一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质技术领域。更具体地，涉及一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]对于临床疾病的研宄，由于很难在临床病人身上实现各种控制变量的实验，或者由于某种疾病成因差异较大、病程进展不一或疾病十分罕见，了解疾病发生进展机理以及寻找治疗手段一般都需要建立相应的实验动物模型。另外，当我们想研宄某个基因在生物体中的生理功能时，也需要建立一定的实验动物模型，并从多方面考察该基因的功能。因此，基因编辑(genome editing)技术在建立动物疾病模型和研宄基因功能中有着十分重要的地位。基因编辑技术包括了最早的依赖同源重组编辑、锌指核酸酶(Zinc FingerNuclease)、TALE核酸酶(Transcript1n activator like effector nucleases, TALENs)到最新的 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) /Cas (CRISPR-associated)系统。除了最先的依赖同源重组编辑以外，其余三种基因编辑系统均能在双链DNA上制造双链DNA断裂(DoubIe Strand Breaks, DSB)o双链DNA断裂产生后可通过同源重组(Homologous Recombinat1n, HR)或非同源末端连接(Non-HomologousEnd Joining，NHEJ)被重新修复。单独导入这些核酸酶，通过非同源末端连接可造成基因组特点位点的插入或缺失，有机会造成目标基因的移码，使目标蛋白失去正常功能；同时将这类核酸酶和修复模版导入细胞，通过同源重组有机会将基因组中序列替换为修复模版序列，产生人为的定向突变。
[0003]为满足研宄需要，简单易用的CRISPR系统在近两年飞速发展，在许多方面得到了广泛的应用。CRISPR是原核生物和古细菌的获得性免疫系统的一部分，主要用于对抗入侵的病毒和质粒。细菌中的CRISPR系统主要由三部分组成:Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA。其中，Cas9蛋白具有解旋酶和内切酶活性，当蛋白结合到DNA上时能识别靶向序列3’端的PAM序列使双链DNA解旋，且其上的两个内切酶活性位点介导双链DNA切割；crRNA具有30nt的序列用于识别DNA ；tracrRNA和crRNA部分配对，帮助crRNA成熟和于Cas9结合。现在的系统将crRNA和tracrRNA融合为一 sgRNA (single-guide RNA)，使系统进一步简化，只需Cas9蛋白和sgRNA就可进行DNA切割。目前，CRISPR系统可以用于在体外进行特定位点的DNA切割。利用CRISPR系统，通过生物内的DNA修复机制，可进行培养细胞的基因编辑，实现基因敲除或基因修复。目前CRISPR系统除了可用于敲除研宄特定基因的功能夕卜，数篇报道利用sgRNA文库实现了细胞水平的基因功能性筛选。将编码Cas9和sgRNA的质粒或RNA转导至胚胎干细胞、受精卵或胚胎，可快速制备果蝇、线虫、爪蟾、斑马鱼、小鼠、大鼠、猪、食蟹猴等多种基因敲除生物。此外，通过将不同蛋白融合至Cas9上，可实现基因组特点位点的活细胞成像，可人为促进或抑制细胞内基因转录。更为重要的是，目前已有研宄表明CRISPR系统可在生殖干细胞和诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)中进行基因修复治疗遗传疾病。另外，基于CRISPR的体细胞癌变、病原生物和病毒感染治疗也有很大的应用潜力。虽然目前对于CRISPR脱靶效应存在比较大争论，但无可否定，CRISPR系统在研宄基因功能和基因治疗方面有着十分重要的意义。
[0004]在应用CRISPR系统制作敲除动物方面，目前普遍流行将编码Cas9蛋白的mRNA和sgRNA共注射到受精卵或胚胎中。然而，由于mRNA翻译延迟，可能导致出生的动物嵌合体比例低下或同一动物体内基因修饰不一致。目前比较理想的方法是直接共注射Cas9蛋白和sgRNA，使基因编辑尽早产生。然而，现有的Cas9活性蛋白纯化手段仍比较繁琐，融合蛋白标签容易导致纯化中标签降解影响纯度和产量，在国内不容易获得大量蛋白满足制备敲除动物需要。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有Cas9蛋白制备方法的缺陷和技术不足，提供一种一步将带His标签的Cas9蛋白纯化出来的方法，并且保证所制备的Cas9蛋白无论在体内或体外都具有活性，适合用于胚胎注射以制备修饰动物。
