专利名称：甲型h7n9流感病毒检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种H7N9病毒的检测方法及检测试剂盒。
背景技术：
2013年3-4月份，我国华东多地突发人感染禽流感疫情，多人致死，并逐渐扩散传播到多地。截至5月I日，已确诊H7N9禽流感病例127例，26人死亡，涉及北京、上海、江苏、浙江、安徽、江西、湖南、山东、福建和河南等省市。研究证实，该次疫情的致病源是一种新型的基因重组H7N9型禽流感病毒。目前均为散发病例，尚未发现病例间有流行病学关联。传染源目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。病毒经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染。现尚无人与人之间传播的确切证据。甲型H7N9流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属，病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80 120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(Hl H16)和9个N亚型(NI N9)。禽流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。可感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3，此次报道的为人感染H7N9禽流感病毒。该病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。该病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因分别为H7，N9型，但其他基因片段与H9N2流感病毒同源。此次人感染H7N9禽流感，目前尚无确切证据显示人类对H7N9禽流感病毒易感。现有确诊病例均为成人。根据流感 的潜伏期及现有H7N9禽流感病毒感染病例的调查结果，潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39°C以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。综上，亟需能够实现快速、有效且准确检测H7N9禽流感病毒的产品，以用于人感染H7N9禽流感疫情的防控和流行病学调查。流感病毒检测的“金标准”是病毒培养，但病毒培养操作复杂，实验室硬件要求高，周期长，阳性率低，限制了其应用。目前尚无成型的快速检测试剂盒，本文描述了一种H7N9病毒快速检测试剂盒。该试剂盒采用一步荧光RT-PCR方法，可对鼻咽或口咽洗液或拭子、支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰或胸水样本中甲型H7N9禽流感病毒(2013) RNA进行定性检测，可用于临床对甲型H7N9禽流感病毒(2013)感染的辅助诊断及药物治疗效果的监测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒及检测方法，以实现快速检测该病毒。本发明提供的一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒，是对甲型H7N9流感病毒MP、HA、NA、NP基因设计特异性引物和探针，在样本RNA核酸纯化之后采用荧光PCR对病毒RNA进行检测，以达到对流感病毒的确认、初步分型以及是否H7N9型的最终确定。该试剂盒包括特异性引物和探针，所用引物和探针核苷酸序列分别如下:甲型流感病毒通用型检测体系(5’ -3’ ):Infa-Fl(W):CGATCCTGTCACCTCTGACTAAG,Infa-Rl(W):AGGGCATTTTGGCAAAGC,Infa-FPl(W):FAM-TGCCCAGTGAGCGAGGACTGC-BHQI，RnaseP-Fl:CGCGGACAATGGCACTC,RnaseP-Rl:CGCACCAGCTCTTCCTCA,RnaseP-FPl:HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQI ；H7检测体系:rH7 (S) _F5: CATTCCGACAAATGCAGACAA,rH7(S) -R5: CACTCCTCTTTCAGTTAATGTGTTTACTTT,rH7(S)-FP5:FAM-ATCTGCCTCGGACATCATGCTGTGTC-BHQI，RnaseP-Fl:CGCGGACAATGGCACTC,
RnaseP-Rl:CGCACCAGCTCTTCCTCA,RnaseP-FPl:HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQI ；N9检测体系:rH7N9 (S) _F5: CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT，rH7N9(S) -R5: TGGCAYACACATTCAGATTCCT，rH7N9 (S) -FP5:FAM-AACACATGGGCCCGAAACATACTAAGAACA-BHQI，RnaseP-Fl:CGCGGACAATGGCACTC,RnaseP-Rl:CGCACCAGCTCTTCCTCA,RnaseP-FPl:HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQI ；NP (2013)检测体系:H7N9(NP)-FI: GAGGGAACACCAACCAACAGA，H7N9(NP)-Rl:GCCATAATGGTTGCTCTTTCG,H7N9 (NP) -FPI: FAM-CAGGTCAGCGTTCAACCCACTTTCTCAG-BHQI，RnaseP-Fl:CGCGGACAATGGCACTC,RnaseP-Rl:CGCACCAGCTCTTCCTCA,RnaseP-FPl:HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC_BHQ1。