一种齐口裂腹鱼cGnRH Ⅱ基因克隆的方法
【专利摘要】本发明涉及一种齐口裂腹鱼cGnRH?II基因克隆的方法，具体包括以下步骤：(1)脑组织RNA的提取：总RNA提取采用TIANGEN试剂；(2)RACE扩增，具体包括：(2a)cDNA第一链合成；(2b)PCR扩增；(2c)RACE引物设计；(2d)5’-RACE；(2e)3’-RACE；(3)目的片段进行分离和回收；(4)感受态细胞制备；(5)连接和转化；(6)质粒DNA抽提。本发明技术提供了一种高效、方便的获取齐口裂腹鱼chicken?GnRHII基因的全长序列的方法，填补了该基因在齐口裂腹鱼上的空白，为进一步研究齐口裂腹鱼的该基因奠定了基础。
【专利说明】—种齐口裂腹鱼cGnRH II基因克隆的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种齐口裂腹鱼cGnRH II基因克隆的方法，属于基因克隆【技术领域】。【背景技术】
[0002]促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone, GnRH),又称促黄体素释放激素(lutein1-zing hormone-releasing hormone, LHRH),是由下丘脑分泌的十肽激素，是动物生殖过程中最重要的激素之一。GnRH脉冲式释放刺激垂体促性腺激素(GTH)的合成和分泌从而调节性激素的分泌，是性腺轴系的原动力，对性腺还可能具有直接作用。GnRH已被证明是下丘脑一垂体一性腺轴(hypothalamus-pituitary-gonadalaxis, HPG)的关键信号分子。GnRH家族中最保守的是chicken GnRH II (chicken-11-typeGonadotropin-releasing hormone, cGnRH II)，它随同其他分子形式的GnRH共同存在于大多数脊椎动物中，存在于所有的有颌类包括人类中。
[0003]近年来，随着PCR技术的快速兴起和成熟，cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplification of cDNA Ends, RACE)为简洁方便的基因克隆发展道路指出了新的方向。RACE是利用PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA末端的方法，又称为锚定或单边PCR，一般有两种RACE方法，分别用于扩增3'端或5'端。5' RACE比3' RACE更具有挑战性，其特异性较低，产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。最终质量取决于扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA5端结构的复杂度和丰度及产物的长度等因素。可利用巢式引物扩增(最多进行三轮巢式扩增)，增加逆转录保温温度和PCR退火温度，降低扩增反应中的镁离子浓度等方法增加5' RACE的特异性。SMART反转录酶法RACE技术比较而言是中最为成熟的。但是对于不同的试验对象仍然需要一定的改进。DTT是一种蛋白质保护剂， 此外还有解开mRNA链5'端高级结构的作用。RACE技术的成功应用已经显示出它是一种高效简便的技术手段。它除了在获得全长cDNA序列方面的应用外，随着生物学各项技术的交叉利用，对RACE技术的改良和发展，伴随着优化条件下PCR扩增效率和忠实度的提高以及PCR产物克隆技术的进步，相信RACE技术在基因克隆以及RNA剪接、基因家族和基因表达变化等多项领域。
[0004]目前，所采用的技术有:RT_PCR克隆:是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)以及分子克隆相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的基因片段，将合成的目的基因片段克隆到载体细胞基因中，然后用质粒PCR产物测序。该技术缺点在于:克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病，即实验操作繁琐，周期较长、工作量繁重，且不易得到全长cDNA序列。另外，也有采用分段PCR克隆法:将目的基因分成几段来分别克隆，然后做亚克隆测序拼接。成本高，工作量大耗时，一个基因分成几段就需要做几次克隆，然后再做序列接拼。该技术缺点为:克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病，即实验操作繁琐，周期较长、工作量繁重，且不易得到全长cDNA序列。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种高效、方便的获取齐口裂腹鱼ch1cken GnRH 11基因的全长序列的方法，填补了该基因在齐口裂腹鱼上的空白，为进一步研究齐口裂腹鱼的该基因奠定了基础。
