一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株聚赖氨酸发酵菌株及该菌株的构建 方法与应用。
【背景技术】
[0002] ε-PL是日本的S. Shima和H. Sakai两位博士 1977年在大量筛选生物碱物质时首次 发现的一种新型聚氨基，ε-PL是由L-赖氨酸的α_羧基和ε_氨基之间形成的酰胺键聚合而成 的聚阳离子，作为天然型的聚氨基酸，ε-PL具有优良的生物相容性和生物降解性，其分子侧 链含有大量的亲水性游离氨基，便于对其进行功能化改造，因而ε-PL在保健食品、基因载 体、药物缓释、生物医学材料等领域具有广阔的开发和应用前景。生物法合成聚赖氨酸以可 再生资源为原料，具有反应条件温和、污染少以及成本低廉等优点，因此，生物合成法是目 前ε -PL工业化生产比较经济有效的方法。
[0003] ε-PL属于次级代谢产物，在聚赖氨酸的代谢过程中，发酵周期一般需要6-8天，发 酵产物ε-PL是一种含氮量较高的化合物，聚合物单体上含有两个氨基，其合成与菌体细胞 内的氮素代谢有密切联系，发酵液中的氮素被细胞摄取分解为氨、铵离子(νη 4+)或谷氨酸作 为合成产物的重要原料，我们猜想提高氮素的供给有可能提高细胞内氮源的供给，从而提 尚ε-PL合成。
[0004] 随着分子生物学的发展，利用分子克隆和外源表达及基因过量表达技术可以大幅 度地提高目的酶在宿主微生物中的表达量。铵转运蛋白是一类存在于细胞膜上主动转运 νη4+的载体，普遍存在于真核生物或原核生物细胞膜上，可将细胞所处环境中的铵离子转运 到细胞内，确保微生物氮代谢的正常运行。铵离子转运蛋白的研究主要集中在大肠杆菌、酵 母中，但在放线菌中的相关报道却很少。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是，提供一株小白链霉菌聚赖氨酸发酵基因工程菌株。
[0006] 本发明还要解决的技术问题是，提供上述小白链霉菌聚赖氨酸发酵基因工程菌株 的构建方法。
[0007] 本发明最后要解决的技术问题是，提供上述小白链霉菌聚赖氨酸发酵基因工程菌 株在产聚赖氨酸中的应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0009] -株小白链霉菌基因工程菌，其特征在于，它是将铵转运蛋白基因在 Streptomyces albulus Η)-1中过量表达铵转运蛋白基因，所述的铵转运蛋白基因的核苷 酸序列如SEQ ID No:l所示。
[0010] 所述的Streptomyces albulus PD-1 为CCTCC N0:M2011043,其分类命名为其分类 命名为链霉菌（Streptomyces albulus)，菌株号PD-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心 (简称CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO:M2011043，保藏日期：2011年2月21日，地址:武汉大学， 邮编430072。该菌株的详细信息已经在申请号为201110049986.8的中国专利中公开。
[0011] 上述小白链霉菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0012] (1)以S.albulus PD-1 的基因组DNA作为模板，以SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示 核苷酸序列为引物，PCR扩增得到铵转运蛋白amtB的核苷酸序列，将该核苷酸序列与pIB139 质粒连接，得到重组质粒p IB 139-amtB;
[0013] (2)接合转移法将所述的表达载体整合入白色链霉菌S.albulus PD-1染色体，获 得所述的工程菌；
[00M] ⑶抗性培养基筛选阳性克隆：挑取10个单克隆于5mL含有50yg/mL硫酸安普霉素 的M3G液体培养基中，30°C、200rpm培养3天后提基因组，用硫酸安普霉素引物进行PCR，根据 电泳结果判断:含有与apr基因相同大小DNA片段的菌落为阳性克隆，对阳性克隆子进行复 壮培养，得小白链霉菌基因工程菌S. albulus PD-4。
