专利名称：豚鼠切齿中dspp基因的实时荧光定量pcr的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光定量PCR的检测方法，具体说是一种豚鼠切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR的检测方法。
背景技术：
牙本质诞憐蛋白基因(Dentin Sialophosphoprotein, DSPP)编码牙本质诞蛋白(Dentin sialoprotein, DSP)和牙本质憐蛋白(Dentin phosphoprotein, DPP)两个蛋白质。二者是同一个转录本的表达产物经切割产生的大小不同、生物学作用各异的两个片段。DPP和DSP作为成牙本质细胞分泌的重要的非胶原蛋白，它们参与上皮间充质相互作用，促进成牙本质细胞定向分化，并通过启动晶体成核，调节晶体形态和生长速度，对抗蛋白水解酶的降解功能等，从而保证牙本质基质钙化。DSP是一种糖蛋白，约占牙本质非胶原蛋白总量的5% 8%，在前期牙本质向牙本质的转化过程中起着重要作用。DPP是牙齿中最主要的非胶原蛋白，约占牙本质所有非胶原有机成分的50%，在成牙本质细胞中特异表达；一般认为DPP定位于原胶原分子间，DPP富含天冬氨酸和丝氨酸，具有高度重复的Asp-Ser-Ser模体，作为羟基磷灰石晶核，参与牙齿矿化。DSPP突变可导致该基因编码蛋白功能残缺，使得牙齿矿化受到影响，牙本质发育不全。定量检测DSPP基因的表达对牙本质发育不全具有重要的临床诊断意义。豚鼠切齿具有执行切断食物的功能，组织异常坚硬，细胞含量极少，有机物成分含量不足20%，核酸丰度值低，核酸提取较为困难。目前尚未见有豚鼠切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR检测方法的报道。
发明内容
本发明的 目的在于克服豚鼠切齿组织异常坚硬、核酸丰度值较低、细胞含量极少，有机物成分含量低等困难，提供一种豚鼠切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR的检测方法，它操作简单，可进行批量检测。本检测方法由如下步骤组成:A、样本的准备:快速拔取牙齿，除净附着的牙龈组织，以4°C灭菌生理盐水反复冲洗，用灭菌滤纸吸干，迅速将牙齿用灭菌咬骨钳截成小块，放入液氮中进行低温冷冻脆化处理24 48 h ；B、设计引物:根据Genbank中豚鼠的P-actin基因和大鼠的DSPP基因的mRNA序列设计相应的引物，e-actin基因扩增时使用的引物为:上游引物:5’ -AGCAGATGTGGATCAGCAAG-3 ’下游引物:5’ -AAGGGTGTAACGCAGCAAAG-3 ’DSPP基因扩增时使用的引物为:上游引物:5’ -GTTAGTGCCGCTGGAGAGAG-3 ’
下游引物:5’ -ATCGTCGTTAGTGGCGTTG-3 ’C、提取总RNA:从液氮中取牙齿小块150 200 mg,进行液氮研磨,一般研磨14 16 min ;收集研磨好的牙齿组织粉末，加入到预先加有I ml裂解液的预冷5 ml离心管中，在冰浴下以转速3000 r/min进行间歇性匀浆2 3 min ;转入2.0 ml的离心管中，25°C温浴静置5 min ;加入0.2ml氯仿，在旋涡振荡器上旋涡振荡15 s，25°C温浴静置3 min ;在4°〇下以12000 g离心15 min ;收集上清，加入0.5 ml异丙醇，25°C温浴静置10 min;在4°C下以12000 g离心10 min ;弃去上层悬液，加入I ml 75%乙醇溶液，旋涡振荡洗脱，在4°C下以7500 g离心5 min ;弃上清，干燥RNA沉淀5 10 min,加入10 W的0.1%DEPC处理水，于55 60°C下进行加热10 min，分装后保存于一 80°C ；D、反应体系的建立=RT-PCR反应体系组成包括:总RNA模板、上下游引物、Buffer、反转录酶、荧光染料；建立20 m的反应体系；E、反应条件的优化:参照引物的TM值，通过扩增曲线和熔解曲线分析，确定最佳的引物浓度、退火温度和时间以及总RNA模板添加量；本发明采用的反应条件为:95°C预变性10 s，95°C变性5 s，58°C退火20 s，72°C延伸6 s ;共40个循环；F、标准曲线的制作:用RNase Free超纯水将总RNA稀释到0.2 U g/ul，作为浓度最高的模板(2°，I号)。然后取11个容量为150 的EP联管(2-12号)，分别加入10 u IRNase Free超纯水。从I号中取10 U I加入到2号管中，稀释倍数为2，依次类推；将I号逐级2倍稀释成用于标准曲线的制作；G、荧光定量分析:针对看家基因和目的基因，每个样本在每次反应中，要至少做3次重复，取平均值，根据Ct值，从标准曲线上读取相应的模板浓度；样本目的基因的相对表达量等于目的基因的表达量均值除以看家基因表达量均值。本发明的优点在于:提供一种豚鼠切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR检测方法。它完成了豚鼠切齿的总RNA提取，特异性引物的设计及DSPP基因的实时荧光定量PCR检测过程，可用于批量进行切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR检测。本发明具有操作简单、污染小、敏感性高、特异性强、重复性好、精确度高、可以定量等优点。
