Hla-b*15:02等位基因检测方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于卡马西平等精神类药物用药指导的HLA-B*15:02等位基因检测方法，包括提供待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系混合物；通过扩增反应循环扩增靶多核苷酸；使荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；测定荧光发生基团产生的荧光量，确定靶多核苷酸的存在及其相对量。本发明还公开了一种试剂盒，包括分别装有反应液1、反应液2、反应液3、EZ?Taq酶混合液、标准液1、标准液2的多个密封离心管，分隔并集中包装这些离心管的试剂盒。本发明可广泛应用于人HLA-B*15:02等位基因的检测和临床上规避因该等位基因表达而与卡马西平等精神类药物相互作用引起的史蒂芬综合征和中毒性表皮坏死松解症。
【专利说明】HLA-B*15:02等位基因检测方法及其试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种临床上用于卡马西平等精神类药物用药指导的HLA_B*15:02等位基因检测方法及试剂盒，特别是涉及采用实时定量荧光聚合酶链反应技术对HLA-B*15:02等位基因的检测，并将检测结果应用于临床上指导卡马西平等精神类药物使用的方法与试剂盒。
【背景技术】
[0002]药物不良反应(adverse drug reactions,简称ADR)，按照WHO国际药物监测合作中心的规定，系指正常剂量的药物用于预防、诊断、治疗疾病或调节生理机能时出现的有害的和与用药目的无关的反应。药物不良反应，是病患者治疗过程中的巨大隐患。据统计，每年全世界死于不合理用药的人群总数量达1900万人。在美国每年有220万人在服用处方药后会产生副作用。其中死亡的病例超过了 10万，每年用于治疗药物副作用的支出就达40亿美元。在我国，因药物不良反应住院的病人每年约250万人，直接死亡20万人。用药安全已经成为医学界的热点问题。
[0003]HLA(human leukocyte antigen),即人类白细胞抗原是人体重要的免疫遗传体系，也是目前所知人体最复杂的多态系统。HLA作为抗原刺激机体产生相应抗体的性质或分子结构，这是器官移植产生排异反应的主要原因，也是血清学和细胞学配型的基础。在骨髓干细胞移植中最主要的排斥反应是移植物对宿主疾病(Graft Versus HostDisease，GVHD)，这主要是由于移植物中的免疫活性细胞(T细胞)识别并对移植物受体中的HLA和次要组织相容性产生反应的结果。因此在建立骨髓库以及移植手术前必须进行分型。
[0004]近年的研究发现HLA的部分等位基因与某些药物引起的不良反应密切关联。如美国白种人群中进的卡马西平-药物超敏综合征(CBZ-HSS)关联性研究结果表明:HLA-B*0801、HLA-DR3和HLA-DQ2等位基因与CBZ-HSS具有相关性；卡马西平(carbamazepine)、Iamotrigin`e 等精神类药物引起史蒂芬 Stevens-Johnson 综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)与HLA-B*15:02等位基因HLA-A*31:01等们基因相关联。在亚裔人群中以HLA-B*15:02为主，因此亚裔患者服用卡马西平风险比西方人群高
10倍(Celeste B.L.Man, Patrick Kwan, et.Association between HLA-B □ 1502Alleleand Antiepileptic Drug-1nduced Cutaneous React ions in Han Chinese.Epilepsia, 48(5): 1015 1018，2007)。HLA等位基因的分型检测可识别特定的HLA多态基因型。通过已知的多态基因型与药物疗效及毒性的关系，指导相关疾病的给药，对规避药物不良反应，倡导安全用药有着重要的影响与意义。
[0005]目前，HLA等位基因分型检测的常用方法主要是基于核酸序列识别的方法，主要有PCR-SSOP(Sequence Specific Oligonucleotide Probes)法、PCR-SSP(Sequence-specificprimers)法和 PCR-SBT(Sequence-Based Typing)法。其中，PCR-SBT 测序方法更是现世界卫生组织(WHO)推荐的HLA分型方法的“金标准”。此类方法具有灵敏度高，特异性强，样本需求量少等优点。但是，拥有众多优点的同时，此类方法也存在着操作繁琐，耗时长，成本高昂等缺点。尤其，操作繁琐，耗时长等缺点已经逐渐不能满足现代医学检测需要，不适应现代医学检验所要求的“快速、简便”的理念。实时荧光定量PCR (FQ-PCR)是近年在普通PCR基础上发展起来的核酸检测方法，它将荧光值的积累与PCR产物的扩增过程相结合，通过测量指数扩增期的荧光值来计算待测样本中核酸的原始量。相较于传统的HLA等位基因分型检测方法，FQ-PCR除了具有灵敏度高、特异性强等特点外，还具有着操作简便、耗时短、可定量等传统方法无可比拟的优点将FQ-PCR应用于HLA等位基因的分型检测是PCR【技术领域】的一项创新。Taqman PCR技术是FQ-PCR技术中更具技术优势的一种，本发明即将Taqman PCR技术应用于HLA_B*15:02等位基因的检测，使Taqman PCR的技术优点(灵敏度高、特异性强、着操作简便、耗时短、可定量)在HLA-B*15:02等位基因检测中得到完美继承的同时对HLA-B*15:02等位基因的纯合型和杂合型进行了鉴定。本发明涉及的试剂盒可广泛应用于人HLA-B*15:02等位基因的检测，指导临床上卡马西平等精神类药物的使用，规避HLA-B*15:02基因型患者在使用卡马西平等精神类药物后可能引起史蒂芬综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种HLA_B*15:02等位基因检测方法及其试剂盒，以克服现有技术存在的上述缺陷。
