种前CD34+造血干细胞含量，并保证 CD34+造血干细胞在95%以上;再分别添加白介素-2、白介素-12、白介素-15和白介素-18， 并使得在GT-T551培养基中，白介素-2的浓度为200U/ml、白介素-12的浓度为2.5ng/ml和白 介素-15的浓度为5ng/mL以及白介素-18的浓度为10ng/mL;于37°C、5%⑶2孵箱培养，第一 天半量换液一次，之后每两天换液一次。
[0061 ] 实施例2
[0062] 与实施例1的不同之处在于，该实施例中所添加的造血干细胞生长因子在干细胞 培养基中的浓度分别为：白介素 -2的浓度为100U/ml、白介素 -12的浓度为0.5ng/ml和白介 素 -15的浓度为2ng/mL以及白介素 -18的浓度为5ng/mL。
[0063] 实施例3
[0064] 与实施例1的不同之处在于，该实施例中所添加的造血干细胞生长因子在干细胞 培养基中的浓度分别为：白介素-2的浓度为300U/ml、白介素-12的浓度为4.5ng/ml和白介 素-15的浓度为8ng/mL以及白介素-18的浓度为15ng/mL。
[0065] 实施例4
[0066] 与实施例1的不同之处在于，该实施例中所添加的造血干细胞生长因子含有白介 素 -2,其中添加有抗CD3单克隆抗体;且在干细胞培养基中：白介素 -2的浓度为5ng/ml以及 抗CD3单克隆抗体的浓度为5ng/ml。
[0067] 实施例5
[0068] 与实施例1的不同之处在于，该实施例中所添加的造血干细胞生长因子含有白介 素 -2，其中添加有抗CD3单克隆抗体;且在干细胞培养基中：白介素 -2的浓度为15ng/ml以及 抗⑶3单克隆抗体的浓度为15ng/ml。
[0069] 实施例6
[0070] 与实施例1的不同之处在于，该实施例中所添加的造血干细胞生长因子含有白介 素 -2，其中添加有抗CD3单克隆抗体;且在干细胞培养基中：白介素 -2的浓度为10ng/ml以及 抗⑶3单克隆抗体的浓度为10ng/ml。
[0071]为进一步验证本发明提供的NK细胞体外三维扩增培养方法的显著效果，通过以下 实验进行检测验证。
[0072] 检测对象：
[0073]对照组:与本发明实施例1不同之处在于，该组采用现有技术中的二维环境进行NK 细胞扩增培养所获得的细胞；
[0074]检测组1-6:分别为本发明实施例1-6所获得的细胞。
[0075] 1、NK细胞的流式细胞仪分析
[0076] 应用Becton Dickinson型流式细胞仪对扩增后的NK细胞进行计数，检测结果如下 表1。
[0077] 表 1
[0078] L0079」 由以上结采η」以宥出，随看对CD34T造血十细胞培弄大数的增加，检测组1-6中的 细胞数量逐渐增加，且均远高于对照组中的细胞数量；由此可知，通过本发明提供的NK细胞 的体外三维扩增培养方法所获得的NK细胞数量较多，提高了NK细胞的扩增率。
[0080] 2、NK细胞杀伤活性的检测
[0081 ] 收集对数生长期的K562细胞(人红白血病细胞系K562细胞，购得），重悬于0.5ml的 含10%FCS的RPMI1640培养基中，按100yCi/LX106细胞加入51Cr。于37°°C、5%C〇2孵箱中孵 育2h，每隔15min摇匀一次，标记完毕后洗涤3次，调整细胞浓度至lX10 5/mL加入圆底96孔 板中，lOOyL/孔，作为杀伤实验中的靶细胞。按10:1、5:1和2.5:1等效IE比加入相应量的NK 细胞，在37°C、5 %C02孵箱中孵育4h，每孔收集100yL上清，测γ射线cpm值，按以下公式计算 杀伤率:杀伤率（％ )=(实验组cpm值-自然释放cpm值)/(最大释放cpm值-自然释放cpm值） X 100%，检测数据见下表2:
[0082] 表 2
[0083]
[0084] 检测结果：由表2中数据可知，检测组1-6的细胞杀伤率均大于对照组，由此说明， 本发明提供的NK细胞的三维扩增培养方法提高了NK细胞的杀伤活性。
[0085] 综上所述，本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，采用壳聚糖-海藻酸 钠模拟NK细胞生长的体内微环境进行扩增培养NK细胞，不仅能够促进NK细胞的发育及扩 增，提高NK细胞的细胞活性及扩增率，而且还能够提高NK细胞的杀伤活性，对于NK细胞的临 床应用具有重要的意义，解决了现有技术中，通过饲养细胞于二维环境中扩增培养NK细胞 存在的操作流程复杂、NK细胞扩增率低，杀伤活性差等问题。
