鱼类病毒性出血性败血症病毒g基因的真核表达方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因的真核表达方法，属于生物 基因工程领域。
【背景技术】：
[0002] 病毒性出血性败血症病毒（viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)是引起 鲑鳟鱼类和多种海水鱼类呈暴发性流行的烈性传染病，属弹状病毒科，粒外弹状病毒属的 成员。病毒基因组从3'端至5'端依次包含N(核蛋白）-P(磷蛋白）-M(基质蛋白）-G(糖 蛋白）_NV(非结构蛋白）-L(聚合酶蛋白）6个基因。
[0003] 表面糖蛋白基因G是其重要抗原，也是各类免疫学检测试验优选的抗体制备材 料。然而由于不同物种密码子的偏爱性不同，未经改造的野生型G基因在体外表达时往往 不理想，阻碍了VHSVG基因编码蛋白抗体的获得。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因主 要抗原域的真核表达方法。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
[0006] 在进行真核表达之前，需要对鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因的主要抗原域 的进行预测。运用NCBIConservedDomains查找工具分析发现该基因氨基酸序列含有 的保守结构域（图1所示）。利用丹麦科技大学生物序列分析中心（CBS)网站在线程序 SignalP4. 1对VHSVG蛋白的氨基酸序列作信号肽预测（图2所示），并避开信号肽区域。 采用OptimumAntigen?分析软件预测蛋白的优势抗原肽段，应用亲水性、表面特性、柔韧性 和二级结构4种参数联合的Jameson-Wolf法综合预测蛋白的抗原指数（表1、图3所示）， 并根据其结果选取主要抗原域（Mainantigenicdomains,MAD)4〇-435肽段，命名为GM。
[0007] 本发明提供的密码子优化后的鱼类病毒性出血性败血症病毒GM基因序列，序列 如如SEQIDNO. 1所示。
[0008] 本发明还提供一种含有上述基因的重组表达载体。
[0009] 进一步的，本发明提供的鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因的真核表达方法， 其特征在于，包括下列步骤：
[0010] (1)密码子优化的基因合成
[0011] 利用http ://gcua. schoedl. de/服务器的密码子分析软件，分析VHSV-H株基因序 列（GenBank登录号KJ768664)在昆虫细胞中的使用频率，结果发现，G基因中有17种密码 子在昆虫细胞中使用频率低于20%。将选取的G基因40-435氨基酸肽段中低频率密码子 进行优化，优化后的基因序列如上所示。
[0012] 同时为便于纯化，在40-435氨基酸序列区域N端加6XHis标签。因此，拟设计表 达的蛋白序列如下：
[0013]MHHHHHHTPLYTHPSNCREDSFVPIRPAQLRCPHEFEDINKGLVSVPTRIIHLPLSVTSVSAVASGHYL HRVTYRVTCSTSFFGGQTIEKTILEAKLSRQEATNEASKDHEYPFFPEPSCIWMKNNVHKDITHYYKTPKTVSVDLY SRKFLNPDFIEGVCTTSPCQTHWQGVYWVGATPTAHCPTSETLEGHLFTRTHDHRVVKAIVAGHHPffGLTMACTVTF CGTEffIKTDLGDLIQVTGPGGARKLTPKKCVNTDIQMRGATDDFSYLNHLITNMAQRTECLDAHSDITASGKISSFL LSKFRPSHPGPGKAHYLLEGQ頂R⑶CDYEAWSINYNSAQYKTVNNTWKSWKRVNNNTDGYDGMIF⑶KLIIPDIE KYQSVYDSGMLVQRNLVEVPHLSIVF
[0014] 随后将设计的40-435氨基酸区域进行密码子优化的核酸序列，并交由南京金斯 瑞生物技术有限公司进行基因合成并克隆至PUC57中。
[0015] (2)重组杆状病毒转移载体的构建
[0016] 双酶切PUC57-GM质粒及转座质粒pFsatBacdual，酶切产物胶回收后用T4DNA连接 酶连接，转化E.coliDH5a感受态细胞。经氨苄抗性筛选挑取单菌落，同时进行双酶切鉴 定，鉴定正确的转移载体命名为pFBd-GM。
[0017] (3)穿梭质粒的构建