[0006]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
[0007]一种齐口裂腹鱼cGnRH 11基因克隆的方法，具体包括以下步骤:
[0008](1)脑组织RNA的提取--总RNA提取采用TaKaRa试剂，具体步骤如下:
[0009](1a)从_80°C冰箱中取出冻存组织，取1OOmg左右，放入高温灭菌处理过的研钵中，加入液氮，磨成粉末；
[0010](1b)向1.5ml离心管于加入1ml预冷的Tr1zol裂解液，迅速把组织粉末放置于离心管中，剧烈振荡5m1n，使其充分溶解；
[0011](1c)VC条件下12000rpm离心1Om1n,然后吸取上清的Tr1zol裂解液至新的1.5ml离心管中,冰上放置5分钟；
[0012](1d)吸取0.2ml氯仿加入离心管中，激烈振荡15s，室温静置5m1n，4°C条件下13000rpm离心lOm1n，将上层水相转移至新的EP管中；
[0013](1e)加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，冰上沉淀10分钟；
[0014](lf)4°C条件下12000rpm离心10分钟，在管底可见胶状RNA沉淀，小心地弃上清；
[0015](1g)加入冷的75%乙醇1ml，混匀，4°C条件下7500rpm离心5分弃上清；倾斜离心管，用枪头吸去管壁的液体，待RNA略干后，加入20~50 μ 1DEPC水溶解，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，剩余RNA保存于-80°C冻存备用。
[0016]⑵RACE 扩增:
[0017](2a) cDNA 第一链合成:使用 Pr1merScr1pt RT reagent K1t W1th gDNAEraser (TaKaRa)逆转录试剂盒，具体步骤为:齐口裂腹鱼全脑总RNAl μ g，50 μ mol/L Ol1go (dT)弓丨物 1yL, 5 XM-MLV bufferlO μ L, 10mmol/L dNTP2.5 μ L, 40U/μ L RNase1nh1b1tor0.5μ L,200U/y L RTase M-MLV1 μ L ;于 42°C反应 lh。反应结束后置于 _20°C保存。
[0018](2b)PCR扩增:采用Prem1er5和DNAMAN软件，根据GenBank中公布鲤科鱼类ch1cken GnRH 11的保守序列的一致性，分布设计四对引物，在B1o-Rad PCR扩增仪上进行，变性温度、退火温度和延伸温度根据引物的Tm值和目的片段大小而定；PCR扩增得到部分cDNA片段序列，序列由华大集团有限公司测序。
[0019](2c) RACE引物设计:根据已获得ch1cken GnRH 11保守序列分别设计设计RACE的巢式引物:3’上游特异性引物1，3’上游特异性引物2 ;5’下游特异性引物1，5’下游特异性引物。
[0020](2d)5’ -RACE:按照试剂盒的操作流程进行，首先进行反转录反应，制备5f -RACE-Ready cDNA，其具体流程为:
[0021]①取0.5μ 1 Eppendorf 管，加入 1 μ 1全脑总 RNA、1 μ 15' -CDS 引物、1 μ 1 SMART1 ol1go引物(10 μ mol/L)和2 μ 1灭菌水，轻轻混匀，于70°C加热2m1n，置冰上冷却2m1n ;
[0022]②离心使液体沉底.加入2μ 15X第1链缓冲液、1μ 1 DTT(20mmol/L)、1 μ 1dNTP (1Ommo 1/L)和1μ 1 MMLV逆转录酶(200U/μ 1)，随后用小枪头轻轻吹打混匀；[0023]③离心使液体沉底.反转录于42°C 1.5h，加入100 μ I灭菌水，于70°C加热2min终止反转录反应，冻存于_20°C备用；
[0024]④随后,采用通用引物混合物(universal primer mix, UPM)和下游特异性引物I进行“ Touchdown” PCR扩增，向50 μ I PCR反应管中加入以下试剂:34.5μ I去离子水、5 μ 110XAdvantage2PCR 缓冲液、I μ I dNTP (10mmol/L)、I μ 150 X Advantage2PolymeraseMix,5 μ I UPM(IOX) U μ I P121 (10 μ mol/L)和 2.5 μ 15’-RACE-Ready cDNA，振荡混匀、离心沉底，覆以2滴石腊油，在Bio-Rad PCR分析仪启动PCR反应；