[0007]本发明的一个目的是提供一种HLA_B*15:02等位基因检测方法，该方法包括如下步骤:
[0008](I)提供包括待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物； [0009](2)通过扩增反应循 环扩增待测样品中的靶多核苷酸；
[0010](3)使所述荧光检测体系中的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；
[0011](4)测定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶多核苷酸的存在及其相对量。
[0012]所述核酸扩增体系由如下组分组成:耐热DNA聚合酶、2’ -脱氧核苷三磷酸、能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物a和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物a，能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物b和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物b ；
[0013]所述荧光检测体系是能够与靶多核苷酸结合并且两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的两条寡核苷酸探针。
[0014]作为一种优选的技术方案，本发明所述核酸扩增体系和荧光检测体系共3组，其中:
[0015]核酸扩增体系I中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物I和引物2，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系I中所使用的寡核苷酸探针为探针I和探针4 ；
[0016]核酸扩增体系II中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物3和引物4，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系II中所使用的寡核苷酸探针为探针2和探针4 ；[0017]核酸扩增体系III中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物5和引物6，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系III中所使用的寡核苷酸探针为探针3和探针4 ；
[0018]其中，各引物和探针具体组成如下:
[0019]引物1-6来源于人HLA-B位点的基因序列，引物I位于102-123位，含21个碱基，引物2位于202-221位，含19个碱基，扩增片段长度为120bp ;引物3位于1244-1262位，含18个碱基，引物4位于1371-1386位，含17个碱基，扩增片段长度为143bp ;引物5位于2924-2943位，含19个碱基，引物6位于3065-3083位，含18个碱基，扩增片段长度为160bp ;引物7、8来自源人β -globin基因组序列的HBB基因(62137-63742)，引物7位于62627-62647位，含19个碱基，引物8位于62756-62775位，含18个碱基，扩增片段长度为149bp。探针1-3分别来源于HLA-B位点基因序列的122-146位、1256-1276位和3038-3061位；探针4来源于人β -globin基因序列反向序列的62731-62755位。
[0020]可使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的FAM或HEX，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联的作为荧光淬灭基团的TAMRA或BHQ。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针，然后使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20%)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针的纯度。
[0021]所述扩增反应循环是重复35-45次的聚合酶链反应循环。
[0022]所述待测样品是指需要检测其中是否含有HLA_B*15:02基因型的临床血液样本。
[0023]所述靶多核苷酸来自人血液全基因组DNA。
[0024]作为本发明的一 个优选实施方案，步骤(4)中，先确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环数；然后将上述测定的阈循环数与标准溶液中的靶多核苷酸的阈循环数相比较，以确定样品中靶多核苷酸的相对量，从而判断样品包含靶多核苷酸基因的纯合型与杂合型。
[0025]使用磁珠法或DNA柱回收法(可购买市售DNA提取试剂盒)从得自受试者的血液样本中提取基因组DNA，然后将提取合格的DNA产物用于后续的PCR扩增。
