细胞的能力，但 NK前体细胞表面不表达⑶56抗原；同时，NK前体细胞因表达⑶122分子即IL-2/IL-15受体β 上调，所以对白介素-15的刺激增强非常敏感，白介素-15可以促进NK细胞的发育，白介素-15主要来自于骨髓微环境中，因此，采用IL-15能够更好地模拟NK细胞生长的微环境;此外， IL-15可以使NK细胞前体扩增并分化为表达各种抑制性受体和活化性受体的成熟NK细胞。
[0033] 在本发明提供的另一实施例中，造血干细胞生长因子包括白介素-2,其中添加有 抗⑶3单克隆抗体;优选地，在干细胞培养基中，白介素-2的浓度为5-15ng/ml、抗⑶3单克隆 抗体的浓度为5_15ng/ml。
[0034]其中，抗CD3单克隆抗体不仅能够促进NK细胞的生长增殖，而且能够增强NK细胞的 细胞毒作用，促进穿孔素介导的NK细胞的杀伤活性。
[0035] 进一步地，步骤S1中还包括获取⑶34+造血干细胞的过程，而⑶34+造血干细胞则是 从外周血血细胞中分离出单个核细胞后，经磁珠分选出来的。从单个核细胞中经磁珠分选 出⑶34+造血干细胞的具体过程为：
[0036]取单个核细胞，重悬细胞密度为2 X(107~108)个/ml，以每毫升细胞悬液加入80~ 150yL抗体的比例加入⑶34抗体混合物，室温孵育15~30分钟;然后按每毫升细胞悬液加入 50~lOOyL磁珠的比例，加入⑶34+磁珠充分混匀，室温孵育后，洗涤，混匀细胞后，执行以下 操作A:将细胞置于磁场中5~10分钟后，去除磁场，洗涤，混勾细胞，再次置于磁场5~10分 钟，去除磁场，洗涤，重复此操作A至少3次以上，即可收获⑶34+造血干细胞。
[0037] 步骤S2中，对NK细胞进行体外培养所采用的培养基为干细胞培养基，可以与培养 CD34+造血干细胞所采用的干细胞培养基保持一致;优选地，该干细胞培养基为GT-T551培 养基，购自于宝生物工程(大连)公司。
[0038] 进一步地，步骤S2中，壳聚糖-海藻酸钠支架的制备过程，包括以下步骤：
[0039] 取海藻酸钠溶于蒸馏水中，壳聚糖溶于醋酸溶液中，分别加热溶胀;用冰醋酸分别 调节壳聚糖和海藻酸钠溶液的pH至3.0~5.0后，混合均匀，真空脱泡后于-5°C-198°C下冷 冻并冻干;优选地，海藻酸钠与壳聚糖的质量比为5:3~3:5。
[0040] 进一步地，在壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液混合后，还添加有除镁离子以外的二价 金属离子盐溶液，优选地，二价金属离子盐溶液为CaCl 2溶液;其中，壳聚糖是由甲壳素脱乙 酰基得到的天然多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，但壳聚糖的机械强度较差； 而海藻酸钠是从褐藻中提取的天然多糖，其生物相容性良好，具有良好的力学性能和支架 成型能力，机械性能较好;因此由海藻酸钠和壳聚糖复合形成的壳聚糖-海藻酸钠支架在力 学性能和降解可控性方面可形成互补，不仅提高了支架的生物相容性，而且提高了其机械 性能和孔隙率，能够长时间为NK细胞提供三维生长空间，以模拟NK细胞体内生长的微环境， 使得NK细胞能够充分接触营养物质，最终达到提高NK细胞的细胞活性、扩增率以及杀伤活 性的目的。
[0041] 海藻酸钠在除镁以外的二价金属离子的作用下交联而失去了流变性后，水分子的 流动受到了抑制，进而产生了含水量极高且具有通孔的凝胶体，并且海藻酸钠的凝胶体不 是热可逆的，具有很好的稳定性及生物相容性，因此，在壳聚糖和海藻酸钠均匀混合之后， 加入二价金属离子，在海藻酸钠凝胶体形成的过程中即可将壳聚糖包围其中，使得壳聚糖 能够均匀分布于海藻酸钠凝胶体内，使三维培养支架的结构更加稳固，从而为NK细胞提供 稳定的三维生长空间，更有利于NK细胞的黏附生长。
[0042]步骤S2的具体过程为：
[0043]取研碎后的壳聚糖-海藻酸钠支架，于助溶剂乙酸中复溶后，接种于细胞培养容器 中，并在细胞培养容器中添加含有造血干细胞生长因子的干细胞培养基，然后接种步骤S1 中获得的NK细胞进行培养。
[0044]进一步地，本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法，更为简化的过程步骤 为：
[0045] 从外周血中分离出⑶34+造血干细胞；