[0025]⑤将前一步获得的反应液为模板，以下游特异性引物2和UPM为引物，用Ex Taq酶PCR，反应条件如下:94°C变性5min ;94°C反应30s，72°C反应3min，进行5次循环；94°C反应30s，70°C反应30s，72°C反应2min，进行5次循环；94°C反应30s，68°C反应30s，72°C反应2min，进行25次循环；然后72°C延伸IOmin ；
[0026]⑥用1.2%琼脂糖凝胶电泳并回收所需条带，克隆至pMD-19T载体上，进行测序。
[0027](2e) 3’ -RACE:3’ RACE第一链cDNA合成反应50 μ L体系包括:齐口裂腹鱼全脑总RNAly g, 50 μ mol/L Oligo (dT)引物 I μ L，5 XM-MLV bufferlO μ L, 10mmol/LdNTP2.5 μ L,40U/y L RNase Inhibitor0.5 μ L, 200U/μ L RTase M-MLVl μ L ;于 42°C 反应 Ih ;降落和巢式PCR方法体系同5’ -RACE。
[0028](3)目的片段的分离和回收，具体步骤如下:
[0029](3a)从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块；
`[0030](3b)凝胶称重后并将其放入1.5mL管中，将其适当切小，加速溶解；每IOOmg凝胶加入 400 μ LSolution SN。
[0031](3c)凝胶溶解:55~60°C,保温5_10min,每2min混匀一下,使凝胶溶解,胶完全融化后每 400 μ L Solution SN 中加入 Solution BlOO μ L,混匀；
[0032](3d)将3S柱装入2mL洗管，将上述混合液转移至3S柱，室温放置2min.室温10000r/min 离心 lmin,稳定 45S ；
[0033](3e)取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，加入700 μ Lffash Solution,室温 10000r/min 离心 lmin。
[0034](3f)重复步骤3e —次。
[0035](3g)取下3S柱，倒掉收集管中废液，将3S柱放入同一收集管中，室温10000r/min离心2min。
[0036](3h)将3S柱放入新的离心管中，在3S柱子膜中央加30 μ L ddH20，不加盖室温放置 2min。
[0037](3i)盖上离心管，室温10000r/min离心lmin，离心管中的液体即为回收的DNA片段，-20°C保存备用。
[0038](4)感受态细胞制备，具体步骤如下:
[0039]用无菌钼丝直接醮取E.coli DH5a菌株，在LB平板表面划线，37°C倒置培养过夜；从LB平板上挑取单菌落，接种于3mL LB液体培养基中，37°C震荡培养过夜；取30μ L培养液接种于3mL LB液体培养基，37°C震荡培养2.5h，至肉眼能看到微微浑浊；将培养液转入 1.5mLEppendorf 管，冰浴 IOmin ;4°C、4000r/minX5min,弃上清;用预冷的 75mmol/L CaCl2750 μ L轻轻悬浮细胞，冰浴30min ;4 °C、4000r/min X 4min,弃上清；加入预冷的75mmol/L CaCl2(内含甘油终浓度为15 %) 200 μ L，轻轻悬浮，冰浴至少4h，即成感受态细胞悬液，分装后-80°C保存。
[0040](5)连接和转化:
[0041](5a)连接:在微离心管中依次加入PCR纯化产物4 μ L (约0.4 μ g)，载体PMD19-T1 μ L, Solution 15 μ L ;16°C水浴反应 12h。
[0042](5b)转化:取200 μ L ToplO感受态细胞悬液，加入连接溶液10 μ L，轻轻混匀，冰上放置30min ;42°C水浴1.5min，冰上放置2.5min，加入lmL37°C预热的液体培养基，37°C预表达lh，使细胞恢复正常生长状态；4°C，3500r/minX5min，将菌液浓缩至200μ?，分别加入10 μ L的IPTG和X-gal，轻轻悬浮细胞，将菌液均匀涂布在含Amp+的LB固体培养基上，37°C正面放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，37 1:倒置培养过夜。
[0043](6)质粒DNA抽提:挑取转化后的白色单菌落，分别接种于2mL含适当Amp+抗生素的LB培养基，37°C下225r/min振荡培养过夜，具体按照质粒小量快速抽提试剂盒的说明书进行操作，使用BamH I和Sal I酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将阳性克隆菌液大约500mL进行测序。.[0044]该发明的有益效果在于:本发明技术提供了一种高效、方便的获取齐口裂腹鱼chicken GnRH II基因的全长序列的方法，填补了该基因在齐口裂腹鱼上的空白，为进一步研究齐口裂腹鱼的该基因奠定了基础。 【具体实施方式】