[0026]在含有引物1、2和引物7、8，探针1、4，0嫩模板(？0?扩增靶序列)，(1见1^(101111)，耐热DNA聚合酶，Mg2+，PCR缓冲液和水的反应体系中(体系I );含有引物3、4和引物7、8，探针2、4，DNA模板(PCR扩增靶序列)，dNTPs (10mM)，耐热DNA聚合酶，Mg2+，PCR缓冲液和水的反应体系中(体系II);含有引物5、6和引物7、8，探针3、4，DNA模板(PCR扩增靶序列)，dNTPs (10mM)，耐热DNA聚合酶，Mg2+，PCR缓冲液和水的反应体系中(体系III);使用ABI7500,Roche Light Cycler480,Mx3000P等其它结构类似的自动荧光检测热循环仪上对如上得到的DNA序列进行PCR扩增。所使用的反应条件是:96°C预变性3分钟，95°C 30秒—65 0C 45秒，共进行35个循环；最后25°C下至少30秒。
[0027]1.无效结果判定:与存在于体系1、I1、111中的寡核苷酸荧光探针4相关的扩增曲线不呈现“S”型或Ct值空白又或Ct值> 30的样本，报告为无效；
[0028]2.阳性结果判定:满足与体系I和体系II中的寡核苷酸探针1、探针2和探针4相关的扩增曲线呈现“S”型且同体系中探针1、探针2和探针4的CT值< 30，同时体系III中的寡核苷酸探针3的CT值空白且体系中III探针4的CT值< 30的样本，报告为阳性；[0029]3.阴性结果判定:属于无效结果判定和阳性结果判定以外的情况则报告为阴性；
[0030]可利用已知为HLA_B*15:02纯合型和杂合型等位基因的样本与待检样本同批次进行PCR扩增反应，在获得相应的CT值后，利用双Λ Ct法，将标准品(HLA-B*15:02纯合型和杂合型样本)扩增体系II中与探针2、探针4相关的扩增曲线的CT值，与待检样本(根据扩增试验结果已确定为HLA-B*15:02等位基因型)扩增体系II中探针2、探针4相关的扩增曲线的CT值进行比较分析，从而判断出待检样本(根据扩增试验结果已确定为HLA-B*15:02等位基因型)HLA-B*15:02等位基因的纯合型或杂合型。也就是说，为了基于上述的扩增反应结果推断出待检样本HLA-B*15:02等位基因的纯合型或杂合型。[0031]本发明的另一个目的是提供一种用于上述HLA_B*15:02等位基因检测的试剂盒，该试剂盒包括:(I)分别装有反应液1、反应液2、反应液3、EZ Taq酶混合液、标准液1、标准液2的多个密封离心管，(2)分隔并集中包装这些离心管的试剂盒；其中:
[0032]反应液I由如下组分组成:由PCR反应缓冲液、2’ -脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物I和引物2，寡核苷酸探针为探针I ;用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4;
[0033]反应液2由如下组分组成:PCR反应缓冲液、2’ -脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物3和引物4，寡核苷酸探针为探针2 ;用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4 ；
[0034]反应液3由如下组分组成:PCR反应缓冲液、2’ -脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物5和引物6，寡核苷酸探针为探针3 ;用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4 ；
[0035]EZ Taq混合液:主要成份为热启动Taq酶；
[0036]标准液1:纯合型HLA-B*15:02基因组DNA ;
[0037]标准液2:杂合型HLA_B*15:02基因组DNA。
[0038]与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR方法不同，实时荧光定量聚合酶链反应方法可以在扩增反应进行的过程中随时监测扩增产物的产生，从而极大的提高了定量检测的准确性和精密度。实时荧光定量PCR (Taqman探针法)在PCR的扩增中，同时加入了引物和在5’末端和3’末端分别标记有荧光发生基团和荧光淬灭基团的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，探针序列保持完整，荧光发生基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故没有荧光信号的产生，而当探针与靶序列能够互补结合时，在PCR扩增进行的过程中，DNA聚合酶在引导DNA序列复制的同时其5’ -3’端外切酶活性将切断荧光探针，导致荧光发生基团与荧光淬灭基团的分离，从而荧光检测系统可以接收并记录荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光信号的产生，荧光信号的积累与PCR产物的形成完全同步，故可以实时地监测整个PCR反应过程，并可借助标准曲线或表达量恒定的内对照产物对未知的靶多核苷酸进行绝对或相对的定量分析。
[0039]如上所述，为了检测出临床血液样本中HLA(human leukocyte antigen)的基因型为HLA-B*15:02等位基因型，特别是能够准确区分HLA_B*15:13/15/31/55/88/89，HLA-B*95:12/21，HLA_B*15:139/144/170 等与 HLA_B*15:02 等位基因有着较高相似度 DNA序列的其他等位基因型，设计并制备实现这些目的的寡核苷酸引物和探针是一个非常重要的技术环节。为此，我们在使用适当的核酸分析软件(如DNA Star)对HLA-B*的核苷酸序列进行分析，进一步使用适当的引物设计软件(如Primer primer5.0)选择并设计具有特定核苷酸序列的寡核苷酸引物；选择并设计具有特定核苷酸序列的寡核苷酸探针。
