用甲基营养酵母生产人淀粉样蛋白Aβ_1-42的方法

专利名称：用甲基营养酵母生产人淀粉样蛋白Aβ_1-42的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质的生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中 表达重组人淀粉样蛋白(P-amyloidprotein, ApM2)，以及优化的大规模工业化发 酵生产重组人淀粉样蛋白A(3m2的方法。
背景技术：
老年痴呆症(Alzheimer's disease, AD)，由德国学者Alosi Alzheimer于1907年
首次提出，现已受到人们越来越多的重视。AD的主要病理特征是细胞外老年斑 的形成和细胞内神经纤维缠结的集聚。虽然AD的发病机制至今未明，但目前 普遍认为，老年斑的主要组成成分APw2具神经元毒性，是AD的主要致病原因。 Ap是由它的前体一淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经裂解而 产生的。APP是一种跨膜多肽，由770个氨基酸组成，半衰期很短(在多种细 胞中仅存留45-60分钟)，在APP由内质网分泌并转运至细胞膜的过程中可经 历多种裂解，裂解产物最终释放至细胞外。APP裂解的两种方式，多数情况下， APP首先进行a裂解，产生可溶性大片段a-APP，并释放至细胞外，残留含83 个氨基酸的羧基端片段(C83);少数情况下，APP先进行(3裂解，产生一个略 小于a-APP片段的P-APP，残留含99个氨基酸的羧基端片段(C99)，之后， 两种裂解产物c83和c99再经y裂解产生p3和a卩(可因不同的裂解部位 而产生A卩wq和ApW2)。在病理状况下，P裂解或y裂解增强，产生高于生理
浓度的A|3 (主要是APm2)， A卩M2肽是构成老年斑的基本成分，并在细胞外沉
积形成老年斑。A(3M2 C端的10个氨基酸残基33 42及17~21的5个氨基酸残 基具有高度的疏水性,构成了 Apw2的疏水区;28 42氨基酸残基形成e -折叠构象 的可能性较大，而9 21的氨基酸残基也可能形成(3-折叠的构象。卩-折叠的构象有
利于ApM2肽的聚集而沉积形成老年斑。
由于缺乏合适的研究模型,目前人们对A(3肽的分解代谢和AP肽的清除机理认识得还很不清楚,因而阻碍了治疗该疾病的有效药物的研究与开发。最近科学 家们报道了与上述完全不同的治疗AD的研究方法,即用PDAPP转基因鼠做 A卩w2肽的免疫实验。科学家们把人工合成的A卩M2分别注射到还未有AD病变 特征的幼鼠和已有AD病变特征的老龄鼠体内,结果发现注射APM2的幼鼠几乎阻 止了 P-淀粉样斑块的进一步生成;老龄鼠则非常显著地减轻了 AD的症状。这是 一个很有意义的发现,不仅意味着这种方法有可能同样应用于人类,而且人们有可 能通过基因工程在人体内产生AP的抗体,从而阻止AD病的发生。
目前虽然有人曾利用大肠杆菌系统，成功地表达了 A(3w2，但由于表达产物 通常在宿主细胞内形成包涵体，所以致使产物的收率很低，或者纯化困难，易于 污染内毒素，往往难于适应研究和临床应用的需要。虽然也有研究者构建了真核 系统表达载体pcDNA3.1并在COS-7细胞中进行了瞬时表达，但不能用于Apw2 的大量制备。因此，有必要建立大量制备ApM2的体系，以便为其应用于动物模 型，制备抗体，研究清除老年斑的作用机理及预防和治疗AD奠定基础。
甲基营养酵母，特别是巴斯德毕赤酵母是已被深入研究的真核表达系统，并 已被用于表达许多有用的蛋白质。例如，美国专利5,324,639公开了在甲基营养 酵母特别是巴斯德毕赤酵母细胞中生产胰岛素样生长因子1的方法；美国专利 5,330,901公开了使用巴斯德毕赤酵母系统表达人血清白蛋白的方法；美国专利 5,965,389提供了在甲基营养酵母中表达L-谷氨酸脱羧酶(GAD65)的DNA构 建体以及由之制备纯的GAD65的方法；美国专利公开了在巴斯德毕赤酵母中表 达血小板衍生的细胞因子(PDGF)的方法；美国专利6,780,615描述了使用重组 巴斯德毕赤酵母生产应乐果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未见关于使用巴斯德毕
赤酵母生产人A(3M2的报道。
