Nk细胞的体外三维扩增培养方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物工程和生物医药领域，特别涉及一种NK细胞的体外三维扩增培养 方法。
【背景技术】
[0002] 自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK细胞），作为与T细胞、B细胞并列的一大 类淋巴细胞群体，是天然免疫系统的重要成员。NK细胞除了参与先天性免疫应答之外，还在 适应性免疫的免疫调节中起着重要的调控作用。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包 括部分细胞系）、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞）、寄生虫等，因此，NK细胞是 机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第Π 型超敏反应和移植物抗宿主反应。综上， NK细胞的离体扩增和激活时促进临床频繁应用的关键，而目前NK细胞的扩增方法主要包括 在二维培养前分离NK前体或CD56以及使用饲养细胞等步骤，不仅需要饲养细胞、操作较繁 琐，而且NK细胞的扩增效果不明显，且所获得的NK细胞杀伤活性较差。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术于二维环境中扩增NK细胞存在NK细 胞扩增率低且杀伤活性差等缺陷，提供一种能够提高NK细胞扩增率及杀伤活性的NK细胞的 体外三维扩增培养方法。
[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种NK细胞的体外三维扩增培 养方法，所述培养方法包括以下步骤：
[0005] 获取NK细胞；
[0006] 将所述NK细胞接种于三维培养支架中进行体外三维扩增培养；其中，三维培养支 架为壳聚糖-海藻酸钠支架。
[0007] 在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述壳聚糖-海藻酸钠支架 的制备过程，包括以下步骤：
[0008] 取海藻酸钠溶于蒸馏水中，壳聚糖溶于醋酸溶液中，加热溶胀；用冰醋酸分别调节 壳聚糖和海藻酸钠溶液的pH至3.0~5.0后，混合均匀，真空脱泡后于-5°C-198°C下冷冻并 冻干。
[0009] 在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述壳聚糖-海藻酸钠支架 的制备过程，还包括在壳聚糖和海藻酸钠溶液混合后，添加除镁离子以外的二价金属离子 盐溶液的步骤。
[0010] 在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，获取NK细胞的过程，包括以 下步骤：
[0011] 获取⑶34+造血干细胞于含有造血干细胞生长因子的干细胞培养基中进行刺激分 化成NK细胞。
[0012] 在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述造血干细胞生长因子包 括白介素-2、白介素-12、白介素-15以及白介素-18。
[0013]在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述干细胞培养基中，白介 素2的浓度为100_300U/ml、IL-12的浓度为0.5-4.5ng/ml、白介素-15的浓度为2-8ng/ml以 及白介素-18的浓度为5-15ng/ml。
[0014]在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述造血干细胞生长因子包 括白介素-2,且所述造血干细胞生长因子中还添加有抗⑶3单克隆抗体。
[0015] 在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述干细胞培养基中，白介 素-2的浓度为5-15ng/ml、抗CD3单克隆抗体的浓度为5-15ng/ml。
[0016] 在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，对所述NK细胞进行体外扩增 培养的步骤为:将所述壳聚糖-海藻酸钠研碎加入乙酸中复溶，并添加所述含有造血干细胞 生长因子的干细胞培养基，接种所述NK细胞进行培养20-50天。
[0017] 在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述⑶34+造血干细胞的获 取过程，包括以下步骤：
