专利名称：一种玉米FK506结合蛋白编码基因ZmFKBP20-1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种玉米FK506结合蛋白编码基因ZmFKBP20-l及其应用，属于分子生物学和生物技术技术领域。
背景技术：
土壤干旱是世界范围内限制作物产量的主要环境因素之一，每年全球干旱导致的粮食减产超过其他所有环境因素所造成的减产的总和。地球上约1/3的土地面积属于缺水的干旱和半干早区域，半湿润、甚至湿润地区也常会有周期性的、季节性的或临时性的干旱。玉米集粮食、饲料和工业原料于一体，就其总产和种植面积而言，已跃居我国第一大粮食作物，在国民经济的发展中占有举足轻重的地位。玉米的生产受干旱的影响尤其明显，研究玉米对干旱的适应和调节机制，对于培育抗旱玉米品种具有重要意义。干旱胁迫引起的植物各种生理生化变化是复杂的，干旱对植物造成的伤害也是多方面的。植物不能像动物那样自由逃避，因而在长期进化过程中演变产生了其特有的机制来响应环境中的这种胁迫。从遗传学角度来看，作物的抗旱性通常是由多基因控制的数量形状。从生理学角度来看，作物的抗旱性通常是多个代谢过程共同作用的结果。FK506结合蛋白(FKBP)是一种在生物体中广泛存在、高度保守的组成型蛋白质(Michnick et al.，1991)。自 1989年首次发现FKBP 以来(Harding M.ff., Galat A., UehlingD.E.,Schreiber SL.A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis—transpeptidyl-prolyl isomerase.Nature (1989) 341, 758-760),已经陆续找到了许多种 FKBP,在某些种属中其含量可占细胞内活性蛋白总量的0.2% 0.5% (陈鹏，陈崇宏，程元荣。FKBPs研究进展[J]。海峡药学(2004) 16(3):6-9)。FKBP具有肽酰脯氨酸顺/反异构酶(PPIase)活性，作为分子伴侣参与蛋白质的折叠、装配运输过程，另外参与细胞凋亡、信号转导等过程。近几年研究发现FKBP可能在植物发育和抗逆反应等过程中发挥着重要的作用(Geisler M., Bailly A.Tete`-a-tete: the function of FKBPs in plant development.Trends Plant Sci (2007) 12, 465-473.)，因此明确它们的基因功能具有非常重要的意义。之前人们已经对拟南芥(HeZ., Li L., Luan S.Tmmunophi Iins andparvulins.Superfamily of peptidyl prolyl isomerases in Arabidopsis.Plant Physiol(2004) 134, 1248-1267.)和水稻(Gollan P.J., Bhave M.Genome-wideanalysis of genes encoding FK506_binding proteins in rice.Plant MolecularBiology (2010) 72, 1-16.)的FKBP基因家族进行了系统的生物信息学分析，拟南芥中发现23个FKBP基因，水稻中有29个。在植物中(拟南芥、水稻、玉米、小麦、番茄)FKBP家族的一些成员已陆续被克隆，它们的功能研究也取得一定进展。植物FKBP在细胞内参与的信号转导可能与许多环境因子如光、胁迫因子、病毒侵害等有关。在受到逆境胁迫的情况下，植物FKBP基因可能起到调控作用。小麦TaFKBP73和TaFKBP77以及拟南芥AtFKBP62和AtFKBP65基因目前研究比较深入，实验表明这四个基因的表达均可受到外界伤害、NaCl、丙二醛的诱导(丙二醛可诱导非生物胁迫相关基因的表达)。其中TaFKBP77和AtFKBP65的表达还受到热诱导，而其余二者不具备该特性。AtFKBP62和AtFKBP65为组织特异表达，热激蛋白HSP90可以与AtFKBP62中的TPR结构域结合，但却不与AtFKBP65结合。Magiri (2006)等研究发现水稻0sFKBP64，OsFKBP65和OsFKBP75的表达受42°C热激所诱导，并且表达具有组织特异性，从而可以推测水稻的三种FKBPs可能为三种热激蛋白。另外，植物FKBP还参与调控植物的生长发育过程。在小麦中超表达TaFKBP73和TaFKBP77可以改变转基因小麦株系的粒重及籽粒中淀粉酶的活性。拟南芥AtFKBP72 (PASl)可以调控细胞的增殖，在PASl突变体中，叶片以及分生组织的细胞分裂呈现不均等状态。拟南芥AtFKBP42被证明调控生长素的运输，它的突变可以产生矮小和螺旋生长两种突变体表型。FKBP12可以和转录因子HAP5互作，从而参与调控花粉管的生长方向(Yu Y，Li Y，Huang G, Meng Z, Zhang D, Wei J, YanK，Zheng C，Zhang L.PwHAP5, a CCAAT-binding transcription factor, interacts withPwFKBPI2and plays a role in pollen tube growth orientation in Picea wilsoni1.J Exp Bot.