发明目的
本发明的一个目的是提供一种使用甲基营养酵母生产重组人淀粉样蛋白 ((3-amyloidprotein，ApL42)多肽的方法，该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培 养基中培养甲基营养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作地连 接的元件的DNA构建体转化的(l)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码人淀粉样 蛋白A(3M2的DNA片段；G)转录终止子和(4)可选择标志，从而以至少150mg/L培养基的浓度产生人A卩m2多肽。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤 酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母 A0X1基因。
本发明的另一个目的是提供用于表达重组人淀粉样蛋白ApL42的甲基营养 酵母，该酵母能够依靠作为碳源和能源的甲醇生长，并且是被包括甲基可诱导的
转录启动子、编码人淀粉样蛋白APm2的DNA片段、转录终止子和可选择标志 的DNA构建体转化的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵 母，并且甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母A0X1基因。 本发明的再一个目的是提供用于在巴斯德毕赤酵母中表达重组人淀粉样蛋 白APL42多肽的DNA构建体，该构建体包括可操作地连接的元件甲基可诱导 的转录启动子、编码人淀粉样蛋白ApL42的DNA片段、转录终止子和可选择标志。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤 酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母 A0X1基因。
本发明的再一个目的是提供使用巴斯德毕赤酵母大规模生产重组人淀粉样 蛋白ApM2多肽的优化的发酵培养条件，特征在于其中发酵温度维持在28°C 30°C、所使用的pH值为3. 5 5. 0、发酵液的DO值(溶解氧)保持在20% 30%、 并且培养基中添加有0.5% (W/V)的蛋白胨。


图1显示合成的人A(3m2 DNA为模板的PCR电泳图谱。其中泳道1和2是 PCR产物；泳道3是DNA分子量标志物。
图2显示重组质粒pPICZ a /h APl42特化酵母菌的PCR鉴定电泳图谱。其中 泳道5和14是DNA分子量标志物；泳道20是空质粒载体转化的酵母菌基因组 DNA的PCR产物；泳道1 4，6 13和15 19是不同酵母菌转化子基因组DNA 的PCR扩增产物。
5图3显示纯化的Ah."蛋白质的十二垸基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)结果(考马斯亮蓝染色)。其中泳道l， 2分别是纯化中分部收集的 洗脱液；泳道3是空白对照；泳道4是6.5KDa分子量标准品。
图4显示纯化ApM2的Western印迹分析结果。其中泳道1是空白对照；泳 道2 5是本发明制备并纯化的APm2祥品。

发明内容
本发明涉及蛋白质生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达
人淀粉样蛋白APw2的方法。
巴斯德毕赤酵母(P. Pastoris)是20世纪80-90年代发展起来的极具潜力的 酵母表达系统，由于其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点而得到越 来越广泛的应用。
作为真核表达系统，巴斯德毕赤酵母具有许多其它蛋白表达系统所不具备的 优点①属于单细胞生物，故保留了易于操作和生长速度快的特点(可高密度发 酵培养，在发酵罐中细胞干重可达130 g/L以上)；②营养要求低，培养基成分 简单，生产成本低，特别适用于工业化大规模生产；③通过同源重组，可将表达 载体稳定地整合到宿主染色体中，连续传代中不易丢失；.④具有强有力的乙醇 氧化酶基因(AOX)启动子，可严格调控外源基因的表达；⑤表达量高，许多蛋白 的产率可达到每升克以上水平；⑥表达的蛋白质既可存在于胞内又可分泌至胞
