专利名称：Exendin-4高产工程菌株的构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种Exendin-4高产工程菌株的构建方法。
背景技术：
糖尿病是一种世界性疾病，全世界糖尿病患者已超过1.5亿患者,其中2型 糖尿病患者占90%。在我国2型糖尿病患者将近4000万，随着生活水平的提高， 发病率将越来越高。目前治疗2型糖尿病的药物(西药)主要有磺酰类、双胍 类、a-葡萄糖苷酶抑制剂、格列酮类胰岛素增敏剂以及格列奈类胰岛素促分泌剂 等。这些药物有不同程度的副作用，例如促胰岛素分泌药物，其促进胰脏分泌 胰岛素作用并不依赖血糖浓度的高低，不仅产生空腹低血糖症状，而且长期使 用会因胰岛素分泌过度而导致胰脏(3-细胞衰竭。因而，每年约有10%的11型糖 尿病病人由于治疗失效而病情加剧，引发高血压、脑血管病变、白内障、心肌 梗塞、下肢坏疽等致残、致死的并发症。
Exendin-4是一种含39个氨基酸的活性调节肽，源于爬行动物的激素。 Exendin-4能通过以下多种机制降低血糖，改善糖尿病患者的病情l)刺激葡萄 糖依赖的胰岛素分泌，Exendin-4仅在高血糖时刺激胰岛素分泌，而在正常或低 血糖水平不促进胰岛素分泌，使Exendin-4更加安全；2)通过刺激(3-细胞新生 和增殖、抑制细胞凋亡等来改善胰岛卩-细胞量，从而阻止和逆转病情，使根治 糖尿病成为可能;3)降低2-型糖尿病病人饥饿及餐后血循环中的胰高血糖素;4) 调节葡萄糖在外周组织的转运。除了作用胰岛细胞，该蛋白还能直接作用于肝 脏和肌肉细胞，不依赖胰岛素的途径来抑制糖原的降解和促进糖原的合成，达 到降血糖的作用；5) Exendin-4可以减缓胃排空、抑制食物吸收。而且由于 Exendin-4在体内的半衰期为9.57小时，使其成为一种应用前景非常看好的新型 2-型糖尿病治疗药物，在同类药物中具有极强的竟争力。2004年美国Amylin公 司首先化学合成了 Exendin-4，并获得专利。2005年4月29日此药获得了美国 FDA的上市批准。临床实验表明，Exendin-4能有效控制二甲双胍疗效不理想的 2—型糖尿病，降低空腹及餐后血糖浓度、糖化血红蛋白含量及体重，延缓疾病 进程，延长寿命，提高生活质量，减少心血管病发生；与其他同类治疗2 —型糖尿病的药物相比，Exendin-4不仅副作用小，适合长期使用，而且性价比比其他 药物更高，经济实惠，适合大多数人使用。
但是目前Exendin-4主要采用化学合成，成本高(对原料氨基酸及仪器设备 要求极高)、产量少，市价高达7000元/毫克。利用基因工程生产Exendin-4，不 仅可以实现工业化的大规模生产、有效地降低产生成本，而且终产品污染各种 有害化合物的机会极小，产品更加安全。华东科技大学Xiaopu Yin等人曾将 Exendin-4基因转化到大肠杆菌中，但产量极低，最后得到纯度80%的重组 Exendin-4仅3.14mg/Kg细菌(Xiaopu Yin， Dongzhi Wei， Lina Yi， Expression and purification of Exendin-4, a GLP-1 receptor agonist, in Escherichis coli， Protein Expression and Purification, 2005, 41: 259-265,)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种Exendin-4高产工 程菌株的构建方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的
Exendin-4高产工程菌株的构建方法是g以下步骤进行的
(1) Exendin-4基因的改造将Genebank中登录编号为AAB22006的 Exendin-4基因改造为具有SEQ ID No.l所示核苷酸序列的Exendin-4基因；人 工合成Exendin-4基因，采用PCR方法，以5'GGTACCGACGACGACGACAAGC 3'为正向引物，以5'CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3'为反向引物，在 Exendin-4基因5'端加上限制性内切酶Kpn I位点；在Kpn I位点后添加编码肠 激酶识别位点DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使肠激酶识别位 点的核酸序列与Exendin-4基因紧密相连；在Exendin-4基因3'端添加两个相连 的终止密码子TGATAA和限制性内切酶NcoI (CCATGG)位点。
(2) 克隆载体pMD19-T-Exendin-4的构建利用PCR扩增的改造后的 Exendin-4，纯化后与pMD19-T载体连接，构建克隆载体pMD19-T-Exendin-4。
(3) 高效表达载体pET-32a (+) - Exendin-4的构建用限制性内切酶Kpn I和Nco I双酶切pMD19-T-Exendin-4质粒，回收目的片断；用限制性内切酶Kpn I和Nco I消化表达载体质粒pET-32a (+)，回收载体pET-32a (+)大片段，将 二者连接即重组Exendin-4表达载体？￡丁-32江(+)- Exendin-4;将表达载体pET-32a