[0018] 将重组pFBd-GM质粒转化含有Bacmid的感受态细胞DH10Bac，Bacmid与pFBd-GM 在DHlOBac细胞中发生同源重组，经三抗（庆大霉素7yg/mL、卡那霉素50yg/mL和四环 素10yg/mL)抗性筛选及蓝白斑筛选，挑取白色菌落，重组Bacmid用M13F/M13R通用引物 进行PCR鉴定，扩增条件如下：93°C预变性3min，94°C30s，55°C45s，72°C5min，30个循环， 72°C7min。鉴定正确的穿梭质粒命名为rBacmid-GM。pFastBacdual质粒经相同处理得到 rBacmid-N作为阴性对照。
[0019] (4)重组Bacmid的转染及表达产物的分析鉴定
[0020] 用脂质体法将重组rBacmid-GM和rBacmid-N分别转染sf9昆虫细胞（9X105个/ mL)，28°C培养，出现细胞病变时收集细胞培养液上清，在sf9细胞上传3代。用细胞基因组 DNA提取试剂盒提取感染rBacmid-GM和rBacmid-N的细胞的病毒基因组，按照Bac-to-Bac 说明书推荐程序进行PCR鉴定。鉴定正确后，收集转染后第3代细胞培养物，裂解液裂解细 胞后超声破碎，离心取上清，进行SDS-PAGE电泳，并用相同的方法处理正常sf9细胞作为阴 性对照。将SDS-PAGE电泳产物转印至PVDF膜，3%BSA进行封闭，1:100稀释VHSV羊抗阳 性血清，37°C孵育lh，用1:5000稀释的兔抗羊HRP-IgG(辣根过氧化物酶标记）37°C孵育 lh，最后进彳丁显色鉴定。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 本发明对G蛋白采取了B细胞表位多参数预测与主要抗原域的截段表达相结合的 策略，通过密码子的优化和合成基因可以显著的提高蛋白产量；实现了G蛋白抗原域的在 Bac-to-Bac杆状病毒系统中的高效表达。经Westernblotting对其活性进行初步鉴定分 析证实，该表达蛋白具备免疫原性，这为进一步进行表位疫苗的开发和VHSV的分子诊断技 术的建立提供了基础。
[0023] 本发明表明利用真核表达系统可获得与VHSV中G蛋白空间结构更为接近的重组 蛋白，并为进一步开展G基因功能奠定下良好的基础。
【附图说明】：
[0024] 图1是VHSVG蛋白氨基酸序列的结构域⑶D分析结果。
[0025] 图2是NeuralNetworks(NN)对VHSVG氨基酸序列的信号肽预测结果。
[0026] 图3是VHSVG蛋白氨基酸序列的抗原指数分析结果。
[0027] 图4是穿梭质粒的PCR鉴定结果，M:DNAmarkerDL15000 ;以rBacmid-GM为模板 的PCR产物
[0028] 图5是重组杆状病毒细胞破碎后上清Ni柱纯化结果；M:蛋白Marker;1:用盐酸 胍溶解的沉淀；2:纯化后流出；3:20mM咪唑洗脱；4-8 :250mM咪唑洗脱。
[0029]图 6 是Ni柱纯化后Western-blot分析；Ml蛋白Marker(120、80、60、40、30、 20、10) ;M2 蛋白Marker(120、85、60、40、22) ;BSA(2.0yg);纯化后G蛋白（1.95yg); VHSV-GM(羊抗血清）。
【具体实施方式】：
[0030] 1材料和方法
[0031] L 1菌株、细胞系与质粒
[0032]VHSV-H株由本实验室分离并保存。E.coliDH5a菌株、pFastBacdual转座质粒 以及DHlOBac?CompetentCells感受态细胞购自南京金斯瑞生物有限公司提供。Sf9昆 虫细胞由青岛蔚蓝生物，骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存。
[0033] 1. 2试剂
[0034]胎牛血清、CellfectinIIReagent、昆虫细胞培养基sf900_IISFM、Grace培养基 及Lipofectaminetmreagent购自Gibco公司，RazoalRNA提取试剂盒购自Promega公司； M-MLV反转录酶、ExTaqDNA扩增用酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司；T4连接酶和RNA提 取试剂盒购自Promage公司；胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Tiangen公司；6XHis 蛋白质纯化树脂Ni-NTA购自QIAGEN公司；兔抗羊HRP-IgG、羊抗鼠HRP-IgG购自Jackson 公司；羊抗鼠FITC-IgG、PEG4000、HAT等购自Sigma公司；BALB/c购自山东大学实验动物中 心。VHSV羊抗阳