外，巴斯德毕赤酵母自身蛋白质的分泌量很低，十分有利于目的产物纯化；⑦作 为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的正确加工和修饰；⑧糖基化程度 低。
毕赤酵母表达系统由一个外源基因表达框和A0X1启动子、多克隆位点 (MCS)和一个从A0X1基因上拷贝下来的终止序列(TT)组成。同时，大多数载 体都包含作为筛选标记的HIS4基因和为拷贝增殖而存在的序列(如ColEI复制起 始点和抗氨苄青霉素基因)。另外，还含有使外源基因能以替代或插入方式整合 到染色体的A0X1部位的AOX13'非编码区序列。本发明所使用的载体是由启 动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点等元件构成。另外分泌型载体还 需要有信号序列。最常用的启动子是A0X1启动子，它的甲醇诱导性很强，因而它控制下的 外源基因能得到较高的表达。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力是由A0X1提供 的。当在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，A0X1转录受到抑制；而在
以甲醇为唯一生长碳源时，则可诱导A0X1基因的转录和蛋白质表达。选择标 记(HIS4) —般是对应于营养缺陷型受体的野生型基因。
巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白质很少，所以分泌表达是一种理想的表达方 式。同时，胞外表达更有利于蛋白质的提取和纯化。本发明优选的信号肽是a因 子(aMF)。 a因子信号序列由87个氨基酸组成，来自于啤酒酵母(S. cerevsia) 的a性成熟因子前导序列，并且已将这段序列编码的信号肽插人到巴斯德毕赤酵 母的表达载体中。
本发明的巴斯德毕赤酵母表达载体可以是胞内表达的，也可以是分泌表达 的。这些载体都包括一个由0.9kb的5'A0X1序列片段和约0.3 kb的转录终止基 因的3'序列组成的表达盒。分泌型表达载体可以是pPIC9,pPIC9k、 pHIL-Sl、 pPICZ a 、 pYAM75P6E6等；胞内表达的载体可以是pHIL-D2、 pA0815、 pPIC3K， pPICZ， pHWO10E121， pGAPZ、 pGAPZa等。本发明优选的是pPICZ a 。
一般用于外源基因表达的巴斯德毕赤酵母菌株包括Y-11430、 M-6100-3 、 GS115、 KM71、 SMD1168等，本发明优选的是巴斯德毕赤酵母X-33菌株。
得到携带人APw2基因的重组表达载体后，可使用锂盐法、PEG法、原生质 球法和电穿孔法等方法转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞。其中，本发明优选的转化 方法是电穿孑L法(如参见Sambrook, ed. Molecular Cloning: A Laboratory Manul (2nd.ed.)，Vols.l-3,Cold Spring Harbor Laboratory, 1998)。
导入酵母体内的重组表达载体只有与酵母染色体上的同源区发生重组，整合
到染色体上，外源基因才能够稳定存在并得以表达。本发明中，为了稳定地表达 目的基因，可以在His或5'AOXl的单酶切位点将质粒载体线性化(Sac 1)，使 之通过单交换整合到酵母细胞染色体中，从而得到表型为Mut+并具有高甲醇利 用能力的转化子。
用于本发明的巴斯德毕赤酵母含有典型高等真核生物的许多翻译后修饰功 能。这些功能包括信号肽的加工、蛋白质折叠、二硫键的形成、O-及N-型糖基 化和酰化等。其中，最重要和研究最多的是糖基化作用。蛋白质的糖基化链参与细胞识别、激素受体结合、蛋白质定位及宿主一微生物间相互作用。糖基化过程 是经一系列剪接并产生由Mans-6-GluNAC2(高甘露糖型)组成的寡核糖的反应。 巴斯德毕赤酵母能够将碳水化合物连接到分泌表达的外源蛋白质上。巴斯德毕赤 酵母修饰糖链的平均长度为8 14甘露糖，而且外链不含ci-l,3甘露糖，所以其 表达的糖蛋白特别适于治疗应用。