[0046]取研碎后的壳聚糖-海藻酸钠支架溶于助溶剂中，待充分溶解后接种于细胞培养 容器中，然后向含有壳聚糖-海藻酸钠支架的细胞培养容器中添加含有造血干细胞生长因 子的干细胞培养基中；其中，造血干细胞生长因子包括白介素-2、白介素-12、白介素-15以 及白介素-18;或者造血干细胞生长因子为白介素-2，其中，添加有抗CD3单克隆抗体;优选 地，干细胞培养基中，白介素-2的浓度为100_300U/ml、IL-12的浓度为0.5-4.5ng/ml、白介 素-15的浓度为2-8ng/ml以及白介素-18的浓度为5-15ng/ml;或者，干细胞培养基中，白介 素-2的浓度为5-15ng/ml，抗CD3单克隆抗体的浓度为5-15ng/ml。
[0047] 再并接种⑶34+造血干细胞进行培养20-50天，即可收获扩增后的NK细胞。
[0048] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限 定本发明。
【具体实施方式】 [0049] 为：
[0050] 实施例1
[00511本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法，包括以下步骤：
[0052] Sla、获取 NK 细胞；
[0053] Slla、单个核细胞的分离；
[0054]采集100ml人外周血的血样，或80mL新生儿脐带血的血样，用1-2倍体积的PBS溶液 稀释血样，充分混匀后，得到PBS血样混合液，然后在每个50ml离心管中先加入15ml的 Ficoll分离液，Ficoll分离液的密度为1.077g/mL;再缓慢加入20-30ml的PBS血样混合液， 室温离心，离心机升降速均调为0,于20°C、400g，离心30min，中间层为单个核细胞；用巴斯 德吸管小心吸取，之后用1 XPBS加满离心管，充分离心洗涤单个核细胞(400g，离心10min)， 重悬细胞，备用。
[0055] S12a、CD34+造血干细胞的分选；
[0056]将步骤Slla中获得的单个核细胞以台盼蓝染色计数活细胞后调为2 X108个/ml的 细胞悬液，按每毫升细胞悬液加入l〇〇yL抗体的比例，加入CD34抗体混合物，用移液器上下 吹打充分混匀，室温孵育15分钟；然后按每毫升细胞悬液加入50yL磁珠的比例，加入CD34+ 磁珠充分吹打混匀，室温孵育10分钟后，将细胞转入聚苯乙烯试管（12 X 75rnm)，加 PBS洗涤 液(含2^^83、0.01^^0了4)至2.51111，在试管内用移液器上下轻轻吹打2~3次，混匀细胞。再 将试管插入磁极中，静置五分钟;然后将磁极连试管一起拿起，以连续缓慢的动作倾倒磁极 至倒置状态，倒出上清部分。磁性标记的细胞由于磁极磁场的吸引，仍然留在试管内。保持 磁极及试管倒置2~3秒，然后使试管口恢复向上的位置。从磁极中取出试管，加入2.5ml洗 涤液，用移液器轻轻吹打细胞悬液2~3次，混匀细胞，再将试管放回磁极中，静置五分钟。重 复洗涤4次后，试管中保留的为⑶34+造血干细胞，备用。
[0057] S2a、将⑶34+造血干细胞接种于三维培养支架中进行培养；
[0058] S21a、壳聚糖-海藻酸钠支架的制备
[0059] 取l.Og海藻酸钠溶于100ml蒸馏水中，取0.5g壳聚糖溶于50ml的1%醋酸溶液中， 分别将海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液于50°C加热溶解后溶胀8小时以上，使海藻酸钠和壳聚 糖充分溶解后，分别向海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液中添加冰醋酸溶液，调节海藻酸钠溶液 和壳聚糖溶液的pH值均至3.0，然后将海藻酸钠溶液与壳聚糖溶液混合后，匀速滴加质量分 数为3 %的CaCl2溶液，经去离子水充分洗涤，真空脱泡后，于-20°C下冷冻1小时，然后于冷 冻-干燥机中冻干24小时。S22a、将CD34+造血干细胞接种于壳聚糖-海藻酸钠支架中进行培 养；
[0060] 取〇.5g研碎的壳聚糖-海藻酸钠支架溶于10ml的3%乙酸和20ml蒸馏水中复溶，然 后接种于含有GT-T551培养基的24孔板中；调整CD34+造血干细胞的细胞悬液密度为1 X 109 个/ml，接种于上述24孔板中，接种前做流式分析检测接