[0006]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种可用于胚胎注射制备敲除小鼠的Cas9蛋白的制备方法，将Cas9蛋白序列转化入PET28a-ccdB-CmR载体，再转化至原核表达菌株，经过诱导表达后，收集菌体，经亲和纯化、用超滤管浓缩纯化、透析后即得到纯化的Cas9蛋白。所述pET-28-ccdB-CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind III和通ο I酶切位点之间插入Notl-ccdB-CmR-AscI序列得到。
[0007]所述Cas9蛋白来源于px330质粒，并包括N端和C端SV40核定位信号，通过NotI与Asc I酶切位点连于改良的pET28a质粒。所用的改良pET28a质粒在原始pET28a质粒基础上，在历III与Xho I之间，插入了 TEV蛋白酶切位点、Afoi I限制性核酸内切酶位点、氯霉素抗性基因、ccdB细菌生长致死蛋白、Asc I限制性核酸内切酶位点。
[0008]优选地，本发明制备Cas9蛋白时的诱导表达条件为:按照1:100的接种量，将表达菌接种LB培养基培养，于37°C过夜培养菌种至0D600=1.0，冰上冷却30分钟后，加终浓度为0.2mM的IPTG，于15°C继续培养24小时。
[0009]优选地，本发明纯化蛋白时，使用50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM、NaCl 10%甘油和40mM咪唑组成的裂解缓冲液进行菌体裂解。
[0010]优选地，本发明纯化蛋白时，以Ni Sepharose FF柱进行纯化。
[0011]优选地，本发明纯化蛋白时，以50mM Tris-HCl、pH8.0 300mM NaCl、10%甘油和250mM咪唑组成的洗脱缓冲液进行洗脱。
[0012]优选地，本发明纯化蛋白时，以30kDa透析袋于50mM Tris_HCl、pH8.0 300mM NaCl和10%甘油组成的透析液中进行透析。
[0013]具体地，本发明所述Cas9蛋白的制备方法包括如下步骤:
51.以携带有Cas9序列的px330质粒为模版，利用SEQID N0.1和2所示上下游引物进行PCR扩增；
52.利用NotI和Not I双酶切，将PCR扩增产物连接至pET28a-ccdB_CmR载体，得到重组质粒 pET-28a-Cas9 ； 53.重组质粒pET-28a-Cas9转化至BL21表达菌株，菌株用终浓度为0.2mM的IPTG，于15°C诱导表达24h ；
54.纯化:利用NiSepharose FF进行纯化；
55.浓缩:纯化后的Cas9蛋白再以10kDa超滤管浓缩，浓缩后蛋白加入透析液，以30kDa透析袋进行透析，透析后得到的Cas9蛋白添加甘油至终浓度50%后，分装液氮速冻保存于-80 0C ；
其中，步骤S2所述pET-28-ccdB-CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在Hind 111和Xho I酶切位点之间插入Notl-ccdB-CmR-AscI序列得到。
[0014]更具体地，本发明所述Cas9蛋白的制备方法的步骤如下:
51.获得Cas9目的片段:以携带有Cas9序列的px330质粒为模版，利用SEQID N0.1和2所示上下游引物进行PCR扩增；
52.构建重组质粒pET-28a-Cas9:PCR扩增产物纯化后，使用Not I和Not I进行双酶切，酶切产物纯化回收后，连接至同样经过Not I和Asc I双酶切处理的pET28a-ccdB-CmR载体上，鉴定后得到重组质粒pET-28a-Cas9 ；
其中，所述pET-28-ccdB-CmR载体是以原核表达载体pET28a基础，在历III和通οI酶切位点之间插入Notl-ccdB-CmR-AscI序列得到；
所述鉴定为酶切鉴定和测序鉴定，所述酶切鉴定是分别使用Asc I或Afoi I单酶切和Asc I或Afoi I双酶切进行酶切鉴定；
53.Cas9蛋白的原核表达
531.将鉴定正确的重组质粒pET-28a-Cas9转化至BL21表达菌株中，经过阳性鉴定获得重组菌；
532.挑取重组菌的单克隆至LB培养基中37°C培养过夜，再按照1%的接种量，将过夜培养的菌种接种至新的LB培养基中37°C培养至0D600=1.0，冰水浴30min，加IPTG至终浓度为0.2mM，于15°C继续培养24h