由于本发明中充分优化了溶解氧水平、通气量、发酵pH值，搅拌速率、营 养补给等培养条件，所以可使酵母菌高密度生长，从而导致产物的高效表达。例 如，在发酵罐培养条件下，本发明的重组人淀粉样蛋白APw2表达产率可达到 300mg/L。
绝大多数情况下，巴斯德毕赤酵母(P. Pastoris)中整合多拷贝外源基因会 提高重组蛋白表达产量，所以本发明优先选择分泌型、高拷贝标记和易操作的穿 梭载体，特别是pPICZ a作为人淀粉样蛋白的表达载体。
另外，由于在His位点整合时，染色体突变的His位点可与表达盒的HIS4 基因位点之间发生基因交换会导致表达盒的丢失，故一般优先选择A0X1位点。
本发明中，发酵培养所使用的培养基可以是BMGY/BMMY, BMG/BMM， MGY/MM等培养基，但优选的是成分中含有缓冲液的BMGY/BMMY或 BMG/BMM培养基。
作为唯一的碳源和能源，甲醇的加入量一般为培养体积的0.5-1.0%(V/V)。
发酵培养过程中，可使用已知的方法检测由被转化细胞分离物所产生的人淀 粉样蛋白APw2含量，并从中选择有高产率的细胞分离物，用于放大生产。
可使用离子交换层析、疏水层析等方法分离并纯化所需的人淀粉样蛋白
ApM2。
本发明首次在酵母(毕赤酵母X-33)中高效分泌表达了人淀粉样蛋白AP"2，
建立了稳定的人淀粉样蛋白APL42毕赤酵母高效表达体系。与在大肠杆菌中的表
达相比，本发明的方法具有如下特点①表达体系稳定，含目的基因的表达盒通 过同源重组整合进入酵母的染色体中，菌种稳定，不存在质粒丢失的问题；②有 效的分泌表达，目的蛋白质的表达受醇氧化酶启动子的严格控制，可在甲醇诱导 下启动表达并将表达产物分泌到培养基中，而且毕赤酵母本身的蛋白很少分泌到 培养基中，使目的蛋白更易于纯化；③表达产量高，人淀粉样蛋白APw2在毕赤
8酵母中的摇瓶规模表达量可达200mg/L，在发酵罐中大规模高密度发酵培养时可 达到300mg/L;④不存在内毒素污染问题；⑤大规模发酵生产成本低。
在人淀粉样蛋白ApM2纯化方面，本发明建立了联合使用阳离子交换层析和
反相疏水层析技术纯化人淀粉样蛋白A(3M2产物的方法。使用SDS-PAGE、 Western
印迹分析，证实按照本发明方法生产的人淀粉样蛋白ApM2具有与天然人淀粉样 蛋白A(3m2相同的分子质量和免疫反应性，从而为进一步检测其体内外生物学活 性提供了必要条件。
在以上研究的基础上，本发明进一步探讨了毕赤酵母工程菌大规模发酵 (80L发酵罐)方法，优化了利用酵母菌大规模发酵产生人淀粉样蛋白APm2的 条件，以及适合大规模生产的产物纯化方法。其中所使用的优化条件包括发酵 温度维持在28。C 3(TC、所使用的pH值为3.5 5.0、发酵液的DO值(溶解氧) 保持在20% 30%、并且培养基中添加有0. 5% (W/V)的蛋白胨。
结果显示，本发明建立的毕赤酵母工程菌大规模发酵生产重组人淀粉样蛋白 APw2的表达率约为300rag/L发酵液、产物回收率约为60%、产物的纯度高达约 95%。本发明的这些研究结果无疑将为重组人淀粉样蛋白Ap142的工业化生产和 临床应用提供必要的基础。
具体实施例方式
以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例 阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。
实施例l:人淀粉样蛋白APM2基因的获得和扩增 (1)人淀粉样蛋白ApL42 DNA的制备 人工合成的方法将编码人A卩W2氨基酸的遗传密码子全部换成了酵母偏爱的
密码子，具体序列如下5， -GATGCTGAATTTAGACATGATTCTGGTTACGAAGTTCATCAT
GGTGTTGTTATTGCT-3， (SEQ ID NO. 1)。
取如上DNA，按如下比例建立PCR反应体系50y 1: 取上述合成的人A(3M2 DNA为模板1 u 1 (2pmol/ul);含Mg2+的10XPCR