[0045]下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行描述，以便更好的理解本发明。
[0046]实施例
[0047]一种齐口裂腹鱼cGnRH II基因克隆的方法，具体包括以下步骤:
[0048](1)脑组织RNA的提取--总RNA提取采用TaKaRa试剂，具体步骤如下:
[0049](1a)从_80°C冰箱中取出冻存组织，取IOOmg左右，放入高温灭菌处理过的研钵中，加入液氮，磨成粉末；
[0050](1b)向1.5ml离心管于加入Iml预冷的Trizol裂解液，迅速把组织粉末放置于离心管中，剧烈振荡5min，使其充分溶解；
[0051](1c)VC条件下12000rpm离心IOmin,然后吸取上清的Trizol裂解液至新的
1.5ml离心管中,冰上放置5分钟；
[0052](1d)吸取0.2ml氯仿加入离心管中，激烈振荡15s，室温静置5min，4°C条件下13000rpm离心lOmin，将上层水相转移至新的EP管中；
[0053](1e)加入0.5mi异丙醇，颠倒数次混匀，冰上沉淀10分钟；
[0054](lf)4°C条件下12000rpm离心10分钟，在管底可见胶状RNA沉淀，小心地弃上清；
[0055](1g)加入冷的75%乙醇1ml，混匀，4°C条件下7500rpm离心5分弃上清；倾斜离心管，用枪头吸去管壁的液体，待RNA略干后，加入20~50 μ IDEPC水溶解，1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，剩余RNA保存于-80°C冻存备用。
[0056](2) RACE 扩增:
[0057](2a) cDNA 第一链合成:使用 PrimerScript RT reagent Kit With gDNAEraser (TaKaRa)逆转录试剂盒，具体步骤为:齐口裂腹鱼全脑总RNAl μ g，50 μ mol/L Oligo (dT)弓丨物 lyL，5XM-MLV bufferlO μ L，IOmmo 1/L dNTP2.5 μ L, 40U/μ L RNaseInhibitor0.5μ L,200U/y L RTase M-MLV1 μ L ;于 42°C反应 lh。反应结束后置于 _20°C保存。
[0058](2b) PCR扩增:采用Premi er5和DNAMAN软件，根据GenBank中公布鲤科鱼类chicken GnRH II的保守序列的一致性，分布设计四对引物，在Bio-Rad PCR扩增仪上进行，变性温度、退火温度和延伸温度根据引物的Tm值和目的片段大小而定；PCR扩增得到部分cDNA片段序列，序列由华大集团有限公司测序。
[0059](2c) RACE引物设计:根据已获得chicken GnRH II保守序列分别设计设计RACE的巢式引物:3’上游特异性引物1，3’上游特异性引物2 ;5’下游特异性引物1，5’下游特异性引物。
[0060](2d)5’ -RACE:按照试剂盒的操作流程进行，首先进行反转录反应，制备 -RACE-Ready cDNA，其具体流程为:
[0061]①取0.5μ I Eppendorf 管，加入 I μ I全脑总 RNA、I μ 15' -CDS 引物、I μ I SMARTI oligo引物(10 μ mol/L)和2 μ I灭菌水，轻轻混匀，于70°C加热2min，置冰上冷却2min ;
[0062]②离心使液体沉底.加入2μ 15X第I链缓冲液、1μ I DTT(20mmol/L)、I μ IdNTP (IOmmo 1/L)和1μ I MMLV逆转录酶(200U/μ I)，随后用小枪头轻轻吹打混匀；
[0063]③离心使液体沉底.反转录于42°C 1.5h，加入100 μ I灭菌水，于70°C加热2min终止反转录反应，冻存于_20°C备用；
[0064]④随后,采用通用引物混合物(universal primer mix, UPM)和下游特异性引物I进行“ Touchdown” PCR扩增，向50 μ I PCR反应管中加入以下试剂:34.5μ I去离子水、5 μ 110XAdvantage2PCR 缓冲液、I μ I dNTP (10mmol/L)、I μ 150 X Advantage2PolymeraseMix,5 μ I UPM(IOX)、1 μ I Ρ121 (10 μ mol/L)和2.5 μ 15’-RACE-Ready cDNA，振荡混匀、离心沉底，覆以2滴石腊油，在Bio-Rad PCR分析仪启动PCR反应；
