专利名称：：一种重组植酸酶基因表达载体及转植酸酶基因乳酸杆菌的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程领域，具体涉及构建植酸酶基因与pIAJ38连接一起的高效表达载体及植酸酶基因在乳酸杆菌中的高效表达。
背景技术：
：植物中5070%的磷以植酸磷的形势存在，不能直接被单胃动物所利用，不仅造成磷资源的浪费，同时植酸磷不能被动物利用直接排出体外，造成环境污染。另外植酸还能与营养物质(蛋白质、淀粉、矿物元素等)发生螯合反应，影响这些营养物质的吸收和利用。导致植物性饲料营养价值的降低。植酸酶能将植酸分解为肌醇和磷酸，因而植酸的分解和利用，不仅提供了重要的磷源，达到减少磷酸氢钙的添加和降低磷环境污染的目的；而且还可消除其抗营养作用，提高营养物质的消化利用率。植酸的分解主要靠植酸酶来完成，象猪、鸡等单胃动物消化道内的微生物很少分泌植酸酶，主要靠每天在其日粮中添加植酸酶来实现。一般野生的微生物，象真菌和细菌，其产生的植酸酶量又极低，这极大地影响着植酸酶市场的开发。随着转基因技术的应用，通过基因工程手段使植酸酶基因在重组菌株中是植酸酶的产量大幅度提高，降低了酶的成本，为植酸酶在畜牧业生产中的广泛应用提供了前提。乳酸杆菌是一种非常重要的益生菌，它在维持动物消化道菌群的稳定、抑制有害菌生长和促进动物生产方面具有非常重要的作用。面对动物对抗生素产生的耐药性、抗药性以及抗生素在畜产品中的残留问题，目前欧州各国纷纷出台禁止抗生素作为饲料添加剂在动物饲养中应用的法律条文。这些禁令大大地促进了乳酸杆菌替代抗生素在动物抑菌促生产方面的应用。植酸酶作为词料添加剂存在的问题是每天必须在日粮中添加，这势必要增加饲养成本。由于目前植酸酶生产的成本高，若不考虑植酸酶减少磷的环境污染的社会效益，只考虑降低磷酸氢钙的用量及改善词料效率和部分促生产性能的经济效益的话，常常会产生利润低甚至入不敷出现象。从而严重地影响了植酸酶添加剂市场，这是目前植酸酶开发面临的普遍问题。为了解决这些问题，本研究通过把植酸酶基因转入到乳酸杆菌中，并制成微胶束化颗粒，通过定期混入饲料喂猪，可使该乳酸杆菌长期定居在猪胃肠道，产生足量的植酸酶，以替代每日添加的植酸酶。我国植酸酶研究虽起步较晚，但发展迅速，植酸酶的开发研究被列入到了国家"863"高科技研究计划。随着我国植酸酶转基因技术获得成功，为我国植酸酶的产业化巿场注入了活力。据统计我国每年酶制剂市场潜力约10万吨，价值约20-30亿元；而目前销量还不到十分之一，这主要是由于价格、成本、酶活特性及生产能力等因素限制了酶制剂的应用。我国目前的植酸酶面临的问题同国际市场和其它酶制剂一样。尽管植酸酶的综合效益好，但由于环保效益不被人们关注，且又无控制污染的标准约束，再加上植酸酶产生的经济效益有限，使许多用户避用植酸酶，而选用磷酸氢钙，这主要是由于用户强调的只是经济效益。因而，就促使研究人员研制出新的产品，使其在提高经济效益的同时，又达到了保护环境的目的。转植酸酶基因乳酸杆菌的研制属国内外首次研究和报道，不仅可替代植酸酶添加剂、降低成本、提高经济效益和保护环境；而且又替代了作为动物饲料添加剂的抗生素，达到维持动物消化道内微生物区系的平衡和抑菌促生产目的。这种具有植酸酶和益生菌双重功效的转基因乳酸杆菌将具有广阔的市场前景。
发明内容本发明的目的在于提供一种重组植酸酶基因表达载体及转植酸酶基因乳酸杆菌；本发明的另一目的是提供在乳酸杆菌中高效表达植酸酶基因的方法。本发明的具体技术方案如下重组植酸酶基因表达载体，该重组载体为pIA卩8-phyA。重组植酸酶基因表达载体是由在载体质粒pIAp8上插入基因序列如Ref.EF206311所示的植酸酶基因构建的。转植酸酶基因乳酸杆菌，它是按下述方法构建成的将重组植酸酶基因表达载体pIA(38-phyA通过电击转化进入乳酸杆菌中，收获高效表达植酸酶的转基因乳酸杆菌。在乳酸杆菌中高效表达植酸酶基因的方法将重组植酸酶基因表达载体pIAp8-phyA通过电击转化进入乳酸杆菌中，收获高效表达植酸酶的转基因乳酸杆菌。原核表达载体PIAP8是一种乳酸杆菌特异性质粒，可以在乳酸杆菌中大量复制，其突出特点是含有强启动子和信号肽，可在乳酸杆菌内高效表达外源基因并把表达的蛋白质分泌到细胞外。本发明构建的pIA(38-phyA重组表达载体，可通过高压电击转化进入乳酸杆菌中，并大量复制，从而能分泌大量的植酸酶。转基因的乳酸菌通过词喂动物，将长期寄居在动物(主要指猪禽)胃肠道内并分泌植酸酶，起到益生菌和酶制剂的双重作用。这对于抗生素的替代、畜产品的安全生产以及环境保护都具有特别重要的意义。图1是植酸酶重组克隆的蓝白斑筛选。