(2011)62,4805-4817.)。斑茅FKBP12基因PEG处理后表达量显著增加，推测该基因参与抗旱调控(张木清，饶进，吴杨，陈如凯。斑茅FKBP12基因的克隆及其在甘蔗抗旱上的表达。全国植物分子育种研讨会摘要集(2009)P118)。在重要和本科粮食作物玉米中，FKBP研究甚少。Hueros等(1998)报道ZmFKBP66存在于胞质及细胞核中，并且可以与I丐调蛋白结合，但具体功能未能证明(Hueros G, Rahfeld J, Salamini F, ThompsonR.A maize FK506-sensitive immunophiI in, mzFKBP-66, is a peptidylprolinecis—trans—isomerase that interacts with calmodulin and a 36—kDa cytoplasmicprotein.Planta(1998)205, 121-131.)。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种玉米FK506结合蛋白编码基因ZmFKBP20_l
及其应用。一种玉米FK506结合蛋白编码基因ZmFKBP20-l，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。本发明从400mM甘露醇处理的玉米幼苗和正常生长的玉米幼苗叶片中提取总RNA,然后将2微克总RNA反转录成cDNA，构建玉米干旱胁迫cDNA文库和正常玉米cDNA文库。使用反相Northern差异筛选法,获得一条全长的cDNA为859bp,其中开放阅读框部分为561bp，由此推得为具有186个氨基酸的一段序列。将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与已发表的高粱、水稻和拟南芥的FK506结合蛋白的氨基酸同源性为94%，表明经过上述筛选步骤得到了编码FK506结合蛋白的基因一种玉米FK506结合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。一种插入上述SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的载体。—种重组细胞,插入了上述SEQ ID N0.1所示核苷酸序列或含有SEQ ID N0.1序列的载体。上述编码基因ZmFKBP20_l、载体或重组细胞在经济作物生产改良中的应用。本发明从玉米中分离出编码某一 FK506结合蛋白(ZmFKBP20-l)的全长cDNA,连接到表达载体上，利用农杆菌侵染法转化拟南芥，该基因能够提高转基因拟南芥在种子萌发期和幼苗发育早期及壮苗期的抗旱性。
有益效果
本发明从玉米中克隆了编码基因ZmFKBP20_l，并验证了该基因具有在种子萌发期、幼苗发育早期及成苗期调节植株抗旱功能的作用，经试验，通过过量表达该基因，可以获得比野生型植株产量更高的转基因作物(如图1-5所示)。本发明的基因可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源。
图1是转基因拟南芥种子与野生型拟南芥种子在含有IOOmM甘露醇的MS培养基上的萌发情况；其中:WT代表野生型拟南芥种子，T代表转基因拟南芥种子。图2是转基因拟南芥种子与野生型拟南芥种子在不同浓度甘露醇处理下种子萌发率统计情况；其中:横坐标表示甘露醇浓度梯度，纵坐标表示种子萌发率；WT代表野生型拟南芥种子，T代表转基因拟南芥种子。图3是转基因拟南芥幼苗 与野生型拟南芥幼苗在含有不同浓度甘露醇的MS培养基上的生长情况；其中:WT代表野生型拟南芥，T代表转基因拟南芥。图4是转基因拟南芥与野生型拟南芥在干旱处理下平均根生长量；其中:横坐标表示甘露醇浓度梯度，纵坐标表示平均根生长量；WT代表野生型拟南芥，T代表转基因拟南芥。图5是转基因拟南芥壮苗与对照在干旱处理下的生长情况；其中:左列表示正常生长条件，右列表示失水12天的生长条件；WT代表野生型拟南芥，T代表转基因拟南芥。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。生物材料来源:玉米B73购自中国农业大学国际玉米改良中心；大肠杆菌(E.coli)DH5a和 BM25.8、质粒 pTriplEx2、Pmdl8_T 均购自 Promega 公司；载体PBIl2I 购自 Clontech 公司；试剂来源:DNA凝胶回收试剂盒、DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、ExTaq酶、DNA BluntingKit、DNAMarkerDL2000+15000购自宝生物大连有限公司(Takara产品)；TRIzol 试剂(N0.15596-026)购自 Life Technologies 公司。设备说明PCR反应使用 2720 Thermal Cycler 基因扩增仪,购自 Applied Biosystems 公司；琼脂糖凝胶电泳使用UVP Gel Documentation凝胶分析系统,购自Gene公司；琼脂糖凝胶电泳使用DYY-8C型电泳仪，购自北京六一仪器公司。