9缓冲液5]il; dNTPs 2. 5 y 1 (各2. 5誦ol/L);在5'端引入酵母a因子信号肽的 部分序列，上游引物5， -CGCCTCGAGAAGAGAGATGCTGAATTTAG-3， (SEQ ID NO. 2) 1 u 1 (20pmol/u 1)含Xhol酶切位点；下游引物5， -CCACAACAATAACGAATTCTTAA GCGCGC-3, (SEQ ID NO. 3) 1 u 1 (20pmol/u 1)含EcoRI酶切位点；Pfu Taq酶 0.3iil (5U/iU);灭菌超纯水至终体积50u 1。 PCR反应条件是94。C4分钟； 94°C30秒，55°C 30秒，72°C 30秒，共30个循环，然后72°C 5分钟。对扩增 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，观察片段大小，确定是否得到正确目的基因。 如附图l所示。
(2) ApM2毕赤酵母分泌型表达载体PPICZa-hApM2的构建 回收PCR扩增的人淀粉样蛋白APM2基因片段并进行l。/。琼脂糖凝胶电泳分析。
而后，PCR扩增产物用XhoI和EcoRI酶切后，16。C连接过夜于用同样酶切的载体 pPICZa上。连接反应体系包括ApL42PCR产物0.1 0.3pmol; pPICZa载体 0.03pmol; T4连接酶lyl; T4连接酶缓冲液lul;灭菌超纯水至终体积IOw 1。
按照常规方法，从37'C培养16小时的XL厂Blue阴性培养板上(不含抗生素 的LB琼脂平板)挑取单个菌落(直径2 3mm)，接种于含有100ml LB培养基的 1L培养瓶中，以制备感受态大肠杆菌细胞，并于-8(TC冻存备用。
取一份冻存的感受态细胞融化后，加入上述连接产物，进行常规转化。然后 取200u 1已转化的感受态细胞涂布于含Zeocin (25u g/ml)的低盐LB琼脂平 板上，37'C培养箱中培养12 16小时。
(3) 重组载体的鉴定
随机挑取转化后的单菌落，接种于LB培养基中，37'C强烈震荡培养过夜， 然后常规提取质粒DNA。取10 u 1溶解的DNA沉淀物进行琼脂糖凝胶电泳定量分 析和酶切鉴定。37°C AflII消化3小时，1%琼脂糖凝胶电泳后根据内切酶谱鉴 定正确克隆。挑选酶切鉴定正确的克隆，提取质粒，用于DNA序列测定分析。
实施例2: pPICZa-hA(3M2转化毕赤酵母X-33
取测序正确的培养菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA并用琼脂糖 凝胶电泳法进行定量分析。取20 25 u g pPICZa-hA(3M2，重组质粒经Sacl酶消 化(线性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。线性化的质粒用10ul超纯水
10溶解后置冰上备用。
从毕赤酵母X-33的YPD阴性培养板上(不含抗生素的YPD琼脂平板)挑取 单个菌落，接种于5mlYPD培养基中，250rpm， 3(TC震荡培养8小时，以常规制 备酵母电转化感受态细胞。
然后取80 n 1上述感受态菌，与20 25u g线性化的重组表达质粒混合，移 入0. 2cm电转化杯内进行电转化，而后加入lml冰上预冷的1M无菌山梨醇，混 匀后，30。C孵育l小时。取150yl转化后的菌液涂布于含Zeocin (100iigM) 的YPD平板上，30'C培养箱培养2 3天，观察转化子的生长状况，并挑取17 个克隆于YPD或BMGY培养液中，3(TC震荡培养过夜。
取0.5ml培养物，离心回收菌体后，以玻璃珠法提取酵母基因组DNA并进行 PCR鉴定筛选转化的酵母菌。所使用引物和反应条件同上，鉴定结果如附图2所 示。
实施例3:重组人淀粉样蛋白的表达
取上述鉴定结果阳性的克隆接种于10ml BMGY(pH6.0)培养基中，3(TC震荡 培养24小时，至ODe。。达到2. 0 6. 0时收集细胞。用等体积GOml) BMMY(p服.0) 重悬细胞沉淀，30'C震荡培养，诱导表达。诱导过程中，每24小时补充一次甲 醇至终浓度0.5%，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变。在培养的 第0、 24、 48、 72、 96、 120、 144和168小时等时间点各取0. 5ml发酵液，离心 取上清用于蛋白质分析(SDS-PAGE, Western Blot)。