[0040]如上所述，为了检测出临床血液样本中HLA(human leukocyte antigen)的基因型为HLA-B*15:02等位基因型，特别是能够准确区分HLA_B*15:13/15/31/55/88/89，HLA-B*95:12/21，HLA_B*15:139/144/170 等与 HLA_B*15:02 等位基因有着较高相似度 DNA序列的其他等位基因型，本发明将HLA-B*15:02等位基因型的DNA序列与其它与之有着高度同源性的等位基因型的DNA序列进行了同源性比较和分析，特别设计适用本发明检测试剂盒的寡核苷酸引物和探针。使用这些引物和探针完成的HLA-B*15:02等位基因实时定量检测，极大的简化了 HLA-B*15:02等位基因检测的操作步骤，缩短了检测时间，提高了检测灵敏度，降低了模板使用量。实验证明，本发明对HLA-B*15:02等位基因型检测的准确度在99.5%以上。
[0041]值得特别说明的是，我们使用了已知为HLA_B*15:02等位基因纯合型和杂合型的血样标准品，作为检测体系中的阳性对照。此外，标准品的存在，使完成HLA-B*15:02等位基因型检测的同时，进一步提高了待检样本HLA-B*15:02等位基因纯合型或杂合型判断的准确度。 [0042]本发明即将Taqman PCR技术应用于HLA_B*15:02等位基因的检测，使Taqman PCR的技术优点(灵敏度高、特异性强、着操作简便、耗时短、可定量)在HLA-B*15:02等位基因检测中得到完美继承的同时对HLA-B*15:02等位基因的纯合型和杂合型进行了鉴定。本发明涉及的试剂盒可广泛应用于人HLA-B*15:02等位基因的检测，指导临床上别嘌呤醇药物的使用，规避HLA-B*15:02基因型患者在使用卡马西平等精神类药物后可能引起的史蒂芬综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)。
【具体实施方式】
[0043]下面给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。
[0044]实施例1:
[0045]HLA_B*15:02等位基因检测试剂盒(SSP-PCR荧光探针法)及其使用。
[0046](I)制备包括下列组成成份的试剂盒:反应液I (650μ I/管)I管、反应液2(650 μ I/管)I管、反应液3 (650 μ I/管)I管、EZ Taq酶混合液(150 μ I/管)I管、标准液I (30 μ I/管)、标准液2 (30 μ I/管)。
[0047](2)样本采集、运送和保存:用一次性真空采血器，无菌操作，取待检个体血液样本，做好标示后将获取的血液样本置于低温冰箱(_70°C或-20°C)中冷冻保存。如集中检验，标本需在0°C以下环境中运送并于24小时内送达实验室。
[0048](3)检验步骤和结果分析:
[0049]将待检测血样取300 μ 1，用柱回收法提取血液样本中的DNA，用分光光度计或类似的仪器确认提取的DNA的质量(0D260/280在1.8-2.0之间)，将提取的每份待检样本DNA和标准品DNA分别置于3个PCR反应管或PCR板的3个孔中，每孔2 μ I。然后,在加入同一 DNA样本的3个孔中各加入一种PCR反应液(反应液1、反应液2、反应液3) 15 μ 1，再在每个孔中加入3 μ I的酶混合液。混匀离心后，将PCR反应体系置于自动荧光检测热循环仪上，选择FAM通道(Reporter:FAM, Quencher:none)收集特异扩增信号；选择HEX或VIC通道(Reporter:HEX/VIC, Quencher:none)检测内标；参比突光(Passive Reference)设置为none ;设置Sample Volume为20。按照仪器操作说明做好相应设置后开始试验。本试剂盒的所使用的反应条件是:96°C预变性3分钟，95°C 30秒一65°C 45秒，共进行35个循环；最后25°C下至少30秒。
[0050]反应结束后保存检测数据文件，点选仪器的数据分析选项后可查看各个PCR反应体系的结果，如PCR扩增曲线，待检样本和标准样本的CT值等，具体PCR扩增反应条件、标准品和样品的检测结果见表1~表3。
[0051]表1 PCR扩增反应条件
【权利要求】
1.一种HLA-B*15:02等位基因检测方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)提供包括待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物； (2)通过扩增反应循环扩增待测样品中的靶多核苷酸； (3)使所述荧光检测体系中的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合； (4)测定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶多核苷酸的存在及其相对量； 所述核酸扩增体系由如下组分组成:耐热DNA聚合酶、2’ -脱氧核苷三磷酸、能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物a和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物a，能够与靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物b和能够与靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物b ;所述荧光检测体系是能够与靶多核苷酸结合并且两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的两条寡核苷酸探针。