实施例1:玉米FK506结合蛋白编码基因ZmFKBP20_l的获得1.玉米幼苗的处理:玉米B73生长10天的幼苗，400mM甘露醇处理18小时，收集叶片；2.总 RNA 的提取:采用 RNAeasy plant mini kit(promoga 公司产品)提取总 RNA ;3.使用 SMART cDNA Library Construction Kit (购自 Clontech 公司)构建玉米干旱胁迫cDNA文库以及对照cDNA文库；4.使用反相Northern差异筛选法筛选有表达差异的cDNA片断；具体步骤参照《植物基因工程原理与技术》中(王关林，方宏笃著，科学出版社，1998)。5.将携带有表达差异的cDNA片断的pTriplEx2载体转入大肠杆菌BM25.8 ;具体步骤参照《植物基因工程原理与技术》中(王关林，方宏笃著，科学出版社，1998)。6.序列测定:由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，获得一条859bp的cDNA片断，即为玉米FK506结合蛋白编码基因ZmFKBP20_l，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其中开放阅读框部分为561bp，由此推得为具有186个氨基酸的一段序列。7.同源检索:利用BLAST软件将分离出的序列与Genbank中的序列进行比较，确定它属于玉米FK506结合蛋白基因。实施例2:转基因 拟南芥的获得及其检测重组表达载体的构建1.取2iil上述实施例1获得的玉米FK506结合蛋白编码基因ZmFKBP20_l与pMD18_T载体进行连接,操作步骤按Promega公司产品pMD18_T Vector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5 a菌株，转接于表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(IOOii g/ml)的LB平板上培养过夜。挑取白色菌落,在LB液体培养基中培养过夜并进行菌落PCR鉴定；同时碱法提取质粒DNA进行序列测定，制得重组PMD18-T 载体；2.用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI酶切重组pMD18_T载体，然后与经限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI酶切的载体PBI121连接。连接产物转化DH5 a细胞，然后在含卡那霉素(50 u g/ml)的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析；制得重组表达载体PBI121-ZmFKBP20-l。转基因拟南芥的获得将重组表达载体PBI121-ZmFKBP20_l转化农杆菌GV3101的感受态细胞，挑取转入重组表达载体PBI121-ZmFKBP20-l的农杆菌的单克隆接种于含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，28°C振荡培养两天。将发酵液3000rpm/min离心5分钟，所得农杆菌沉淀用含5wt%蔗糖和0.03wt%SilwetL-77的侵染液悬浮。(具体过程也可参见:程振东，卫志明，许智宏。根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生。植物学报，1994，36 (9):657-663)采用沾花浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Col-O)(可以购自美国拟南芥生物资源中心，ABRC, http://www.biosc1.0hio-state.edu/pcmb/Facilities/abrc/abrchome.htm),收获该当代转基因拟南芥植株所结的种子(T1代),在含有50mg/LKan (卡那霉素)的MS培养基筛选萌发的种子。将萌发的T1代幼苗移到培养土中，收获种子(T2代)，然后经相同的筛选过程得到纯合的T3代转PBI121-ZmFKBP20-l的转基因拟南芥种子。最后将T3代转基因拟南芥种子直接播种到培养土中，长出的T3代转基因拟南芥植株在长日照条件下生长两周左右开花。对T3代转基因拟南芥进行转基因植株鉴定，包括:抗性培养基初步筛选、PCR扩增进一步筛选阳性植株、West-blotting鉴定阳性植株；最终从通过West-blotting鉴定得到阳性植株中选出条带清晰的株系，收获其种子，制得转基因拟南芥种子，进行抗逆表型鉴定。PCR扩增进一步筛选阳性植株的PCR引物如下:引物1:5 ‘-ATGGAAGAGATGATAGATC-3’ ；引物2:5 ‘-CTATTTTCCCTTTCCCTTC-3，。