实施例4: APM2多肽的理化性质鉴定 (1) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
用SDS-PAGE法进行蛋白质分子量测定和初步定量分析。方法如下 配制18%分离胶5%浓縮胶。分别取第48小时培养物上清按4:1比例加入5 XSDS样品缓冲液，混匀后，煮沸3 5分钟。取上述样品，冷却至室温后，离 心(10000rpm) 30秒，取上清每孔加样48ul。 60V电泳至浓縮胶与分离胶交界 处，调整电压到90V，继续恒压电泳分离。考马斯亮蓝染色并脱色后，观察分析 结果。(2)表达产物的Western印迹分析
按照常规方法将发酵液上清经SDS-PAGE后，转印到硝酸纤维素(NC)膜上， 室温干燥30 60分钟。将上述NC膜置于平皿中，加入20ml封闭液(含0. 2% BSA 的TTBS)，室温轻轻振荡2 3小时或4'C封闭过夜。封闭结束后，将NC膜放入 杂交袋中按0. lml抗体溶液/cn^膜加入兔抗人A(3m2抗体，室温振荡1 4小时。 膜用TTBS漂洗3 5次后，用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗 体至1:200 1:1000，加入杂交袋中，与NC膜一起室温振荡2 4小时。加入 lml 0.3% (W/V) NiCl或CoCl2及10ul 30% &02溶液。洗膜后，将膜移入显色 液中，室温下轻轻摇动并观察显色反应。结果如附图3所示。
实施例5: ApM2的大规模发酵制备及纯化 (l)最佳pH值的确定
选取表达量较高的A卩w2毕赤酵母工程菌，在10ml YPD培养基中3(TC、 250rpm震荡培养约24 36小时。分别取上述未加缓冲液的BMGY 8ml，按下示的 量加入不同的缓冲液，以配制成不同pH值的BMGY。混匀后各加入lml毕赤酵母 工程菌，30°C、 250rpm震荡培养约30小时，使其0De。。^5。
pH值lmol.L—1 Na風(u 1)0. 5mol七—1柠檬酸(ul)
2.8158.5841.5
3.4285715
4. 0385.5614. 5
4. 6467.5532. 5
5.2536464
pH值lmol L—1 Na2HP04(u 1)lmol L一1 NaH2P04 (u 1)
5.879921
6.4255745
7.0577423
室温离心(3000rpm) 5分钟，弃去上清，并在菌体沉淀物中加入不含缓冲 液的B醒Y8ml。然后按如上所示的量加入不同的上述缓冲液，以配制成不同pH 值的BMMY， 30°C、 250rpm震荡培养。诱导表达过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5%，同时补充灭菌去离子水，使发酵液总体积保持不变。在培养的 第0、 24、 48、 72、 96、 120、 144、 168小时等时间点各取0. 5ml发酵液，离心 收集上清进行蛋白质定量分析(SDS-PAGE法)。 (2)其他发酵条件的优化
A) 将冻存的工程菌在YPD琼脂(含Zeocin 100ug/ml)板上3(TC划线培养。 至菌落直径达到2mm左右，挑取单克隆菌落加入到10ml YPD培养液(种子培养 基)中，30°C、 250rpm震荡培养16 24小时。然后将上述培养物加入到YPD培 养液(2L)中，30°C、 250rpm震荡培养约24小时，OD,达到10左右。
B) 生物量的积累
配制40L FM21培养基，加入80L发酵罐中，高压灭菌(121°C， 30分钟)。 待发酵罐内培养基冷却到室温时，用氨水调节FM21培养基的pH至所需数值，而 后加入173. 6ml PTM1微量元素混合物和16ml生物素贮备液。在发酵罐中加入2 升上述培养的菌液，开始进行第一阶段发酵罐培养(即甘油培养扩增菌体阶段)。 此阶段培养温度为30°C、搅拌速度500rpm，罐内压力10psi， DO值(溶解氧) 维持在20%以上，必要时通入纯氧。在此阶段，每6小时取样1次，测OD6oo和 细胞湿重，分析酵母菌生长状态，肉眼和镜下观察菌液。排除杂菌污染，并留取 上清用于蛋白分析。约24小时后D0值上升至接近10(m，表明培养基中甘油已 消耗殆尽。此时即转入补充甘油阶段，以进一步增加菌体密度。按照每升12ml PTM1微量元素的比例在高压灭菌后的50%甘油中加入PTM1微量元素。混匀后， 将此混合物以18. 15ral/h/L初始发酵液(即726ml/h)的速率加入到发酵罐中， 至菌体湿重达到180 220g/L。 DO值上升至接近10(m后，继续维持"甘油饥饿" 状态30分钟，然后进入甲醇诱导表达阶段。 C)甲醇诱导A(3w2的合成