(+) - Exendin-4转化入大肠杆菌工程菌BL21(DE3)pLYS中，得到Exendin-4 高产工程菌株BL21(DE3)pLYS—pET-32a (+) -Exendin隱4。由于本发明对目的基因Exendin-4进行了改造，使其能在大肠杆菌中高效表 达，预表达试验表明BL21(DE3)pLYS—pET-32a (+) - Exendin-4为高产菌株。 重组Exendin—4产量达细菌总蛋白的15%。纯化后，每克菌体可获得6.44mg 纯度为98%的重组Exendin—4。肠激酶消化后每克菌体可获得1.2mg纯度99% 以上的游离Exendin-4。在Exendin-4用量为0.7pg/kg小鼠时，糖尿病小鼠 (BKS.Cg-m +/+ Lepr db/J小鼠)腹腔注射lh后血糖降低15.79%, 4h后血糖降 低达40.08%。
图1是PCR扩增改造后Exendin-4，大小正确，其中1是PCR扩增的目的 基因，M是DNA Marker。
图2是pMD19-T-Exendin-4重组质粒和PCR鉴定，序列测定表明重组 Exendin-4克隆载体序列正确，与理论设计完全一致。其中1. pMD19-T-Exendin-4 重组载体2.以pMD19-T-Exendin-4质粒为模板，PCR扩增产物，M. DNA Marker 。
图3 pET-32a (+) - Exendin-4质粒(A)和PCR鉴定(B)，测序显示表 达载体构建成功，序列与理论设计一致。图A 1.pET-32a ( + ) -Exendin-4重组 质粒；图B 1.以pET-32a(+)-Exendin-4质粒为模板，PCR扩增结果；M. DNA Marker o
图4重组Exendin—4预表达及产量计算。融合蛋白表达量随诱导表达时间 延长而增加，6小时表达量最多，达细菌全蛋白含量15%。 1:诱导前，2:诱导 lh， 3:诱导2h， 4:诱导3h, 5:诱导4h， 6:诱导5h， 7:诱导6h; M:蛋 白质Marker 。
图5是不同Exendin-4用量对糖尿病小鼠血糖浓度变化的影响。A、 B、 C 组分别腹腔注射100ul 0.7 ug/kg、 7ug/kg、 35ug/kg Exendin-4;对照组腹腔注射 生理盐水(D组)。1.用药前；2.用药后lh; 3.用药后4h。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作详细说明。 1.Exendin-4基因的改造
Exendin-4多肽含39个氨基酸残基，GeneBank的登录编号是AAB22006， 其mRNA序列登录编号是HSU77613。
根据大肠杆菌密码子偏好性，将原来39个密码子的70% (27个密码子的碱
5基组成)进行了改造，使Exendin-4基因适应大肠杆菌的表达系统，改造后的 Exendin-4高效表达的基因序列如SEQ IDNo.l。
采用人工合成的方法，合成Exendin-4基因，将其保存在质粒中。然后采用 PCR方法，对Exendin-4基因进一步修饰在其5'端加上限制性内切酶Kpn I (GGTACC)位点；在KpnI位点后添加编码肠激酶识别位点(DDDDK)的核 酸序列GACGACGACGACAAG,使肠激酶识别位点的核酸序列与Exendin-4基 因紧密相连，并完全按照三联密码编码，无移码突变；另外，在Exendin-4基因 3'端添加两个相连的终止密码子TGATAA和限制性内切酶NcoI (CCATGG)。 PCR引物设计如下
正向引物5'GGTACCGACGACGACGACAAGC 3'
反向引物5'CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3'。
2. 重组Exendin-4表达载体的构建
2.1克隆载体pMD19-T-Exendin-4的构建
利用PCR扩增改造后的Exendin-4，纯化后与pMD19-T载体连接，构建克 隆载体pMD19-T-Exendin-4，将质粒载体转化入大肠杆菌ToplO中，利用氨苄抗 性和蓝白斑菌落筛选，挑选阳性克隆，测序鉴定并保种。
2.2高效表达载体pET-32a (+) - Exendin-4的构建
用限制性内切酶Kpn I和Nco I双酶切pMD19-T-Exendin-4质粒，1%琼脂 糖电泳分离后，利用DV805A胶回收试剂盒(宝生物)回收目的片断；同时也 用相同的限制性内切酶消化表达载体质粒pET-32a(+)，利用DV807A试剂盒(宝 生物)回收载体pET-32a (+)大片段，将二者连接即重组Exendin-4表达载体 pET國32a (+) - Exendin-4 (简写为pET-32aE4),将其转化大肠杆菌ToplO中。 利用氨苄抗性和蓝白斑挑选阳性克隆，测序鉴定并保种。培养含pET-32aE4的 菌株，利用碱性一SDS裂解法制备pET-32aE4质粒。将表达载体pET-32aE4转 化入不同的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)pLYS中。
3. 获得Exendin-4