所述试剂盒的统一浓度和I人份测试用量统一标准为:Infa-Fl (W) IOpmoL/ U L 1.5 U L,Infa-Rl (W) IOpmoL/ U L 1.5 U L,Infa-FPl (W) 2.5pmoL/ U L 1.5 U L,rH7 (S) -F5 IOpmoL/ u L 1.0u L,rH7 (S) -R5 IOpmoL/ u L 1.0u L,rH7 (S) -FP5 2.5pmoL/ u L 1.5u L,rH7N9 (S) -F5 IOpmoL/ u L 2.0 u L,
rH7N9(S)-R5 IOpmoL/u L 2.0u L,rH7N9 (S) -FP5 2.5pmoL/ u L 2.0 u L,H7N9 (NP) -Fl IOpmoL/ U L 1.5u L,H7N9 (NP) -Rl IOpmoL/ U L 1.5u L,H7N9 (NP) -FPl 2.5pmoL/ u L 1.5u L,RnaseP-Fl IOpmoL/U L 0.5 U L,RnaseP-R IOpmoL/U L 0.5 U L,RnaseP-FPl 2.5pmoL/ U L 0.5 U L。采用上述试剂盒的检测方法为:(6)取样本:取鼻咽或口咽洗液或拭子、支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰或胸水；(7)样本处理:利用商品化的病毒RNA提取试剂盒处理样本和H7N9阳性质控品，根据提取试剂盒的要求，吸取待检样本至离心管，震荡混匀后进行提取操作；(8)体系配制:引物和探针由焦碳酸二乙酯水溶解至所需浓度；(9)检测:利用荧光定量PCR仪上机检测:(10)结果判定:·A、对于InfA结果为阳性，H7、N9和NP结果均为阴性，判定为甲型流感病毒非H7N9型；B、对于InfA、H7和N9结果为阳性，NP结果为阴性，判定为甲型流感病毒H7N9型；C、对于InfA、H7、N9和NP结果均为阳性，判定为甲型流感病毒H7N9(2013)，即2013年人感染H7N9型禽流感病毒。本发明提供了一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒和检测方法，是分别选取H7N9禽流感病毒MP、HA、NA、NP基因设计特异性引物和探针，在样本RNA核酸纯化之后采用荧光PCR对病毒RNA进行检测，以达到对流感病毒的确认、初步分型以及是否H7N9型的最终确定。本发明采用一步法RT-PCR技术与Taqman荧光探针技术相结合，病毒RNA模板首先反转录为cDNA，然后在Taq酶的作用下对靶区域进行扩增，同时利用Taqman荧光探针技术实时监测扩增产物的累积。Taqman探针带有一个荧光发光基团和一个荧光淬灭基团，完整的探针在特定光源激发下，发光基团所产生的荧光被淬灭基团全部吸收，样品无荧光。PCR过程中，Taq酶在延伸DNA链的同时，可通过自身的5’ 一3’核酸外切酶活性降解与模板结合的特异性荧光探针，使荧光报告基团与淬灭基团分离，分离后的荧光报告基团在特定光源激发下产生荧光。通过监测整个PCR过程荧光信号的变化，对未知模板进行定性分析。同时本发明采用人源化内标质控体系，用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标选择人源化的基因，针对人核糖核酸酶P (RNase P)设计的引物探针，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。本发明的试剂盒以及其检测方法，操作简单，出结果快，120分钟可以出结果，检测结果准确，为甲型H7N9流感病毒快速检测提供了可行手段，具有积极的社会价值。
图1为2013H7N9型禽流感病毒样本检测结果；
图2为非2013H7N9型禽流感病毒样本检测结果；图3为甲型H7N2型流感病毒样本检测结果；图4为甲型HlNl (2009)流感病毒，甲型H3N2流感病毒，季节性HlNl流感病毒样本，以及乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，副流感病毒，腺病毒，冠状病毒，肠道病毒EV71/CA16样本的检测结果；图5为试剂盒灵敏度评估(仅显示NP基因扩增曲线)。
具体实施例方式下面对本发明的试剂盒和检测方法作进一步说明。实施例1试剂盒包括四个指标，即一个样本含四管检测，其引物和探针的浓度，体积以及核苷酸序列如下:1、体系⑴:甲型流感病毒通用型检测甲型流感病毒通用型检测引物和探针具体组成如表I表I通用型检测引物及探针浓度和体积
权利要求