按照12ml/L的比例，在甲醇中加入PTM1微量元素，混匀后，以3. 6ml/h/L 初始发酵液(即144ml/小时)的速率加入到发酵罐中诱导表达。维持此低速率2 3小时，以使酵母逐渐适应以甲醇为唯一碳源的成长环境。DO值由波动较大变为 相对稳定后，继续维持此低速率并补加甲醇l小时。
然后加大补充甲醇的速率(7. 2ml/h/L)，并将此速率维持2小时后将速率继 续增加至11ml/h/L。同时，监测DO值和发酵液温度并判断甲醇是否过量。若停
13止补充甲醇后的D0值在1分钟内上升幅度大于10%，说明碳源受限，反之说明 甲醇过量。在碳源受限的情况下，须加快补充甲醇的速率；如果甲醇过量则应调 慢补甲醇的速率。
开始诱导表达后，每隔6小时取样，检测0D60()和细胞湿重，借以分析酵母 菌的生长状态。此期间留取培养物上清，用于蛋白定量分析。连续诱导发酵48 小时后，结束发酵。取各时间点的发酵液上清，进行SDS-PAGE分析。
实验结果
1) 发酵液PH值对A(3L42发酵产量的影响
为了选择发酵过程中最适PH，通过小试比较了不同pH对酵母生长以及
表达的影响。分别在pH3. 0， 3. 5， 4. 0， 4. 5， 5. 0， 5. 5， 6. 0， 6. 5, 7. 0的条件下进行 甲醇诱导表达。SDS-PAGE表明在pH4. 0时，甲醇诱导48h表达量最高为150mg \ 再延长发酵时间，上清液目的蛋白量不仅未增加反而减低，虽然小试时发现pH值 4. 5， 5. 0时表达量也较高，但其他杂蛋白量也高，而且APm2的等电点为5. 4。 PH 值3. 0, 3. 5时，pH值太低不适合菌体扩增，因此，我们选择把pH4. 0作为发酵液 表达的PH,即可最大限度地保持A(3l42分泌，同时又有利于控制杂菌污染和抑制 蛋白水解酶的活性。
2) 溶解氧对A(3w2发酵表达产量的影响
在发酵过程中，氧的供应是发酵的重要限制因素之一，发酵液的DO值(溶 解氧)应保持在20% 30%之间。溶解氧过高对APM2的表达没有任何有利的影 响，反而会增加生产成本。
3) 培养基成分对APM2发酵表达产量的影响
本实验比较了 BSM培养基和FM21培养基，结果发现FM21比BSM培养基更适 于发酵生产APM2。而且，培养基中添加0.5% (W/V)的蛋白腺可使AI3m2的表 达量略有增加，特别是可使表达峰提前至甲醇诱导表达后的第30 36小时，且 杂蛋白含量减少。
4) 温度对ApM2发酵表达产量的影响
毕赤酵母的最佳生长温度为3(TC,温度升高达到32t:对毕赤酵母是致命的。 有时降低发酵温度可增加目的蛋白的产量。有报道称在甲醇诱导阶段，温度从 3(TC降至25t:，可使克隆到巴氏毕赤酵母中的半乳糖氧化酶的产量增加4倍。对于A卩M2，在28。C 3(TC的温度下发酵取得了很好的效果。
5)甲醇流加速度对APM2发酵表达的影响
毕赤酵母虽然可以以甲醇为唯一碳源生长增殖，但甲醇对毕赤酵母菌而言仍
是一种有毒物质，其在培养基中的浓度不可高于2%，否则对酵母菌将是致命的。 甲醇可严格控制A0X1启动子，从而调控APM2的表达。本研究发现在流加甲醇进 行诱导时，尽管目的蛋白的表达量在一定范围内与消耗甲醇的量呈正相关，但是
甲醇的流加速度并非欲快欲好，对发酵表达A(3M2而言，甲醇最终的流加速度在
8. 5 9mL七—、L'初始发酵液体积较为合适，过低会出现达到表达高峰所需诱导 时间延长，杂蛋白增加；过高也会出现表达量下降杂蛋白增加。 (3)大规模纯化系统及纯化方法
将60L的发酵液离心，上清用lmol丄—NaOH调pH4. 0。添加200mmol'L—'的 NaAc-HAc(pH4. 0)缓冲液和去离子水将发酵液上清稀释3倍，NaAc-HAc终浓度 为20mmol'L—、采用SP S印harose XL阳离子交换柱，用5倍于柱床体积的缓冲液A (20mmol七—、aAc-HAc,pH4. O)平衡。然后连续加样，待树脂饱和后用3倍于柱体 积的缓冲液A洗柱。以缓冲液B (20mmol丄—iNaAc-HAc， lmol.L—1 NaClpH4.0)洗 脱，收集洗脱液。将洗脱液用Sourcem30 RPC反相疏水层析柱除盐和浓缩。
