一种基因工程菌及其在生产辅酶q10中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基因工程菌及其在生产辅酶Q10中的应 用。
【背景技术】
[0002] 辅酶Q是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，不同来源的辅酶Q其侧链异 戊烯单位的数目不同，人类和哺乳动物是10个异戊烯单位，故称辅酶Q10,其结构式如式 (I)所示：
[0003]
[0004] 辅酶Q10是生物细胞呼吸链中的重要递氢体，是一种良好的生化药物，近年来已 广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗。此外，在治疗 坏血病、十二指肠溃疡、坏死性牙周炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果。最 近，研究者发现CoQlO具有抗衰老作用，从而将其应用扩展到化妆品和保健品领域，使其在 国内外的需求进一步扩大。
[0005] 辅酶Q10的制备方法主要有三种，即动植物组织提取法、化学合成法和微生物发 酵法。动植物组织提取法中动植物辅酶Q10含量低，而且各种化学成份复杂，并受原料和来 源限制，因此产品成本高，价格昂贵，规模化生产受到了一定限制。化学合成法技术上比较 成熟，主要是以来源较丰富的茄尼醇为原料合成的，但其产物为顺反异构体的混合物，生物 活性低，合成生物活性高的CoQlO尚未达到工业化生产的程度。微生物发酵法合成的辅酶 Q10成本低、无光学异构体，生物学活性高，大规模生产应用效果好。
[0006] 常用的微生物包括红螺菌，土壤杆菌，类球红细菌，根瘤菌等。其中类球红细菌培 养简单，是辅酶Q10高效的生产菌之一。在细菌中，辅酶Q由两部分组成：醌环部分和异戊 二烯侧链部分。醌环骨架由分支酸途径合成，前体是对羟基苯甲酸。侧链由异戊二烯途径 合成，侧链的长短决定了辅酶Q的种类的不同。在类球红细菌中，异戊二烯焦磷酸异构体二 甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP)与9分子异戊二烯焦磷酸（IPP)依次在物牛儿基物牛儿基焦磷 酸合成酶及聚十异戊二烯胶磷酸合酶的催化下生成聚十异戊二烯胶磷酸（DPP)。聚十异戊 二烯胶磷酸和对羟基苯甲酸缩合形成辅酶Q10的前体物，该前体物的苯环经修饰之后形成 目标产物辅酶Q10。
[0007] 利用代谢工程手段对辅酶Q10的生物合成途径进行遗传修饰和改造，可以提高微 生物的辅酶Q10产率。辅酶Q10的生物合成途径中存在较多的限速步骤，增强催化限速反 应的酶的表达量或活性是提高辅酶Q10产率的一种方法。
[0008] 但现有通过代谢工程改造手段获得的基因工程菌，其合成辅酶Q10的能力还有待 提1?。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种基因工程菌，该基因工程菌利用UbiE，UbiF，UbiG基因串联过 表达来强化辅酶Q10产生菌的辅酶Q10合成能力。
[0010] 一种基因工程菌，包括辅酶Q10产生菌及转入所述辅酶Q10产生菌的目的基因， 所述目的基因为去甲基萘醌甲基转移酶基因（UbiE)、2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧 基一1，4-对苯二酚羟化酶基因（UbiF)和3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶基因（UbiG)。
[0011] 辅酶Q10的苯环修饰反应是辅酶Q10合成的限速步骤之一。其中，去甲基萘醌甲 基转移酶（Demethylmenaquinone methyltransferase，UbiE)催化生成 C1 位上的甲基（甲 基化反应），2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基一1，4-对苯二酉分轻化酶（2-〇(^&口代1^1-3-methyl-6-methoxy-l，4_benzoquinol hydroxylase，UbiF)催化生成 C3 位上的羟基（羟基 化反应），3_ 去甲基泛醌 _93_ 甲基转移酶（3-demethylubiquinone-93_methyltransferas e，UbiG)进一步将C3位上的羟基转变为甲氧基（甲基化反应）。本发明创造性地将UbiE， UbiF，UbiG基因构建于辅酶Q10产生菌中，利用UbiE，UbiF，UbiG基因串联过表达来强化辅 酶Q10产生菌的辅酶Q10合成能力。
[0012] 作为优选，所述去甲基萘醌甲基转移酶基因、3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶基因 和2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基一1，4-对苯二酚羟化酶基因依次连接在表达载体的 同一启动子下游。
[0013] 作为优选，所述表达载体为泛宿主性质粒。泛宿主性质粒能在多种不同种属的细 胞中生存，因此可选用多种受体菌来构建本发明的基因工程菌。
[0014] 所述泛宿主性质粒可选用pBBRlMCS-2。
[0015] 由于所述表达载体为泛宿主性质粒，因此本发明基因工程菌的宿主菌可选种类多 样。作为优选，所述辅酶Q10产生菌为类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides)。在辅酶 Q10的常用产生菌中，类球红细菌不仅培养简单，而且合成辅酶Q10的效率较高。
[0016] 作为优选，所述目的基因来源于类球红细菌。目的基因与受体菌同源，可进一步提 高所述目的基因的转录效率。