1.一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒，包括特异性引物和探针，所用引物和探针核苷酸序列如下: 甲型流感病毒通用型检测体系(5’ -3’ ):Infa-Fl(W):CGATCCTGTCACCTCTGACTAAG,Infa-Rl(W):AGGGCATTTTGGCAAAGC,Infa-FPl(W):FAM-TGCCCAGTGAGCGAGGACTGC-BHQ1,RnaseP-Fl:CGCGGACAATGGCACTC,RnaseP-Rl:CGCACCAGCTCTTCCTCA,RnaseP-FPl:HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC_BHQ1 ； H7检测体系:rH7(S) -F5:CATTCCGACAAATGCAGACAA,rH7(S) -R5:CACTCCTCTTTCAGTTAATGTGTTTACTTT,rH7(S) -FP5:FAM-ATCTGCCTCGGACATCATGCTGTGTC_BHQ1，RnaseP-Fl:CGCGGACAATGGCACTC,RnaseP-Rl:CGCACCAGCTCTTCCTCA,RnaseP-FPl:HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC_BHQ1 ； N9检测体系:rH7N9(S) -F5:CAGAAGGCCTGTTGCAGAAAT,rH7N9(S)-R5:TGGCAYACACATTCAGATTCCT,rH7N9(S) -FP5:FAM-AACACATGGGCCCGAAACATACTAAGAACA_BHQ1，RnaseP-Fl:CGCGGACAATGGCACTC,RnaseP-Rl:CGCACCAGCTCTTCCTCA,RnaseP-FPl:HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC_BHQ1 ； NP (2013)检测体系:H7N9(NP)-Fl:GAGGGAACACCAACCAACAGA,H7N9(NP)-Rl:GCCATAATGGTTGCTCTTTCG,H7N9(NP)-FPl:FAM-CAGGTCAGCGTTCAACCCACTTTCTCAG-BHQ1，RnaseP-Fl:CGCGGACAATGGCACTC,RnaseP-Rl:CGCACCAGCTCTTCCTCA,RnaseP-FPl:HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC_BHQ1。
2.如权利要求1所述 试剂盒，其特征在于所述试剂盒的浓度和I人份测试用量标准为:Infa-Fl (W) IOpmoL/ u L 1.5u L,Infa-Rl (W) IOpmoL/ u L 1.5u L,Infa-FPl (W) 2.5pmoL/ u L 1.5u L,rH7 (S) -F5 I OpmoL/ u L 1.0u L,rH7 (S) -R5 I OpmoL/ u L 1.0u L,rH7 (S) -FP5 2.5pmoL/ u L 1.5u L,rH7N9(S)-F5 IOpmoL/u L 2.0u L,rH7N9(S)-R5 IOpmoL/u L 2.0u L,rH7N9(S)-FP5 2.5pmoL/u L 2.0u L,H7N9 (NP) -Fl IOpmoL/ u L 1.5u L,H7N9 (NP) -Rl IOpmoL/ u L 1.5u L,H7N9 (NP) -FPl 2.5pmoL/ u L 1.5u L,RnaseP-Fl IOpmoL/u L 0.5 u L,RnaseP-R IOpmoL/u L 0.5 u L,RnaseP-FPl 2.5pmoL/u L 0.5 u L0
3.一种采用权利要求1或2所述试剂盒进行甲型H7N9病毒检测方法，检测方法为: (1)取样本:取鼻咽或口咽洗液或拭子、支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰或胸水； (2)样本处理:利用商品化的病毒RNA提取试剂盒处理样本和H7N9阳性质控品，根据提取试剂盒的要求 ，吸取待检样本至离心管，震荡混匀后进行提取操作； (3)体系配制:引物和探针由焦碳酸二乙酯水溶解至所需浓度； (4)检测:利用荧光定量PCR仪上机检测: (5)结果判定: A、对于InfA结果为阳性，H7、N9和NP结果均为阴性，判定为甲型流感病毒非H7N9型； B、对于InfA、H7和N9结果为阳性，NP结果为阴性，判定为甲型流感病毒H7N9型； C、对于InfA、H7、N9和NP结果均为阳性，判定为甲型流感病毒H7N9(2013)。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于在利用荧光定量PCR仪上机检测时PCR反应条件为: 在逆转录阶段，反应温度为50°C，时间为20分，循环I次； 在预变性阶段，反应温度为95°C，时间为3分，循环I次； 在变性阶段，反应温度为94°C，时间为15秒，循环45次； 在退火、延伸、荧光信号采集阶段，反应温度为60°C，时间为35秒，循环45次。
全文摘要
本发明公开了一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒及检测方法，是分别选取H7N9禽流感病毒MP、HA、NA、NP基因设计特异性引物和探针，在样本RNA核酸纯化之后采用荧光RT-PCR技术对病毒RNA进行定性检测，以达到对流感病毒的确认、初步分型以及是否H7N9型的最终确定。本发明的试剂盒以及其检测方法，操作简单，出结果快，检测结果准确，为甲型H7N9禽流感病毒快速检测提供了可行手段，具有积极的社会价值。
文档编号C12Q1/68GK103243181SQ201310176109
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月14日 优先权日2013年5月14日
发明者叶锋, 刘明坤, 迟磊, 宋玉亮 申请人:北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司