图1为本发明的技术流程图；图2为本发明的实施例中标准曲线制作的模板倍比稀释示意图；图3为本发明的实施例中实时荧光定量PCR检测DSPP基因的标准曲线图；图4为本发明的实施例中实时荧光定量PCR检测DSPP基因的扩增曲线图；图5为本发明的实施例中实时荧光定量PCR检测DSPP基因的熔解曲线图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步说明。由图1可以看到，本发明的工艺步骤。由图2可以看到，本发明标准曲线制作的模板倍比稀释步骤。由图3可以看到，有七个点均匀地落在DSPP基因的标准曲线上，相关系数RSq彡0.99 ;扩增 效率Eff在正常范围90% 110%以内。
由图4可以看到，Ct值随模板浓度的倍比稀释，均匀的变化；随循环数的增加，荧光量逐渐减少，最后进入平台期；适用于相对定量分析。由图5可以看到，DSPP基因熔解曲线的Tm值非常均一，在81.8 82.2°C之间；熔解曲线上只有一个明显的峰，表明在荧光定量PCR扩增过程中，没有产生非特异性扩增产物及引物二聚体，荧光强度均来自于特异性的扩增产物。实施例:A、样本的准备:所有涉及器具及耗材均做灭菌处理及去RNase处理；迅速拔取豚鼠上下2对切齿，尽可能地用手术刀除净附着的牙龈组织，以4°C灭菌生理盐水反复冲洗，用灭菌滤纸吸干；迅速将牙齿用灭菌咬骨钳截成小块，放入液氮中进行低温冷冻脆化处理48 h ；B、设计引物:根据 Genbank 中膝鼠的 0-actin 基因(accession N0.AF508792)和大鼠的DSPP基因(accession N0.NM_012790)的mRNA序列设计相应的引物。@-actin基因扩增时使用的引物为:上游引物:5’ -GGATGCAGAAGGAGATCACG-3 ’下游引物:5，-ACATCTGCTGGAAGGTGGAG-3’DSPP基因扩增时使用的引物为:上游引物:5’ -CGAGTCGATAGCCGTAGGAG-3 ’下游引物:5，-GTTTCTACGTCCTCGCGTTC-3，C、提取总RNA:从液氮中取出牙齿小块200 mg，放入预先盛有液氮的研钵中，进行充分研磨；研磨过程中要及时补充液氮；研磨得越细越好，研磨约15 min左右；收集研磨好的牙齿粉末，加入到预先加有I ml裂解液的预冷5 ml离心管中，在冰浴下以转速3000 r/min进行间歇性匀浆2 min;将匀浆完成的裂解液混合物，转入2.0 ml的离心管中，25°C温浴静置5 min，以使核蛋白体完全分解；加入0.2ml氯仿，旋涡振荡15 s，25°C温浴静置3min;在4°C下以12000 g离心15 min，使混合物分离成三层；收集上层无色的水样层至一新的离心管中，加入0.5 ml异丙醇，用手摇动混匀，25°C温浴静置10 min ;在4°C下以12000g离心10 min ;弃去上层悬液，加入I ml 75%乙醇溶液，旋涡振荡洗脱，在4°C下以7500 g离心5 min ;弃上清,在超净工作台中干燥RNA沉淀8 min,加入10 的0.1%DEPC处理水，于58°C下进行加热10 min，分装后保存于一 80°C ；提取的总RNA，经核酸测定仪检测，0D260/0D280值为2.09 土 0.05。D、反应体系的建立=RT-PCR反应体系组成包括:总RNA模板、上下游引物、Buffer、反转录酶、荧光染料等。本发明采用20 W的反应体系为:2XRT-PCR Buffer 10 U I ；TaKaRa Ex Taq HS (5U/U I) 0.4u I ;反转录酶混合物0.4 ii I ；R0X Reference Dye(50X )0.4 ill;上游引物(IOuM) 0.3 ill ;下游引物(IOiiM) 0.3 ill ;总 RNA 模板 2.0iU ; RNaseFree 超纯水 6.2 ;E、反应条件的优化:参照引物的TM值，通过扩增曲线和熔解曲线分析，确定最佳的引物浓度、退火温度和时间以及总RNA模板添加量。本发明采用的反应条件为:42°C反转录5 min，95°C预变性10 s，95°C变性5 s，58°C退火20 s，72°C延伸6 s ;共40个循环；F、标准曲线的制作:用RNase Free超纯水将总RNA稀释到0.2 U g/ul，作为浓度最高的模板(2°，I号)。然后取11个容量 为150 的EP联管(2-12号)，分别加入10 u IRNase Free超纯水。