一种重组谷氨酸棒杆菌与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及重组微生物，具体地说，涉及一种可将发酵糖直接转化为乙二醇的重组谷氨酸棒杆菌与应用。
【背景技术】
[0002]乙二醇是一种重要的化工原料，可作为溶剂、防冻剂以及合成聚酯的原料等，其最主要的用途是作为合成的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的单体。PET是合成树脂、纤维、塑料瓶的重要原料，每年的市场需求量超过2000万吨。
[0003]目前，乙二醇的生产方法主要是通过以石油资源为基础的化学法生产，特别是以乙烯为原料合成环氧乙烷，再水合制成乙二醇。由于石油资源的不断枯竭，开发可利用可再生原料特别是价格低廉的生物质原料如木质纤维素为原料一步法生产乙二醇的生物法技术路线具有重要的意义。
[0004]目前文献报到的生物基乙二醇的技术路线主要是通过发酵法和化学法相结合的方式实现的。首先以可发酵糖为底物利用微生物如酿酒酵母发酵生产生物乙醇。进一步将生物乙醇通过化学法脱水获得乙烯。乙烯再通过化学法生产乙二醇。这一技术路线步骤冗长，副产物多，经济效益差。
[0005]自然界不存在天然的微生物可以直接发酵葡萄糖生产乙二醇。目前，仅有的文献报道通过改造大肠杆菌实现利用木糖生产乙二醇的方法(4口口11;[01'013；[0113;[(^60111101(2013)97: 3409-3417)。其代谢途径包括:木糖在木糖脱氢酶的作用下生成木糖酸，木糖在木糖酸脱水酶的作用下生成2-酮-3-脱氧-木糖酸。后者在2-酮-3-脱氧-木糖酸醛缩酶的催化下裂解生成乙醇醛和丙酮酸。乙醇醛可以在醇脱氢酶的作用下生产乙二醇。然而这一代谢途径，乙二醇对木糖的最高理论转化率仅为0.41g/g，极大限制了其经济可行性。同时，利用这一代谢途径无法将葡萄糖等重要可发酵糖转变为乙二醇。
【发明内容】
[0006]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种可将发酵糖直接转化为乙二醇的重组谷氨酸棒杆菌与应用。
[0007]为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下:
[0008]本发明首先提供一种重组谷氨酸棒杆菌，其是以谷氨酸棒杆菌作为出发菌，引入以下外源基因构建得到的重组菌:
[0009]1)催化丝氨酸转化为羟基丙酮酸的基因；
[0010]2)催化羟基丙酮酸转化为乙醇醛的基因；
[0011]3)催化乙醇醛转化为乙二醇的基因。
[0012]上述基因的引入，能够使得重组谷氨酸棒杆菌通过表达外源基因具备相应的催化性能，从而独立的完成图1所示的乙二醇代谢途径。
[0013]进一步优选，所述重组谷氨酸棒杆菌还上调了谷氨酸棒杆菌丝氨酸合成的基因。使得重组谷氨酸棒杆菌通过过表达所述基因，高效地合成丝氨酸，提高丝氨酸的产量，从而为丝氨酸-乙二醇的代谢途径提供更多的原料，提高乙二醇的产量。
[0014]进一步优选，所述重组谷氨酸棒杆菌还敲除了使谷氨酸棒杆菌丝氨酸降解的基因。目的在于敲除能够使丝氨酸降解的基因，保证微生物内丝氨酸的含量，从而为丝氨酸-乙二醇的代谢途径提供更多的原料，提高乙二醇的产量。
[0015]作为优选，所述催化丝氨酸转化为羟基丙酮酸的基因为氨基酸脱氢酶基因或者氨基酸转氨酶基因。更为优选，所述催化丝氨酸转化为羟基丙酮酸的基因为氨基酸转氨酶基因。
[0016]例如，所述氨基酸脱氢酶基因包括来自Streptomyces cinnamonensis的缴氨酸脱氢酶基因vdh(序列如SEQ ID N0.1O所不)、来自Thermoactinomycesintermedius的苯丙氨酸脱氢酶基因pdh(序列如SEQ ID N0.11所示)，来自Geobacillusstearothermophilus的亮氨酸脱氢酶基因ldh(序列如SEQ ID N0.12所示)。
[00Π]例如，所述氨基酸转氨酶基因包括来自Arabidopsis thaliana的丙氨酸转氨酶基因agt(序列如SEQ ID N0.7所示)、来自Thermotogamaritima的丙氨酸转氨酶基因agt(序列如SEQ ID Νο.8所示)、来自Rattusnorvegicus的丙氨酸转氨酶基因agt(序列如SEQ IDN0.9所示)。
[0018]作为优选，所述催化羟基丙酮酸转化为乙醇醛的基因为2-酮酸脱羧酶基因。