[0065]⑤将前一步获得的反应液为模板，以下游特异性引物2和UPM为引物，用Ex Taq酶PCR，反应条件如下:94°C变性5min ;94°C反应30s，72°C反应3min，进行5次循环；94°C反应30s，70°C反应30s，72°C反应2min，进行5次循环；94°C反应30s，68°C反应30s，72°C反应2min，进行25次循环；然后72°C延伸IOmin ；
[0066]⑥用1.2%琼脂糖凝胶电泳并回收所需条带，克隆至pMD-19T载体上，进行测序。
[0067](2e) 3’ -RACE:3’ RACE第一链cDNA合成反应50 μ L体系包括:齐口裂腹鱼全脑总RNAly g, 50 μ mol/L Oligo (dT)引物 I μ L，5 XM-MLV bufferlO μ L，IOmmo 1/L dNTP2.5 μ L,40U/y L RNase Inhibitor0.5 μ L, 200U/μ L RTase M-MLVl μ L ;于 42°C 反应 Ih ;降落和巢式PCR方法体系同5’ -RACE。
[0068](3)目的片段的分离和回收，具体步骤如下:
[0069](3a)从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块；
[0070](3b)凝胶称重后并将其放入1.5mL管中，将其适当切小，加速溶解；每IOOmg凝胶加入 400 μ LSolution SN。
[0071](3c)凝胶溶解:55~60°C,保温5_10min,每2min混匀一下,使凝胶溶解,胶完全融化后每 400 μ L Solution SN 中加入 Solution BlOO μ L,混匀；
[0072](3d)将3S柱装入2mL洗管，将上述混合液转移至3S柱，室温放置2min.室温lOOOOr/min 离心 lmin,稳定 45S ；
[0073](3e)取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，加入700 μ LWash Solution,室温 10000r/min 离心 lmin。
[0074](3f)重复步骤3e —次。
[0075](3g)取下3S柱，倒掉收集管中废液，将3S柱放入同一收集管中，室温10000r/min离心2min。
[0076](3h)将3S柱放入新的离心管中，在3S柱子膜中央加30 μ L ddH20，不加盖室温放置 2min。
[0077](3i)盖上离心管，室温10000r/min离心lmin，离心管中的液体即为回收的DNA片段，-20°C保存备用。
[0078](4)感受态细胞制备，具体步骤如下:
[0079]用无菌钼丝直接醮取E.coli DH5a菌株，在LB平板表面划线，37°C倒置培养过夜；从LB平板上挑取单菌落，接种于3mL LB液体培养基中，37°C震荡培养过夜；取30μ L培养液接种于3mL LB液体培养基，37°C震荡培养2.5h，至肉眼能看到微微浑浊；将培养液转入 1.5mLEppendorf 管，冰浴 IOmin ;4°C、4000r/minX5min,弃上清；用预冷的 75mmol/L CaCl2750 μ L轻轻悬浮细胞，冰浴30min ;4 °C、4000r/min X 4min,弃上清；加入预冷的75mmol/L CaCl2 (内含甘油终浓度为15 %) 200 μ L，轻轻悬浮，冰浴至少4h，即成感受态细胞悬液，分装后-80°C保存。
`[0080](5)连接和转化:
[0081](5a)连接:在微离心管中依次加入PCR纯化产物4 μ L (约0.4 μ g)，载体PMD19-T1 μ L, Solution 15 μ L ;16°C水浴反应 12h。
[0082](5b)转化:取200 μ L ToplO感受态细胞悬液，加入连接溶液10 μ L，轻轻混匀，冰上放置30min ;42°C水浴1.5min，冰上放置2.5min，加入lmL37°C预热的液体培养基，37°C预表达lh，使细胞恢复正常生长状态；4°C，3500r/minX5min，将菌液浓缩至200μ?，分别加入10 μ L的IPTG和X-gal，轻轻悬浮细胞，将菌液均匀涂布在含Amp+的LB固体培养基上，37°C正面放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，37 1:倒置培养过夜。
[0083](6)质粒DNA抽提:挑取转化后的白色单菌落，分别接种于2mL含适当Amp+抗生素的LB培养基，37°C下225r/min振荡培养过夜，具体按照质粒小量快速抽提试剂盒的说明书进行操作，使用BamH I和Sal I酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将阳性克隆菌液大约500mL进行测序。
