玉米营养器官特异性启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及玉米营养器官特异性启动子及其应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是重要的顺式作用元件，调控基因的转录和表达，根据启动子的转录模式 不同将其分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三类。选择何种启动子来驱动基因的表 达，是当前基因工程研究的热点。组织特异性启动子亦称器官特异性启动子是启动子类型 之一，在这类启动子的驱动下，基因的表达往往只在某些特定的器官和和组织部位高效表 达，可有效的避免植物营养的不必要浪费以及对植物造成的不利影响，并表现发育调节等 特性。
[0003] 目前已从植物中分离得到了不同类型的器官特异性启动子，包括根、茎、叶、花粉、 维管束、种子或果实、分生组织，气孔等。Keller等（1989)以427bpGRPI. 8启动子驱动⑶S 基因，发现⑶S基因在转基因烟草中呈维管束特异表达。Azria等（2011)从水稻中分离到 了一种Orysl花粉特异性表达启动子；Vincent等（2002)也率先获得了柏树PtNIPl基因 的胚胎发育特异性启动子；Cai等（2007)分离克隆了一个水稻来源的绿色组织特异性启动 子PD540并与cry1AC基因相融合，得到的转基因水稻，有很好的抗虫性，而且在种子中检测 不到蛋白的表达；
[0004] 我国是一个有13亿人口的大国，其中有7亿农民。因此，国家将解决人口温饱问 题和增加农民收入问题放在发展国民经济的首位。玉米作为全世界总产量最高的重要粮食 作物和重要的饲料来源对其基因工程的研究具有重要的意义。同时作为食用植物，外源基 因最好直接表达在食用部位以外的其他部位中，更加符合转基因植物的安全性。目前在玉 米中缺乏一种能调控目的基因在营养器官部位表达，而生殖器官不表达的启动子。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供了能够控制目的基因特异性表达的玉米营养 器官特异性启动子及其应用。
[0006] 为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明的一种玉米营养器官 特异性表达启动子PZmCCR，具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。PZmCCR启动子通过提取 玉米ZeamaysL.B73自交系的总DNA克隆获得，经过测序其为2145bp。
[0007] 本发明所述的启动子用于在水稻营养器官中特异性表达目的基因的用途。
[0008] 本发明包含所述的玉米营养器官特异性表达启动子的植物表达载体。该启动子能 在转基因水稻的营养器官中特异性表达，在生殖器官等其他器官中不表达。
[0009] 进一步地，所述植物表达载体是用玉米营养器官特异性表达启动子取代植物双元 表达载体PCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建得到的植物表达载体pCAM-PZmCCR。
[0010] 本发明所述的启动子或所述的植物表达载体在制备转基因植物中的应用。
[0011] 进一步地，所述转基因植物为转基因水稻。
[0012] 本发明包含所述的植物表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞为根癌农杆菌宿 主细胞。
[0013] 本发明的一种含有所述的玉米营养器官特异性表达启动子的转基因植物的制备 方法，包括如下步骤：
[0014] (a)将权利要求1所述的启动子、或权利要求3所述的植物表达载体导入水稻组织 细胞；
[0015] (b)在促进植物生长的条件下培养所述水稻组织细胞，获得转基因植物。
[0016] 通过农杆菌介导法转化水稻，共获得18株转基因植株，PCR检测有10株阳性株。 并对阳性植株的的不同组织部位都进行了⑶S组织化学染色。⑶S组织化学染色鉴定证实 PZmCCR启动子为营养器官特异性表达启动子，pCAM-PZmCCR为一种营养器官特异性表达 的载体。
[0017] 有益效果：本发明提供的一个营养器官特异性表达启动子PZmCCR及其表达载体， 将该启动子取代植物双元表达载体PCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建得到的新的植 物表达载体，能在水稻的营养器官中特异表达。该启动子可以控制目的基因在正常水稻营 养器官中特异表达，能指导外源基因在营养器官中特异性表达，用该方法筛选转基因水稻 具有阶段性强、灵敏度高的优点。而且根据该启动子只驱动下游基因在水稻的各种营养器 官中表达，而生殖器官中不表达的特点，可以将其连接各种有益的目的基因并转入植物中， 从而提高植物的抗逆境胁迫能力，增强抗病虫害能力以及营养物质吸收能力等。同时，在生 殖器官中不表达，不影响种子的品质，减少公众对转基因植物的担忧。因此本发明在玉米或 其他种子类作物的育种中将具有潜在的商业价值以及很好的应用价值。