从I号中取10 U I加入到2号管中，稀释倍数为2，依次类推；将I号逐级2倍稀释成、2_n，制作标准曲线；P-actin基因的标准曲线回归方程为:Y=_3.576XL0G(X)+18.32 ;相关系数为:RSq=0.999 ;扩增效率为:Eff=90.4%。DSPP基因的标准曲线回归方程为:Y=-3.219 X LOG (X) +28.41 ;相关系数为:RSq=0.993 ;扩增效率为:Eff=104.5%相关系数RSq≥0.99 ;扩增效率Eff在正常范围90% 110%以内；G、荧光定量分析:针对P-actin基因和DSPP基因，每个样本在每次反应中，要至少做3次重复，取平均值；并生成良好的扩增曲线和熔解曲线。豚鼠P-actin基因及DSPP基因的扩增产物的Tm值都非常均一，P-actin基因在83.6 83.9°C之间，DSPP基因在81.8 82.2°C之间；熔解曲线上只有一个明显的峰，表明在荧光定量PCR扩增过程中，没有产生非特异性扩增及引物二聚体，荧光强度均来自于特异性的扩增产物。根据Ct值，从标准曲线上读取相应的模板浓度；样本DSPP基因的相对表达量等于DSPP基因的表达量均值除以P-actin基因 表达量均值。
权利要求
1.一种豚鼠切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR的检测方法，其特征在于:它由如下步骤组成: A、样本的准备:快速拔取牙齿，除净附着的牙龈组织，4°C灭菌生理盐水反复冲洗，用灭菌滤纸吸干，迅速将牙齿用灭菌咬骨钳截成小块，放入液氮中进行低温冷冻脆化处理24 48 h ； B、设计引物:根据Genbank中豚鼠的P-actin基因和大鼠的DSPP基因的mRNA序列设计相应的引物， 3-actin基因扩增时使用的引物为: 上游引物:5’ -AGCAGATGTGGATCAGCAAG-3， 下游引物:5’ -AAGGGTGTAACGCAGCAAAG-3， DSPP基因扩增时使用的引物为: 上游引物:5’ -GTTAGTGCCGCTGGAGAGAG-3’ 下游引物:5’ -ATCGTCGTTAGTGGCGTTG-3， C、提取总RNA:从液氮中取牙齿小块150 200 mg,进行液氮研磨,一般研磨14 16min ;收集研磨好的牙齿组织粉末，加入到预先加有I ml裂解液的预冷5 ml离心管中，在冰浴下以转速3000 r/min进行间歇性匀浆2 3 min ;转入.2.0 ml的离心管中，25°C温浴静置5 min ;加入0.2ml氯仿，在旋涡振荡器上旋涡振荡15 s，25°C温浴静置3 min ;在4°C下以12000 g离心15 min ;收集上清，加入0.5 ml异丙醇25°C温浴静置10 min;在4°C下以12000 g离心10 min ;弃去上层悬液，加入I ml 75%乙醇溶液，旋涡振荡洗脱，在4°C下以7500 g离心5 min ;弃上清，干燥RNA沉淀5 10 min,10 W的0.1%DEPC处理水，于55 60°C下进行加热10 min，分装后保存于一 80°C ； D、反应体系的建立=RT-PCR反应体系组成包括:总RNA模板、上下游引物、Buffer、反转录酶、荧光染料；建立20 W的反应体系； E、反应条件的优化:参照引物的TM值，通过扩增曲线和熔解曲线分析，确定最佳的引物浓度、退火温度和时间以及总RNA模板添加量；本发明采用的反应条件为:95°C预变性10s，95°C变性5 s，58°C退火20 s，72°C延伸6 s ;共40个循环； F、标准曲线的制作:用RNaseFree超纯水将总RNA稀释到0.2 u g/U 1，作为浓度最高的模板(2°，1号)。然后取11个容量为150 的EP联管(212号)，分别加入10 u IRNase Free超纯水。从I号中取10 U I加入到2号管中，稀释倍数为2，依次类推；将I号逐级2倍稀释成用于标准曲线的制作； G、荧 光定量分析:针对看家基因和目的基因，每个样本在每次反应中，要至少做3次重复，取平均值，根据Ct值，从标准曲线上读取相应的模板浓度；样本目的基因的相对表达量等于目的基因的表达量均值除以看家基因表达量均值。
全文摘要
本发明公开了一种豚鼠切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR的检测方法，它由如下步骤组成A、样本的准备拔取牙齿，低温冷冻脆化处理24～48 h；B、设计引物，C、提取总RNAD、反应体系的建立，E、反应条件的优化，F、标准曲线的制作，G、荧光定量分析。本方法可用于批量进行切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR检测。本发明具有操作简单、污染小、敏感性高、特异性强、重复性好、精确度高的优点。
文档编号C12Q1/68GK103233076SQ20131017404
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月13日 优先权日2013年5月13日
发明者韩天龙, 李志明, 王敏, 赵瑞霞, 黄国成, 李清泉 申请人:赤峰市农牧科学研究院