预表达试验表明BL21(DE3)pLYS—pET-32aE4为高产菌株。当菌液浓度达 OD600-0.6时，lmMIPTG在30oC， 220rpm诱导6小时，SDS-PAGE分析表明 重组Exendin—4产量最高，达细菌总蛋白的15%。纯化后，每克菌体可获得 6.44mg纯度为98X的重组Exendin—4。肠激酶消化后每克菌体可获得1.2mg纯 度99%以上的天然结构Exendin-4。4. Exendin-4降糖活性测定
取IO周龄，体重41.07±0.5(^糖尿病小鼠81:8^^-111+/+1^ "(11)〃小鼠(南 京大学国家遗传工程小鼠资源库)，断食2小时，尾部取血。然后分别腹腔注射 100ul Exendin-4，用量分别为0.7 ug/kg小鼠(A组)、7ug/kg小鼠(B组)和35ug/kg 小鼠(C组)；对照组腹腔注射生理盐水(D组)。注射后lh及4 h尾部取血， 用试剂盒(上海荣盛生物技术公司)测定血糖浓度。结果表明Exendin-4用量为 0.7pg/kg时，糖腹腔注射lh后血糖降低15.79%， 4h后血糖降低达40.08%; Exendin-4用量为7ug/kg时，注射后lh和4h血糖分别降低23.8%和51.93% (图 5 )，降糖效果远远优于国内同类产品的功能(Protein Expression and Purification, 2005， 41: 259—265; BiotechnolLett, 2008， 30:651-656;专禾!j: 2005100440823.8; 200410062650.5)，也优于美国Amylin公司化学合成的Exendin-4 (DIABETES, 1999, 48:1026-1034))。
本发明中涉及的质粒制备、感受态细胞制备、转化及凝胶电泳等均按照《分 子克隆》操作步骤进行。
限制性内切酶消化、DNA的回收与纯化均按宝生物公司的使用说明进行操作。<no>河甫农业大学
<120> Exendin-4高产工程菌株的构建方法 <160> 1
<170> Patentln Version 3. 3
〈210〉 1 <211〉 117 <212> ■ 〈213〉人工序列
〈220>
〈221〉 misc—feature
<222〉 (1)…(117) 〈223〉大肠杆菌嗜性
〈400> 1
acggtgaag gtactttcac ctctgacctg tctaaacaga tggaagaaga agctgttcgt 60 ctgttcatcg aatggctgaa aaacggtggt ccgtcttctg gtgctccgcc accatct 11权利要求
1.一种Exendin-4高产工程菌株的构建方法，其特征在于它是按以下步骤进行的(1)Exendin-4基因的改造将Genebank中登录编号为AAB22006的Exendin-4基因改造为具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的Exendin-4基因；人工合成Exendin-4基因，采用PCR方法，以5′GGTACCGACGACGACGACAAGC 3′为正向引物，以5′CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3′为反向引物，在Exendin-4基因5′端加上限制性内切酶Kpn I位点；在Kpn I位点后添加编码肠激酶识别位点DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使肠激酶识别位点的核酸序列与Exendin-4基因紧密相连；在Exendin-4基因3′端添加两个相连的终止密码子TGATAA和限制性内切酶Nco I(CCATGG)位点；(2)克隆载体pMD19-T-Exendin-4的构建利用PCR扩增的改造后的Exendin-4，纯化后与pMD19-T载体连接，构建克隆载体pMD19-T-Exendin-4；(3)高效表达载体pET-32a(+)-Exendin-4的构建用限制性内切酶Kpn I和Nco I双酶切pMD19-T-Exendin-4质粒，回收目的片断；用限制性内切酶Kpn I和Nco I消化表达载体质粒pET-32a(+)，回收载体pET-32a(+)大片段，将二者连接即重组Exendin-4表达载体pET-32a(+)-Exendin-4；将表达载体pET-32a(+)-Exendin-4转化入大肠杆菌工程菌BL21(DE3)pLYS中，得到Exendin-4高产工程菌株BL21(DE3)pLYS-pET-32a(+)-Exendin-4。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域。具体涉及Exendin-4目的基因的改造和表达载体的构建。根据Gene Bank中登录的Exendin-4的氨基酸序列，结合大肠杆菌的密码子偏嗜性，对原有基因70％的密码子进行改造，使其能在大肠杆菌中高效表达；添加合适的酶切位点和肠激酶位点，构建合适的表达载体，将重组表达载体转化入不同的大肠杆菌工程菌，筛选高效表达Exendin-4的菌株。
文档编号C12N1/21GK101586104SQ200810049810
公开日2009年11月25日 申请日期2008年5月19日 优先权日2008年5月19日
发明者孟凡荣, 王小纯, 祖向阳 申请人:河南农业大学