[0084]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种齐口裂腹鱼CGnRH II基因克隆的方法，其特征在于:具体包括以下步骤: (1)脑组织RNA的提取--总RNA提取采用TaKaRa试剂； (2)RACE扩增，具体包括: (2a) cDNA 第一链合成:使用 PrimerScript RT reagent Kit With gDNAEraser (TaKaRa)逆转录试剂盒，具体步骤为:齐口裂腹鱼全脑总RNAl μ g，50 μ mol/L Oligo(dT)弓丨物 lyL，5XM-MLV buffer 10 μ L，IOmmo 1/L dNTP2.5 μ L, 40U/μ L RNaseInhibitor0.5μ L,200U/y L RTase M-MLV1 μ L ;于 42°C反应 Ih ;反应结束后置于 _20°C保存； (2b)PCR扩增:采用Premier5和DNAMAN软件，根据GenBank中公布鲤科鱼类cGnRH II的保守序列的一致性，分布设计一对引物，在Bio-Rad PCR扩增仪上进行，变性温度、退火温度和延伸温度根据引物的Tm值和目的片段大小而定；PCR扩增得到部分cDNA片段序列予以测序； (2c)RACE引物设计:根据已获得cGnRH II保守序列分别设计设计RACE的巢式引物:3’上游特异性引物1，3’上游特异性引物2 ;5’下游特异性引物1，5’下游特异性引物； (2d)5’ -RACE:按照试剂盒的操作流程进行，首先进行反转录反应，制备5' -RACE-Ready cDNA ； (2e)3，-RACE:3’ RACE第一链cDNA合成反应50yL体系包括:齐口裂腹鱼全脑总RNAly g,50ymol/L Oligo (dT)引物 I μ L，5 XM-MLV bufferlO μ L, 10mmol/LdNTP2.5 μ L,40υ/μ L RNase Inhibitor0.5 μ L, 200U/μ L RTase M-MLVl μ L ;于 42°C 反应 Ih ;降落和巢式PCR方法体系同5’ -RACE ； (3)目的片段进行分离和回收； (4)感受态细胞制备，具体步骤如下:用无菌钼丝直接醮取E.coli DH5a菌株，在LB平板表面划线，37°C倒置培养过夜；从LB平板上挑取单菌落，接种于3mL LB液体培养基中，37 °C震荡培养过夜；取30μ L培养液接种于3mL LB液体培养基，37 °C震荡培养2.5h，至肉眼能看到微微浑池；将培养液转入1.5mL Eppendorf管，冰浴IOmin ；4°C>4000r/minX5min,弃上清；用预冷的75mmol/L CaCl2750 μ L轻轻悬浮细胞，冰浴30min ;4°C、4000r/minX4min，弃上清；加入预冷的75mmol/L CaCl2 (内含甘油终浓度为15% ) 200 μ L，轻轻悬浮，冰浴至少4h，即成感受态细胞悬液，分装后_80°C保存； (5)连接和转化: (5a)连接:在微离心管中依次加入？0?纯化产物4 4 1^(约0.4 4 8)，载体？1?19-11 μ L，Solution Ι5μ L ;16°C水浴反应 12h ; (5b)转化:取200 μ L ToplO感受态细胞悬液，加入连接溶液10 μ L，轻轻混匀，冰上放置30min ;42°C水浴1.5min，冰上放置2.5min，加入lmL37°C预热的液体培养基，37°C预表达lh，使细胞恢复正常生长状态；4°C，3500r/minX5min,将菌液浓缩至200 μ L，分别加入10 μ L的IPTG和X-gal，轻轻悬浮细胞，将菌液均匀涂布在含Amp+的LB固体培养基上，37°C正面放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，37°C倒置培养过夜； (6)质粒DNA抽提:挑取转化后的白色单菌落，分别接种于2mL含适当Amp+抗生素的LB培养基，37°C下225r/min振荡培养过夜，具体按照质粒小量快速抽提试剂盒的说明书进行操作，使用BamH I和Sal I酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将阳性克隆菌液大约500mL进行测序。
