性血清由中国检验检疫科学研究院惠赠保存。
[0035] 1. 3利用生物信息学分析工具对主要抗原域的预测
[0036] 运用NCBIConservedDomains查找工具分析发现该基因氨基酸序列含有的保守 结构域。利用丹麦科技大学生物序列分析中心（CBS)网站在线程序SignalP4.1对VHSVG 蛋白的氨基酸序列作信号肽预测。采用OptimumAntigen?分析软件预测蛋白的优势抗原肽 段，应用亲水性、表面特性、柔韧性和二级结构4种参数联合的Jameson-Wolf法[2]综合预 测蛋白的抗原指数，并根据其结果选取主要抗原域（Mainantigenicdomains,MAD)命名为 GM〇
[0037] 利用NCBIConservedDomains查找工具分析发现该基因氨基酸序列含有1个保 守结构域，属弹状病毒衣壳糖蛋白家族成员。如图1。
[0038] 利用丹麦科技大学生物序列分析中心（CBS)网站在线程序SignalP4. 1对VHSVG 蛋白的氨基酸序列作信号肽预测，结果如图2。由图可见，VHSVG蛋白序列中所有位点预测 到在20_21aa位点处存在信号肽切割位点，含有信号肽。因此在后续表达中拟剔除或避开 该信号肽段。
[0039] 采用OptimumAntigen?分析软件预测结果显示，此株G蛋白的大多数区域的抗原 指数都比较高，尽管这些区域多分布在亲水性区域和可塑性区域，但一般认为抗原表位还 必须存在于溶剂可及性区域。其中氨基酸序列中蓝色区段的抗原性指数较高，可能是B细 胞表位优势区域（详见表1、图3)，因此选取全基因中的40-435AA的肽段，且避开了信号 肽，将包含抗原指数最高的区域进行后续表达。同时为便于纯化，我们还在40-435氨基酸 序列区域N端加上了 6XHis标签。
[0040] 表1VHSVG蛋白抗原表位分析
[0041]
[0043] 1.4密码子优化的基因合成
[0044] 利用http ://gcua. schoedl. de/服务器的密码子分析软件，分析VHSV-H株基因序 列（GenBank登录号KJ768664)在昆虫细胞中的使用频率，并将G基因中低频率密码子使用 密集区域的密码子进行优化，随后将设计的添加了 6XHis标签的40-435氨基酸区域的核 酸序列，交由南京金斯瑞生物技术有限公司进行基因合成并克隆至PUC57中。
[0045] 1. 5重组杆状病毒转移载体的构建
[0046] 双酶切pUC57-GM质粒及转座质粒pFsatBacdual，酶切产物胶回收后用T4DNA连接 酶连接，转化E.coliDH5a感受态细胞。经氨苄抗性筛选挑取单菌落，同时进行双酶切鉴 定，鉴定正确的转移载体命名为pFBd-GM。
[0047] 1.6穿梭质粒的构建
[0048] 将重组pFBd-GM质粒转化含有Bacmid的感受态细胞DHlOBac，Bacmid与pFBd-GM 在DHlOBac细胞中发生同源重组，经三抗（庆大霉素7 y g/mL、卡那霉素50 y g/mL和四环 素10 y g/mL)抗性筛选及蓝白斑筛选，挑取白色菌落，重组Bacmid用M13F/M13R通用引物 进行PCR鉴定，扩增条件如下：93°C预变性3min，94°C30s，55°C45s，72°C5min，30个循环， 72°C7min。鉴定正确的穿梭质粒命名为rBacmid-GM。pFastBacdual质粒经相同处理得到 rBacmid-N作为阴性对照。
[0049] 将合成GM基因片段和6His组氨酸标签克隆入pFastBacdual，经筛选鉴定获得了 重组转移载体pFastBacdualGM，转化DHlOBac后进行筛选，获得的重组质粒经PCR扩增鉴 定，穿梭质粒rBacmid-GM的扩增产物片段大小为3769bp，均与预期一致，证明获得了正确 质粒（见图4)。
[0050] 1. 7重组Bacmid的转染及表达产物的分析鉴定
[0051] 用脂质体法将重组rBacmid-GM和rBacmid-N分别转染sf9昆虫细胞（9X105个/ mL)，28°C培养，出现细胞病变时收集细胞培养液上清，在sf9细胞上传3代。用细胞基因组 DNA提取试剂盒提取感染rBacmid-GM和rBacmid-N的细胞的病毒基因组，按照Bac-to-Bac 说明书推荐程序进行PCR鉴定。鉴定正确后，收集转染后第3代细胞培养物，裂解液裂解细 胞后超声破碎，离心取上清，进行SDS-PAGE电泳，并用相同的方法处理正常sf9细胞作为阴 性对照。将SDS-PAGE电泳产物转印至PVDF膜，3%BSA进行封闭，1:100稀释VHSV羊抗阳 性血清，37°C孵育lh，用1:5000稀释的兔抗羊HRP-IgG(辣根过氧化物酶标记）37°C孵育 lh，最后进彳丁显色鉴定。