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增体系和荧光检测体系共3组,其中: 核酸扩增体系I中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物I和引物2，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系I中所使用的寡核苷酸探针为探针I和探针4 ;核酸扩增体系II中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物3和引物4，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引 物7和引物8，并且荧光检测体系II中所使用的寡核苷酸探针为探针2和探针4 ;核酸扩增体系III中用于靶多核苷酸扩增的正向引物a和反向引物a分别为引物5和引物6，用于靶多核苷酸扩增的正向引物b和反向引物b分别为引物7和引物8，并且荧光检测体系III中所使用的寡核苷酸探针为探针3和探针4 ;各引物和探针具体组成如下: 引物1-6来源于人HLA-B位点的基因序列，引物I位于102-123位，含21个碱基，引物2位于202-221位，含19个碱基，扩增片段长度为120bp ;引物3位于1244-1262位，含18个碱基，引物4位于1371-1386位，含17个碱基，扩增片段长度为143bp ;引物5位于2924-2943位，含19个碱基，引物6位于3065-3083位，含18个碱基，扩增片段长度为160bp ;引物7、8来自源人β -globin基因组序列的HBB基因(62137-63742)，引物7位于62627-62647位，含19个碱基，引物8位于62756-62775位，含18个碱基，扩增片段长度为149bp。探针1_3分别来源于HLA-B位点基因序列的122-146位、1256-1276位和3038-3061位；探针4来源于人β -globin基因序列反向序列的62731-62755位。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增反应循环是重复35-45次的聚合酶链反应循环。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，先确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环数；然后将上述测定的阈循环数与标准溶液中的靶多核苷酸的阈循环数相比较，以确定样品中靶多核苷酸的相对量，从而判断样品包含靶多核苷酸基因的纯合型与杂合型。
5.一种用于HLA-B*15:02等位基因检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括: (O分别装有反应液1、反应液2、反应液3、EZ Taq混合液、标准液1、标准液2的多个密封离心管，(2)分隔并集中包装这些离心管的试剂盒；其中: 反应液I由如下组分组成:由PCR反应缓冲液、2’ -脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物I和引物2，寡核苷酸探针为探针I ;用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4 ； 反应液2由如下组分组成:PCR反应缓冲液、2’ -脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物3和引物4，寡核苷酸探针为探针2 ;用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4 ； 反应液3由如下组分组成:PCR反应缓冲液、2’ -脱氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的引物5和引物6，寡核苷酸探针为探针3 ;用于靶多核苷酸扩增的引物7和引物8，寡核苷酸探针为探针4 ； EZ Taq混合液:主要成份为热启动Taq酶； 标准液1:纯合型HLA-B*15:02基因组DNA ； 标准液2:杂合型HLA-B*15:02基因组DNA ； 各引物和探针具体组成如下: 引物1-6来源于人HLA-B位点的基因序列，引物I位于102-123位，含21个碱基，引物2位于202-221位，含19个碱基，扩增片段长度为120bp ;引物3位于1244-1262位，含18个碱基，引物4位于1371-1386位，含17个碱基，扩增片段长度为143bp ;引物5位于2924-2943位，含19个碱基，引物6位于3065-3083位，含18个碱基，扩增片段长度为160bp ;引物7、8来自源人β -globin基因组序列的HBB基因(62137-63742)，引物7位于62627-62647位，含19个碱基，引物8位于62756-62775位，含18个碱基，扩增片段长度为149bp。探针1_3分别来源于HLA-B位点基因序列的122-146位、1256-1276位和3038-3061位；探针4来源于人β -globin基因序列反向 序列的62731-62755位。
【文档编号】C12Q1/68GK103820543SQ201410040161
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】刘志文, 肖伟明, 阙秋华, 孙祖勇 申请人:希斯奇生物医药（上海）有限公司