SDS-PAGE分析确定纯化后的蛋白质的纯度和浓度，并用Bradford法精确定 量。结果表明，经反相疏水层析和阳离子交换层析纯化后，A(3w2蛋白质的收率 约为60%，纯度可达95%以上。结果如附图4所示。序歹!j 表
<110>吉林圣元科技有限公司
<120〉用甲基营养酵母生产人淀粉样蛋白AeM2的方法
<140> <141> <160> 3 <210> 1 <211> 126 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定氨基酸序列设计的编码核苷酸序列。 <400> 1
GATGCTGAAT TTAGACATGA TTCTGGTTAC GAAGTTCATC ATCAGAAGTT GGTCTTCTTT GCTGAAGATG TTGGTTCTAA CAAGGGTGCT ATTATTGGTT TGATGGTTGGTGGTGTTGTT ATTGCT
<210>2 <211>29 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。 <400> 2
CGCCTCGAGA AGAGAGATGC TGAATTTAG
<210> 3 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。 <400> 3
CCACAACAAT AACGAATTCT TAAGCGCGC
1权利要求
1.一种使用甲基营养酵母生产重组人Aβ1-42蛋白的方法，该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作地连接的元件的DNA构建体转化的(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码人Aβ1-42的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而以至少150mg/L培养基的浓度得到重组人Aβ1-42蛋白。
2. 根据权利要求l的方法，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母， 并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母A0X1基 因。
3. 用于表达重组人AP^42的甲基营养酵母培养物，该酵母能够依靠作为碳 源和能源的甲醇生长，并且该酵母是被包括甲基可诱导的转录启动子、编码人 Apw2的DNA片段、转录终止子和可选择标志的DNA构建体转化的。
4. 用于在巴斯德毕赤酵母中表达重组人ApK蛋白的DNA构建体，该构 建体包括可操作地连接的元件甲基可诱导的转录启动子、编码人A卩w2的DNA 片段、转录终止子和可选择标志。
5. 根据权利要求4的构建体，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母， 并且甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母A0X1基因。
6. 使用巴斯德毕赤酵母大规模生产重组人ApM2蛋白的优化的发酵培养条 件，特征在于其中发酵温度维持在28'C 3(TC、所使用的pH值为4.0、发酵液 的DO值(溶解氧)保持在20% 30%、并且培养基中添加有0.5% (W/V)的蛋白 胨。
7. 纯化ApM2的方法，特征在于使用阳离子交换和反相疏水层析技术分离。
全文摘要
本发明涉及蛋白质的生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达重组人Aβ_1-42，以及优化的大规模工业化发酵生产和纯化重组人Aβ_1-42的方法。
文档编号C12N15/12GK101492674SQ20081005027
公开日2009年7月29日 申请日期2008年1月21日 优先权日2008年1月21日
发明者申茉函, 颜炜群 申请人:吉林圣元科技有限责任公司