转基因拟南芥抗旱表型鉴定本实验设置以下两个对照:野生型对照:未转入任何质粒的野生型拟南芥(Col-O)；空载体对照:按照获得T3代转入重组表达载体PBI121-ZmFKBP20_l的转基因拟南芥的方法，将空载体PBI121转入野生型拟南芥中，然后进行继代培养得到T3代转PBI121的转基因拟南芥，制得空载体对照种子。1、甘露醇(Mannitol)模拟干旱胁迫条件下的种子萌发实验取野生型拟南芥种子、空载体对照种子和转基因拟南芥种子，在MS培养基上进行种子萌发实验，其中培养基中含不同浓度甘露醇(分别为100mM、200mM、300mM和400mM)，实验条件是光周期为16小时光照，8`小时黑暗；光强为300-400umol/M2/S ;光照条件下的温度为22-24°C，相对湿度为70-90% ;黑暗条件下的温度为18_20°C，相对湿度大于90%。在第7天统计种子萌发率，实验重复3次，测定结果如图1和图2所示(WT表示野生型拟南芥种子，T表示转基因拟南芥种子；空载体对照种子和野生型拟南芥种子的表型一致，故图中未显示空载体对照)，转基因拟南芥种子在培养基中甘露醇浓度为100mM、200mM、300mM和400mM时的萌发率显著高于野生型拟南芥种子和空载体对照种子的萌发率。2、转基因拟南芥幼苗期干旱表型鉴定将在MS平板上正常发芽的子叶刚展平的生长一致的幼苗在无菌条件下移至含有IOOmM,200mM和300mM甘露醇的MS平板上，置培养间，竖直放置平板，实验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400umol/M2/S ;光照条件下的温度为22_24°C，相对湿度为70-90% ;黑暗条件下的温度为18-20°C，相对湿度大于90%。培养I周后拍照并测量根长，实验重复3次。测定结果如图3和图4所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转基因拟南芥；空载体对照和野生型对照的表型一致，故图中未显示空载体对照)，转基因拟南芥的幼苗在培养基中甘露醇浓度为100mM、200mM、300mM时的生长情况显著好于野生型拟南芥和空载体对照。3、转基因拟南芥成苗期干旱表型鉴定将在基质中正常生长且生长一致的转基因拟南芥株系与野生型拟南芥成苗共同进行失水干旱处理。如图5所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转基因拟南芥；空载体对照和野生型拟南芥的表型一致，故图中未显示空载体对照)，在正常的生长条件下，野生型与超表达株系生长没有差异。经过12天的自然失水处理，野生型拟南芥和转基因拟南芥的成苗都表现出了干旱抗性减弱的表型:野生型拟南芥株系普遍萎蔫较快，成活率低。相比之下，转基因拟南芥萎蔫较慢，成活率高。与野生型相比，转基因拟南芥株系的抗旱能力明显提闻。实施例中所采用的PCR、酶切、连接、转化等基因工程基本操作方法如无特殊说明均可按记载于《分子克隆实验指南第三版》中((美)J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版)，和《植物基因工程原理与技术》中(王关林，方宏笃著，科学出版社，1998)记载的方法操 作。
权利要求
1.一种玉米FK506结合蛋白编码基因ZmFKBP20-l，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.—种玉米FK506结合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.—种插入了 SEQ ID N0.1所不核苷酸序列的载体。
4.一种重组细胞，插入了 SEQ ID N0.1所示核苷酸序列或含有SEQ ID N0.1序列的载体。
5.权利要求1所述编码基因ZmFKBP20-l、权利要求3所述载体或权利要求4所述重组细胞在经济作物生产改良中 的应用。
全文摘要
本发明涉及一种玉米FK506结合蛋白编码基因ZmFKBP20-1及其应用。一种玉米FK506结合蛋白编码基因ZmFKBP20-1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供一种玉米FK506结合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从玉米中克隆了编码基因ZmFKBP20-1，并验证了该基因具有在种子萌发期、幼苗发育早期及成苗期调节植株抗旱功能的作用，经试验，通过过量表达该基因，可以获得比野生型植株产量更高的转基因作物。本发明的基因可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源。
文档编号C12N15/63GK103243109SQ20131017543
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月13日 优先权日2013年5月13日
发明者于彦丽, 孟昭东, 李艳娇, 张发军, 孙琦, 李文才, 庞凯元 申请人:山东省农业科学院玉米研究所