[0017] 本发明中，所述去甲基萘醌甲基转移酶基因（UbiE)的碱基序列如SEQ ID No. 1所 示，所述2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基一1，4-对苯二酚羟化酶基因（UbiF)的碱基序 列如SEQ ID No. 2所示，所述3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶基因（UbiG)的碱基序列如 SEQ ID No. 3 所示。
[0018] 本发明还提供了所述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
[0019] (1)从供体菌中提取总DNA ;
[0020] (2)以所述总DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，分别获得所述去甲基萘醌甲基 转移酶基因、2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基一1，4-对苯二酚羟化酶基因和3-去甲基 泛醌-93-甲基转移酶基因；
[0021] (3)将所述去甲基萘醌甲基转移酶基因、3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶基因 和2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基一1，4-对苯二酚羟化酶基因依次连接于质粒 pBBRlMCS-2的启动子下游，获得表达载体；
[0022] (4)将所述表达载体转化大肠杆菌，将已转化的大肠杆菌与宿主菌进行接合转移， 获得转化子；
[0023] (5)从所述转化子中筛选出所述基因工程菌。
[0024] 其中，扩增去甲基萘醌甲基转移酶基因（UbiE)所采用的引物为：
[0025] 上游引物：5 ' -TCTAGAGCATCAACGGAGGTTCAGGGTGGTGAATGAGCGACGAAACTTCCAAC-3 '（ 下划线处为Xbal酶切位点）（SEQ ID No. 4);
[0026] 下游引物：5 ' -CCCAAGCTTCGAGCTCCGGCCGCTACTAGTTGCGAACCAGCCGCCAGA-3 '（下划 线处为Hindlll酶切位点）（SEQ ID No. 5);
[0027] 扩增3-去甲基泛醌-93-甲基转移酶基因（UbiG)所采用的引物为：
[0028] 上游引物：5 ' -CCAAGCTTCATCAACGGAGGAGGAGTTTGCAATGGAATCGT-3 '（下划线处为 Hindlll 酶切位点）（SEQ ID No. 6);
[0029] 下游引物：5' -GGACTAGTTCAGCTGCGCCGCACGCTCGCGGTAACGT-3' (下划线处为 Spel 酶切位点）（SEQ ID No. 7);
[0030] 扩增2-八异戊二烯-3-甲基-6-甲氧基一1，4-对苯二酚羟化酶基因（UbiF)所 采用的引物为：
[0031] 上游引物：5 ' -CAAGCTTTCTAGAGCATCAACGGAGGTTCAGGGTGGTGAATGACAAATCAACCAACG GA-3'（下划线处为Hindlll酶切位点）（SEQ ID No. 8);
[0032] 下游引物：5 ' -CGAGCTCCGGCCGCTACTAGTAGGCTACAACCCTAACGCAT-3 '（下划线处为 SacI 酶切位点）（SEQ ID No. 9)。
[0033] 本发明还提供了所述基因工程菌在生产辅酶Q10中的应用。
[0034] 所述应用包括：
[0035] (1)将所述基因工程菌经活化后接种于种子培养液中，进行一级种子培养，获得一 级种子液；
[0036] 作为优选，所述种子培养液的配方为（100ml) :(NH4)2S04 0 . 25g，玉米浆0.05g，酵 母提取物 〇· 14g，NaCl 0· 2g，葡萄糖 0· 3g，Κ2ΗΡ040· 05g，ΚΗ2Ρ04 0· 05g，MgS04 0· lg，FeS04 0· 01g，CoCl2 0· 003g，MnS04 0· 0001g，CaC03 0· 8g，维生素 B1 0· 1 μ g，维生素 K 0· 1 μ g，维 生素 A 0. 15μ g ;pH调节为7. 2 ;
[0037] 作为优选，所述一级种子培养的条件为：在30°C、200r/min下培养23h ;适当的培 养条件使一级种子培养结束时，一级种子液中的较多菌体处于对数生长期。
[0038] (2)将所述一级种子液接种于种子培养液中，进行二级种子培养，获得二级种子 液；
[0039] 所述一级种子液的接种量优选为1%。通过二级培养可以使二级种子液中菌体状 态更为均匀，基本处于对数生长期，便于后续发酵培养的进行。二级种子培养的条件与一级 种子培养的条件相同。
[0040] (3)将所述二级种子液接种于发酵培养液中，进行发酵培养；
[0041] 所述二级种子液的接种量优选为为1%。
[0042] 作为优选，所述发酵培养液的配方为（100ml) :(NH4)2S04 0 . 3g，NaCl 0.28g，葡萄 糖 4g，ΚΗ2Ρ04 0· 15g，味精 0· 3g，MgS04 0· 63g，玉米浆 0· 4g，FeS04 0· 12g，CoCl2 0· 005g， CaC03 0· 6g，维生素 B1 0· 1 μ g，维生素 K 0· 1 μ g，维生素 A 0· 15 μ g ;pH 调节为 7. 2 ;
[0043] 作为优选，所述发酵培养的条件为：在30°C、200r/min下培养120h。
[0044] 作为进一步优选，所述发酵培养的条件为：在30°C、200r/min下培养120h。
[0045] (4)收集菌液，从菌液中分离纯化获得辅酶Q10。
[0046] 与未转化有目的基因的类球红细菌相比，利用本发明的基因工程菌生产辅酶Q10， 辅酶Q10的产量提高了 20%以上。<