[0015] 上述小白链霉菌基因工程菌在制备聚赖氨酸中的应用。
[0016] 其中，发酵过程中，培养基中C/N比为2~23:1，培养基中的碳源为葡糖糖等，氮源 为硫酸铵等。
[0017] 其中，发酵温度为28~32°C。
[0018] 其中，发酵时间为6~8天。
[0019] 有益效果:本发明选择一株小白链霉菌S.albulus Η)-1作为分子生物学操作的出 发菌株。通过PCR技术从S.albulus PD-1菌株的基因组上扩增得到了铵转运蛋白基因 （amtB 基因），成功构建了能够高效过量表达铵转运蛋白基因的工程菌。该重组菌可以在较低浓度 的氮素浓度下仍能高效利用氮素合成更多的ε-PL，减少氮源浓度过高导致的胞内酶系受 阻，相关酶活性受限，发酵过程中维持lg/L的NH4+至发酵终点，S. albulus PD-4经补料发酵 产量可达35.7g/L，较对照组S.albulus Η)-1明显提高，菌体干重最终达到32.3g/L，较对照 组也有好大的提高，从发酵角度进一步证实铵离子转运蛋白的引入可以更好的提高发酵液 氮素的利用，使S.albulus PD-4在较低浓度的铵态氮浓度下仍能很好的合成ε-PL，有效解 决了发酵过程中因氮素供给上引起的的问题，有良好的工业应用前景。
【附图说明】
[0020] 图1为E.coli ET12567(pIB139-amtB)的双切图谱及重组菌PCR验证。
[0021 ] 图2为amtB基因的导入对S.albulus Η)-4中ε-PL产量的影响。
[0022]图3为5L发酵罐中S.albulus ro-l(3-A)、S.albulus PD-4(3-B)补料分批发酵比 较。
【具体实施方式】
[0023]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0024] 出发菌株小白链霉菌S.albulus PD_1(CCTCC M2011043)已经在申请号为 201110049986.8的中国专利中公开。
[0025]实施例1:铵转运蛋白基因（amtB基因）的克隆和基因工程菌的构建。
[0026] 1.1 PCR扩增铵转运蛋白基因（amtB基因）。
[0027] 用Genomic DNA Purification Kit(Takara，大连）提取处于对数生长期的 S. albulus Η)-1的基因组DNA，并用2% (20g/L)的琼脂糖凝胶电泳对所获得的基因组DNA进 行检测。
[0028] 运用Vector NTI软件设计下列两条引物：
[0029] 引物1:5' -CCATATGGCATATGGTGAACCTCTCAGGTTCCGATGA-37
[0030] (下划线处为Nde頂每切位点）
[0031 ]引物2:5' -CTCTAGAGAGATCTCTACTTCTGCCGCTTGTAGAAGG-37 [0032](下划线处为Xba頂每切位点）
[0033]以获得的S.albulus Η)-1的基因组DNA为模板，扩增目的基因片段。
[0034] PCR体系：基因组DNA 2yL，引物1和引物2各lyL，dNTP 2yL，10XexTaq缓冲液(含 Mg2+)2.5yL，exTaq酶0.5yL，DMS0 2yL，ddH20 HyL;
[0035] PCR反应程序：95°C预变性5min ; 95°C变性45s，然后58°C退火45s，72°C延伸 1.5min，循环35次，最后72°C延伸lOmin;
[0036] 2 %琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，得出结论:与预期分子量(1188bp)大小相符。因 为无杂带，所以用DNA纯化试剂盒回收。
[0037] 1.2限制性酶切反应，纯化及连接反应。
[0038] 对实施例1.1获得的PCR产物用对应的酶进行双酶切反应。本实验中，所用的限制 性内切酶是Nde I和Xba I。酶切体系为：PCR产物 12.5yL，Nde I 0.5yL，Xba I 0.5yL，10X 缓冲液2.5yL，ddH20 9yL，总体积25yL。将DNA纯化试剂盒纯化酶切后的PCR产物。
[0039]同样的用限制性内切酶是Nde I和Xba I对pIB139质粒进行酶切，线性化后的质粒 只需要经过DNA纯化试剂盒纯化即可