[0018] 从血细胞中分离出单个核细胞，经磁珠分选出⑶34+造血干细胞。
[0019]实施本发明提供的NK细胞体外扩增培养方法，可以达到以下有益效果:本发明通 过采用壳聚糖-海藻酸钠支架对NK细胞进行扩增培养，利用壳聚糖-海藻酸钠支架的多孔隙 结构及其机械性能和生物相容性，扩大了NK细胞的生长空间及与营养物质的接触面积，也 可使得NK细胞能够均匀分布在壳聚糖-海藻酸钠支架中，避免细胞聚集成团，促进NK细胞与 营养物质的接触，从而能够提高NK细胞的细胞活性，有利于提高NK细胞的扩增率及其杀伤 活性;从而解决了现有技术中采用饲养细胞于二维环境中培养NK细胞存在的NK细胞活性 差、扩增率低等缺陷模拟NK细胞生长的微环境。
【具体实施方式】
[0020] 为解决现有技术中NK细胞于二维环境中进行扩增培养的方式存在扩增率低、NK细 胞杀伤活性差等缺陷，本发明的创新点在于提供一种NK细胞的三维扩增培养方式，通过利 用壳聚糖-海藻酸钠支架的多孔隙结构及其机械性能和生物相容性，扩大了 NK细胞的生长 空间及与营养物质的接触面积，也可使得NK细胞能够均匀分布在壳聚糖-海藻酸钠支架中， 从而能够提高NK细胞的细胞活性，有利于提高NK细胞的扩增率及其杀伤活性;从而解决了 现有技术中采用饲养细胞于二维环境中培养NK细胞存在的NK细胞活性差、扩增率低等缺 陷。
[0021] 具体地，本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法，包括以下步骤：
[0022] S1、获取NK细胞；
[0023] S2、将NK细胞接种于三维培养支架中进行体外三维扩增培养;其中，三维培养支架 为壳聚糖-海藻酸钠支架。
[0024]进一步地，在步骤S1中，NK细胞可来自于外周血、脐带血、蜕膜组织和/或淋巴结。 NK细胞表面表达CD56抗原，不表达CD3抗原，根据CD56抗原的不同表达，NK细胞可分为 CD56dimCD16brighmCD56bl:ightCD16 dim/neg两大亚群；CD56brightCD16dim/neg NK细胞则主要存在于 淋巴结以及蜕膜组织中，以分泌细胞因子如干扰素-γ为主要功能，杀伤功能较弱；而 CD56dimCD16bnghtNK细胞则主要存在于外周血中，有丰富的胞内穿孔素，杀伤功能较强，因 此，在本发明中，优先采用从外周血中获取NK细胞。
[0025] NK细胞主要是由⑶34+造血干细胞在造血干细胞生长因子的刺激下分化发育为成 熟的NK细胞，NK细胞的发育阶段为:从CD34+造血干细胞先分化为共同淋巴样前提细胞，共 同淋巴样前提细胞再生成NK前体细胞，NK前体细胞发育为不成熟NK细胞，最后，不成熟NK细 胞获得活化性和抑制性受体，并获得功能发育为成熟的NK细胞。
[0026] 进一步地，获取NK细胞的过程，包括以下步骤:获取⑶34+造血干细胞于含有造血 干细胞生长因子的干细胞培养基中进行培养。
[0027]其中，用于将⑶34+造血干细胞分化发育成NK细胞的造血干细胞生长因子，包括白 介素-2、白介素-12、白介素-15以及白介素-18;且优选地，在干细胞培养基中，白介素-2的 浓度为100_300U/ml、IL-12的浓度为0.5-4.5ng/ml、白介素-15的浓度为2-8ng/ml以及白介 素-18的浓度为5-15ng/ml。
[0028]白介素-2能够诱导⑶34+造血干细胞转化成NK细胞，且经白介素-2诱导⑶34+造血 干细胞所获得NK细胞具有明显的细胞毒作用，增强了NK细胞的杀伤活性；同时，白介素-2还 能够促进NK细胞的增殖，维持NK细胞长期生长;且能够在短时间内增强NK细胞的活性；IL-2 还能促进NK细胞分泌IFN- γ，增加其表达IL-2R+亚基等。
[0029]白介素-12能够诱导ΝΚ细胞产生IFN_y等细胞因子，有利于促进ΝΚ细胞的生长增 殖及活性提尚。
[0030] 白介素18能够增强NK细胞的溶解活性，激活NK细胞的活性，增强NK细胞的细胞毒 作用，又可促进穿孔素介导的NK细胞对靶细胞传统的杀伤活性。
[0031] 白介素-15不仅能够促进造血干细胞的增殖与分化，而且能够促进NK细胞NKG2D这 一活化性受体的表达，增强NK细胞杀伤相关性基因如穿孔素的表达，从而增强NK细胞的杀 伤功能。
[0032] 在这些生长因子的刺激下，造血干细胞数量增加，并且造血干细胞随着分化其表 型也发生变化，发育早期阶段，干细胞上的IL-2/IL-15R-i3细胞因子受体，即⑶122的表达出 现上调，干细胞随之分化为NK前体细胞，NK前体细胞具有定向发育为成熟NK