【附图说明】
[0018] 图1PZmCCR启动子分子检测结果；A为PCR结果，B为双酶切结果，
[0019]M:DL-5000 1:条带大小为 2145bp2:HindIII和Ncol双酶切条带；
[0020] 图2为本发明的表达载体PZmC2H2的T-DNA区图谱；
[0021] 图3为本发明的⑶S基因的组织化学染色结果图；
[0022] 其中：1幼根；2幼茎；3幼叶；4成熟根；5成熟茎；6成熟叶；7颖壳；8花药；9胚 乳。
【具体实施方式】
[0023] 本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明 目的，而不用于限制本发明范围。
[0024] 本发明的一种玉米营养器官特异性表达启动子PZmCCR，具有SEQIDNO. 1所示的 核苷酸序列。PZmCCR启动子通过提取玉米ZeamaysL.B73自交系的总DNA克隆获得，经过 测序其为2145bp。
[0025] 本发明所述的启动子用于在水稻营养器官中特异性表达目的基因的用途。
[0026] 本发明包含所述的玉米营养器官特异性表达启动子的植物表达载体。该启动子能 在转基因水稻的营养器官中特异性表达，在生殖器官等其他器官中不表达。
[0027] 所述植物表达载体是用玉米营养器官特异性表达启动子取代植物双元表达载体 PCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建得到的植物表达载体pCAM-PZmCCR。
[0028] 本发明所述的启动子或所述的植物表达载体在制备转基因植物中的应用。
[0029] 所述转基因植物为转基因水稻。
[0030] 本发明包含所述的植物表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞为根癌农杆菌宿 主细胞。
[0031] 本发明的一种含有所述的玉米营养器官特异性表达启动子的转基因植物的制备 方法，包括如下步骤：
[0032] (a)将权利要求1所述的启动子、或权利要求3所述的植物表达载体导入水稻组织 细胞；
[0033] (b)在促进植物生长的条件下培养所述水稻组织细胞，获得转基因植物。
[0034] 通过农杆菌介导法转化水稻，共获得18株转基因植株，PCR检测有10株阳性株。 并对阳性植株的的不同组织部位都进行了⑶S组织化学染色。⑶S组织化学染色鉴定证实 PZmCCR启动子为营养器官特异性表达启动子，pCAM-PZmCCR为一种营养器官特异性表达 的载体。
[0035] 图lPZmCCR启动子分子检测结果。A为PCR结果；B为双酶切结果。
[0036]M:DL-5000 1:条带大小为 2145bp2:HindIII和Ncol双酶切条带
[0037] 图2为本发明的表达载体PZmCCR的T-DNA区图谱；
[0038]LB和RB分别表示为T-DNA的左边界和右边界；Hyg表示潮霉素抗性基因；Mcs表 示多克隆位点；Nos表示基因的终止子；HindIII和Ncol分别表示限制性内切酶HindIII和 Ncol的酶切位点；
[0039] 图3为本发明的⑶S基因的组织化学染色结果图；其中：1幼叶；2幼茎；3幼根；4 成熟叶；5成熟茎；6成熟根；7颖壳；8花药；9胚乳。
[0040] 所用引物均由深圳华大生物工程有限公司合成，上海生工公司测序；PTEAY-T1、 Taq酶、Trans5a感受态及相关的试剂盒购置北京全式金公司；限制性内切酶HindIII和 Ncol,T4连接酶购自TaKaRa公司；相应的抗生素来自上海生工和SIGMA公司；其余试剂均 为国产分析纯。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0041] 实施例1
[0042] 玉米营养器官特异性启动子PZmCCR的克隆
[0043] 根据NCBI网站上公布的PZmCCR启动子全长序列，设计PCR扩增该片段的引物，上 游引物加Hindlll的AAGCTT酶切位点，下游引物加Ncol的CCATGG酶切位点。
[0044] 引物序列如下：
[0045]引物 1 (上游引物）：5 '-CCCAAGCTTCAGGCTGTGGGACACCTCCAITCTA-3 '
[0046]引物 2 (下游引物）：5 '-CATGCCATGGGTGCTCCTCTGCTCTAGCTCTT-3 '
[0047] 以全式金公司植物基因组试剂盒提取的玉米B73基因组DNA为模板，用引物1和 引物2进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示：
[0048]表1
[0049]
[0050] PCR反应条件为：预变性：94°C5min;变性：94°C30s;退火：62°C30s;延伸： 72°C2min，27 个循环；总延伸：72°ClOmin。
[0051] 反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。回收并纯化2145bp的 目的片段；将全式金生