[0086]以上结合本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方 式，上述的【具体实施方式】仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发 明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这 些均属于本发明的保护之内。
【主权项】
1. 一种NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于:所述培养方法包括以下步骤： 获取NK细胞； 将所述NK细胞接种于三维培养支架中进行体外三维扩增培养；其中，三维培养支架为 壳聚糖-海藻酸钠支架。2. 根据权利要求1所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述壳聚糖-海藻酸钠支架的制备过程，包括以下步骤： 取海藻酸钠溶于蒸馏水中，壳聚糖溶于醋酸溶液中，加热溶胀；用冰醋酸分别调节壳聚 糖和海藻酸钠溶液的pH至3.0~5.0后，混合均匀，真空脱泡后于-5°C~_198°C下冷冻并冻 干。3. 根据权利要求2所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述壳聚糖-海藻酸钠支架的制备过程，还包括在壳聚糖和海藻酸钠溶液混合后，添加除镁离子以外的 二价金属离子盐溶液的步骤。4. 根据权利要求1所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，获取NK细胞的 过程，包括以下步骤： 获取CD34+造血干细胞于含有造血干细胞生长因子的干细胞培养基中进行刺激分化成NK细胞。5. 根据权利要求4所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述造血干细 胞生长因子包括白介素-2、白介素-12、白介素-15以及白介素-18。6. 根据权利要求5所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述干细胞培 养基中，白介素2的浓度为100_300U/ml、IL-12的浓度为0.5-4.5ng/ml、白介素-15的浓度为 2-8ng/ml以及白介素-18的浓度为5-15ng/ml。7. 根据权利要求4所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述造血干细 胞生长因子包括白介素-2,且所述造血干细胞生长因子中还添加有抗⑶3单克隆抗体。8. 根据权利要求7所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述干细胞培 养基中，白介素-2的浓度为5-15ng/ml、抗CD3单克隆抗体的浓度为5-15ng/ml。9. 根据权利要求4所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，对所述NK细胞 进行体外扩增培养的步骤为:将所述壳聚糖-海藻酸钠研碎加入乙酸中复溶，并添加所述含 有造血干细胞生长因子的干细胞培养基，接种所述NK细胞进行培养20-50天。10. 根据权利要求4所述的NK细胞的体外三维扩增培养方法，其特征在于，所述CD34+造 血干细胞的获取过程，包括以下步骤： 从血细胞中分离出单个核细胞，经磁珠分选出⑶34+造血干细胞。
【专利摘要】本发明涉及一种NK细胞的体外三维扩增培养方法，所述培养方法包括以下步骤：获取NK细胞；将所述NK细胞接种于三维培养支架中进行体外三维扩增培养；其中，三维培养支架为壳聚糖-海藻酸钠支架。通过利用壳聚糖-海藻酸钠支架的多孔隙结构及其机械性能和生物相容性，扩大了NK细胞的生长空间及与营养物质的接触面积，也可使得NK细胞能够均匀分布在壳聚糖-海藻酸钠支架中，从而能够提高NK细胞的细胞活性，有利于提高NK细胞的扩增率及其杀伤活性；从而解决了现有技术中采用饲养细胞于二维环境中培养NK细胞存在的NK细胞活性差、扩增率低等缺陷。
【IPC分类】C12N5/0783
【公开号】CN105441390
【申请号】CN201510796650
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年11月18日