml,庆大霉素浓度为20 μ g/ml，两性霉素B浓度为20 μ g/ml ； 基础培养液:向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10% ； 原代培养液:向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为10ng/ml，青霉素浓度为200IU/ml，链霉素浓度为`200 μ g/ml，庆大霉素浓度为20 μ g/ml，两性霉素B浓度为20 μ g/ml ； 传代培养液:向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为6ng/ml，青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为`100 μ g/ml，两性霉素B浓度为10 μ g/ml ； 调节上述培养液的PH值为7.0-7.2，放置于4°C冰箱中保存备用； (2)原代培养 以75%的酒精消毒昆明裂腹鱼鱼体三次，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其腹鳍，置于无菌培养皿中，PBS消毒液清洗腹鳍组织5次后，用无菌器械剪成组织小块，并将其接种于25cm2细胞培养瓶中，加入原代培养液5ml于20°C培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第2天细胞开始从组织块中迁移，20天长成细胞单层； (3)传代培养 原代腹鳍细胞铺满瓶底80%后开始传代，传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.1%的胰蛋白酶-EDTA溶液1ml，消化2min，细胞变圆后，加入传代培养液Iml以中和胰酶反应，吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按体积比1:1传，此后按体积比1:2或1:3进行传代，于20°C培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功； (4)细胞冻存与复苏 Ca)配制细胞冻存保护液:冻存液包括DMEM/F12培养液，胎牛血清和DMS0，按7:2:1的体积比混合，现用现配； (b)细胞冻存:取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心8min，弃掉上清液，向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度为I X IO6个/ml，将Iml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，_80°C过夜，然后放入液氣中长期保存； (c)细胞复苏:将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融化，然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量基础培养液，IOOOrpm离心8min，除上清液，用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，20°C培养箱中培养，7天细胞即长成单层。 (5)各步骤中所用百分比均为体积百分比。
【文档编号】C12N5/071GK103436490SQ201310400065
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】王晓爱, 潘晓赋, 杨君兴, 陈小勇, 刘倩 申请人:中国科学院昆明动物研究所