[0052] 重组杆状病毒接种sf9细胞，72h收获。用含蛋白酶抑制剂的裂解溶液裂解，经超 声波破碎后进行离心。离心后上清和沉淀分别用Ni柱进行纯化，SDS-PAGE分析纯化的不 同组分，结果（见图5)显示在45kd处有预测目的条带出现。Western blotting检测结果 显示，在目的条带处出现一条棕色反应带，表明His-GM可被羊抗VHSV多克隆血清识别（图 6) 〇
【主权项】
1. 密码子优化后的鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因主要抗原域核酸序列，其特 征在于序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -种含有如权利要求1所述基因的重组表达载体。3. 鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因的真核表达方法，其特征在于，包括下列步 骤： (1) 密码子优化的G基因主要抗原域核酸片段的合成，核酸序列如权利要求1所示 (2) 重组杆状病毒转移载体的构建 (3) 穿梭质粒的构建 (4) 重组Bacmid的转染及表达产物的分析鉴定。4. 根据权利要求3所述的真核表达方法，其特征在于，所述的密码子优化的基因合成 具体步骤为： 将G基因中低频率密码子进行优化，并在G基因抗原域C端加上接头及6 Xhis序列。5. 根据权利要求3所述的真核表达方法，其特征在于，所述的重组杆状病毒转移载体 的构建具体步骤为： 双酶切PUC57-GM质粒及转座质粒pFsatBacdual，酶切产物胶回收后用T4 DNA连接 酶连接，转化E. coli DH5 a感受态细胞；经氨苄抗性筛选挑取单菌落，同时进行双酶切鉴 定，鉴定正确的转移载体命名为pFBd-GM。6. 根据权利要求3所述的真核表达方法，其特征在于，所述的穿梭质粒的构建具体步 骤为：将重组PFBd-GM质粒转化含有Bacmid的感受态细胞DHlOBac，Bacmid与pFBd-GM 在DHlOBac细胞中发生同源重组，经三抗：庆大霉素7Pg/mL、卡那霉素50l^g/mL和四环素 10Kg/mL的抗性筛选及蓝白斑筛选，挑取白色菌落，重组Bacmid用M13F/M13R引物进行 PCR 鉴定，扩增条件如下：93°C预变性 3min，94°C 30s，55°C 45s，72°C 5min，30 个 循环，72°C 7min;鉴定正确的穿梭质粒命名为rBacmid_GM;pFastBacdual质粒经相同处 理得到rBacmid-N作为阴性对照。7. 根据权利要求3所述的真核表达方法，其特征在于，所述的重组Bacmid的转染及 表达产物的分析鉴定具体步骤为： 用脂质体法将重组rBacmid-GM和rBacmid-N分别转染sf9昆虫细胞，28°C培养，出现 细胞病变时收集细胞培养液上清，在sf9细胞上传3代；用细胞基因组DNA提取试剂盒提 取感染rBacmid-GM和rBacmid-N的细胞的病毒基因组，进行PCR鉴定； 鉴定正确后，收集转染后第3代细胞培养物，裂解液裂解细胞后超声破碎，离心取上 清，进行SDS-PAGE电泳，并用相同的方法处理正常sf9细胞作为阴性对照；将SDS-PAGE电 泳产物转印至PVDF膜，3%BSA进行封闭，1:100稀释VHSV羊抗阳性血清，37°C孵育lh，用 1:5000稀释的兔抗羊HRP-IgG (辣根过氧化物酶标记）37°C孵育lh，最后进行显色鉴定。
【专利摘要】本发明公开了一种鱼类病毒性出血性败血症病毒G基因的真核表达方法，包括下列步骤：（1）密码子优化的主要抗原域的基因合成；（2）重组杆状病毒转移载体的构建；（3）穿梭质粒的构建；（4）重组Bacmid的转染及表达产物的分析鉴定。本发明实现了G蛋白抗原域的在Bac-to-Bac杆状病毒系统中的高效表达；经Western？blotting对其活性进行初步鉴定分析证实，该表达蛋白具备免疫原性，这为进一步进行表位疫苗的开发和VHSV的分子诊断技术的建立提供了基础。
【IPC分类】C07K14/145, C12N15/47, C12N15/866
【公开号】CN105132438
【申请号】CN201510666267
【发明人】孙涛, 尹伟力, 房保海, 岳志芹, 梁成珠
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年10月15日