例如，所述2-酮酸脱羧酶基因包括来自Saccharomyces cerevisiae的丙酮酸脱羧酶基因pdc(序列如SEQ ID N0.2所示)、来自Triticum aestivum的丙酮酸脱羧酶基因pdc(序列如SEQ ID N0.3所示)、来自LactococcusIactis的2-酮异戊二酸脱羧酶基因kivD(序列如SEQ ID Νο.4所示)、来自Pseudomonasputida的苯甲酰脱羧酶基因mdlC(序列如SEQ IDN0.5所不)、来自My cobacterium tuberculosis的2_酮戊二酸脱竣酶基因sucA(序列如SEQID N0.6所示)。
[0020]作为优选，所述催化乙醇醛转化为乙二醇的基因为醇脱氢酶基因。
[0021]更为优选，所述醇脱氢酶可为来自大肠杆菌MG1655的yqhD基因片段(序列如SEQID N0.1所示)。
[0022]可催化乙醇醛转化为乙二醇的还有来自大肠杆菌的乳醛脱氢酶基因fucO基因，但经实验证实，来自大肠杆菌MG1655的yqhD基因片段较优。
[0023]进一步地，所述上调谷氨酸棒杆菌丝氨酸合成的外源基因选自serA(磷酸甘油酸脱氢酶)，serC(磷酸丝氨酸转氨酶)和serB(磷酸丝氨酸磷酸化酶)酶基因中的一种或多种；作为优选，所述上调谷氨酸棒杆菌丝氨酸合成的基因为以上三种。
[0024]进一步地，所述使谷氨酸棒杆菌丝氨酸降解的基因选自SdaA(丝氨酸脱氨酶)和pabABC(4_氨基苯甲酸合成酶)中的一种或两种;作为优选，所述使谷氨酸棒杆菌丝氨酸降解的基因为以上两种。
[0025]敲除时，优先敲除sdaA和pabABC基因。
[0026]本发明还进一步提供了前述重组谷氨酸棒杆菌在生产乙二醇方面的应用。
[0027]具体的说，所述应用为前述重组谷氨酸棒杆菌利用发酵糖直接生产乙二醇。
[0028]作为优选，所述发酵糖为葡萄糖。
[0029]作为优选，通过优化培养基及发酵条件可以进一步提高乙二醇的产量或者转化率。
[0030]例如，培养基为(单位为g/L)
[0031 ]葡萄糖20-100，(NH4)2S04 1 0-40，尿素 1-5，MgS04.7Η20 0.Η，ΚΗ2Ρ04 1-5,Κ2ΗΡ04
1-5，3-吗啉丙磺酸 0-50，CaCl20-0.5，FeS04.7Η200_0.5，MnS〇4.H20 0-0.5,ZnS04.7H200-0.5，CuS040-0.5，NiCl2.6H2OO-0.5，生物素0.1-1,原儿茶酸0-1，卡那霉素0-0.5。
[0032]更为优选，在培养基中额外添加10_40g/L玉米浆。
[0033]作为优选，培养温度为30_32°C，通气量为l_2vvm，通过调整转速使得溶氧水平达到10%以上。能够进一步提高乙二醇的产量或者转化率。
[0034]本发明的有益效果在于:
[0035]本发明通过在谷氨酸棒杆菌的基础上引入外源基因，并上调了丝氨酸合成基因，敲除了丝氨酸降解基因，得到重组谷氨酸棒杆菌。使其在具有丝氨酸高含量的基础上，通过表达外源基因，独立的完成丝氨酸-乙二醇的代谢途径。即，所述重组谷氨酸棒杆菌能够以发酵糖为碳源，直接生产乙二醇，而不需要借助其他外源酶，弥补了现有技术中的不足，为建立生物法乙二醇的工业化生产奠定基础。经本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌发酵生产的乙二醇，实际转化率达10 %以上。
【附图说明】
[0036]图1为乙二醇代谢途径。
【具体实施方式】
[0037]下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0038]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040]实施例1在谷氨酸棒杆菌中过表达醇脱氢酶基因yqhD
[0041]以大肠杆菌MG 1 6 5 5的基因组为模板，以引物y q h D - F(atGAATTCTTGACATTAATTTGAATCTGTGTTATAATGGTTCAAGGAGATATACCatgAACAACTTTAATCTGCACACC)和 y qhD-R (atGAATTCGCGGGCGGCTTCGTATATAC)为引物进行 PCR，获得 yqhD 基因片段(yqhD序列如SEQ ID N0.1所示)并进行PCR产物纯化(天根生物PCR产物纯化试剂盒)。将大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pEC_K18mob2(Journal of B1technology 104(2003)287-299)用EcoRI进行单酶切，利用GibsonAssembly试剂盒(NEB)将yqhD基因片段一步连接到pEC-K18mob2上，获得的重组质粒命名为pEC-yqhD.该质粒利用lac为启动子，无需添加外源的诱导剂即可过表达yqhD基因。
[0042]利用电穿孔仪(伯乐)将pE C