2.根据权利要求1所述的齐口裂腹鱼cGnRHII基因克隆的方法，其特征在于:所述步骤(I)中脑组织RNA的提取的具体步骤如下: (Ia)从_80°C冰箱中取出冻存组织，取IOOmg左右，放入高温灭菌处理过的研钵中，加入液氮，磨成粉末； (Ib)向1.5ml离心管于加入Iml预冷的Trizol裂解液，迅速把组织粉末放置于离心管中，剧烈振荡5min，使其充分溶解； (Ic) 4°C条件下12000rpm离心IOmin,然后吸取上清的Trizol裂解液至新的1.5ml离心管中，冰上放置5分钟； (Id)吸取0.2ml氯仿加入离心管中，激烈振荡15s，室温静置5min，4 °C条件下13000rpm离心lOmin，将上层水相转移至新的EP管中； (Ie)加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，冰上沉淀10分钟； (If) 4°C条件下12000rpm离心10分钟，在管底可见胶状RNA沉淀，小心地弃上清； (Ig)加入冷的75%乙醇1ml，混匀，4°C条件下7500rpm离心5分弃上清；倾斜离心管，用枪头吸去管壁的液体，待RNA略干后，加入20~50 μ I DEPC水溶解，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，剩余RNA保存于-80°C冻存备用。
3.根据权利要求1所述的齐口裂腹鱼cGnRHII基因克隆的方法，其特征在于:所述步骤(2)中制备Y -RACE-Ready cDNA的具体流程为:
①取0.5μ1 Eppend orf 管，加入 1μ I 全脑总 RNA、ly 15' -CDS 引物、I μ I SMART Ioligo引物(10ymol/L)和2μ I灭菌水，轻轻混匀，于70°C加热2min，置冰上冷却2min ； ②离心使液体沉底.加入2μ 15X第I链缓冲液、I μ I DTT(20mmol/L)、1 μ IdNTP(10mmol/L)和1μ I MMLV逆转录酶(200U/μ I)，随后用小枪头轻轻吹打混匀； ③离心使液体沉底.反转录于42°C1.5h，加入100 μ I灭菌水，于70°C加热2min终止反转录反应，冻存于_20°C备用； ④随后，采用通用引物混合物(universalprimer mix, UPM)和下游特异性引物I进行“Touchdown” PCR扩增，向50 μ I PCR反应管中加入以下试剂:34.5μ I去离子水、5 μ 110XAdvantage2PCR 缓冲液、I μ I dNTP (10mmol/L)、I μ 150 X Advantage2PolymeraseMix,5 μ I UPM(IOX)、1 μ I Ρ121 (10 μ mol/L)和2.5 μ 15’-RACE-Ready cDNA，振荡混匀、离心沉底，覆以2滴石腊油，在Bio-Rad PCR分析仪启动PCR反应； ⑤将前一步获得的反应液为模板，以下游特异性引物2和UPM为引物，用ExTaq酶PCR，反应条件如下:94°C变性5min ;94°C反应30s，72°C反应3min，进行5次循环；94°C反应30s，70°C反应30s，72°C反应2min，进行5次循环；94°C反应30s，68°C反应30s，72°C反应2min，进行25次循环；然后72°C延伸IOmin ； ⑥用1.2%琼脂糖凝胶电泳并回收所需条带，克隆至pMD-19T载体上，进行测序。
4.根据权利要求1所述的齐口裂腹鱼cGnRHII基因克隆的方法，其特征在于:所述步骤(3)中目的片段的分离和回收的具体步骤如下: (3a)从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块； (3b)凝胶称重后并将其放入1.5mL管中，将其适当切小，加速溶解；每IOOmg凝胶加入，400 μ LSolution SN;(3c)凝胶溶解:55~60°C,保温5-10min,每2min混匀一下,使凝胶溶解,胶完全融化后每 400 μ L Solution SN 中加入 Solution BlOO μ L，混匀； (3d)将3S柱装入2mL洗管，将上述混合液转移至3S柱，室温放置2min.室温1000Or/min离心Imin,稳定45S ； (3e)取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，加入700 μ LffashSolution,室温 10000r/min 离心 Imin ； (3f)重复步骤3e —次； (3g)取下3S柱，倒掉收集管中废液，将3S柱放入同一收集管中，室温10000r/min离心2min ； (3h)将3S柱放入新的离心管中，在3S柱子膜中央加30 μ L ddH20，不加盖室温放置2min ； (3i)盖上离心管，室温10000r/min离心lmin，离心管中的液体即为回收的DNA片段，-20°C保 存备用。
【文档编号】C12N15/10GK103805596SQ201410040443
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月25日 优先权日:2014年1月25日
【发明者】杨世勇, 王韬, 李志琼 申请人:四川农业大学