图2是含有植酸酶基因T载体的鉴定，其中1:DNAmarker;2-3:阴性对照；4-8:阳性克隆。图3是含有植酸酶基因T载体的PCR鉴定，其中3和9:DNAmarker;6-10:阳性克隆。图4是双酶切含有植酸酶基因T载体的鉴定，其中l和7:DNAmarker;3-5:双酶切的阳性克隆。图5是pIAp8-phyA重组表达载体的蓝白斑筛选。图6是含有植酸酶基因pIAp8载体的鉴定，其中5:DNAmarker;1和7:阴性对照；其余的为重组表达克隆。图7是双酶切含有植酸酶基因pIA(38载体的鉴定，其中5:DNAmarker;1，5和6:双酶切的重组克隆。图8两种重组表达载体在大肠杆菌中表达的植酸酶酶活比较，1:pIAP8-phyA分泌到胞外的植酸酶酶活；2:pIAP8-phyA胞内植酸酶酶活；3:pGAPZaA-phyA分泌到胞外的植酸酶酶活；4:pGAPZaA-phyA胞内植酸酶酶活。图9两种植酸酶基因重组表达载体表达的胞内植酸酶酶活比较。图10两种基因重组表达载体分别在大肠杆菌中表达的植酸酶蛋白检测。1:商品植酸酶；2:pGAPZaA-phyA分泌到胞外的植酸酶；3:pGAPZaA-phyA胞内植酸酶；4:pIAP8-phyA分泌到胞外的植酸酶；5:pIAe8-phyA胞内植酸酶酶活；6:蛋白marker。图11是1号菌上清液中植酸酶活力的测定(n=5)。图12是3号菌上清液中植酸酶活力的测定(n=5)。图13是1号菌细胞内植酸酶活力的测定(n=5)。图14是3号菌细胞内植酸酶活力的测定(n=5)。图15是不同培养时间PH变化。图16是不同培养时间吸光度的变化。图17是不同培养时间干细胞重的变化。图18是不同培养时间酶活力的变化。具体实施方式下面结合实施例对本本发明作详细说明。实施例1一、植酸酶基因的克隆及鉴定1材料1.1仪器设备紫外分光光度计，离心机，超净工作台，高速冷冻离心机，恒温摇床，消毒离心管，玻璃培养皿(直径90mm)，微型凝胶电泳装置等。1.2菌种与质粒无花果曲霉(Aspergillusficuum)3.4322(购自中国科学院微生物研究所)，大肠杆菌DH5cc购自宝生物工程有限公司,克隆载体质粒PUCm-T购自上海生工生物有限公司。1.3酶与试剂限制性内切酶XbaI、KpnI和DNAMarker为TaKaRa公司产品，树脂型TM质粒DNA提取试剂盒和硅胶膜型TMPCR产物(DNA片段)纯化试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司，T4DNALigase购自promega公司,琼脂糖、常用试剂Tris、无水乙醇、异丙醇等均为进口或分析纯。1.4培养基(1)LB液体培养基(Luria-Bertani，LB):称取蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml的去离子水中，充分搅拌溶解。滴加5NNaOH调节pH值至7.0，加入去离子水将培养基定容至1L，在121。C、1.034xl05Pa条件下高压下蒸汽灭菌20min，4。C保存。(2)LB固体培养基液体培养基中按2%体积比添加琼脂粉，同法高压蒸汽灭菌20min。待培养基温度降至5(TC时，加入抗生素等不耐热物质。然后直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。在培养基完全凝结后，倒置平皿4'C保存。(3)PDA培养基称取可溶性淀粉6g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，酵母粉2g，大豆蛋白胨5g，硫酸镁0,3g，溶于800ml的去离子水中，充分搅拌溶解，加入去离子水将培养基定容至1L。在12rC、1.034xl05Pa条件下高压下蒸汽灭菌20min，4。C保存。1.5溶液配制(1)TE缓冲液10mmol^Tris誦HCl(pH8.0)，lmmol^EDTA(pH8.0)。lmol/LTris隱HCl(pH8.0)lml，0.5moVLEDTA(pH8.0)0.2ml，加ddH20至100ml。在12rC、1.034xl05Pa条件下高压下蒸汽灭菌20min，室温保存。(2)50xTAE缓冲液2moVLTris-醋酸，100腿ol/LEDTA。称取Tris242g，Na2EDTA'2H207.44g，溶于800ml的去离子水中，充分搅拌溶解。加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，再加入去离子水将培养基定容至1L，室温保存。(3)溴化乙锭(ethidiumbromide，EB):10mg/ml贮存浓度。称量lg溴化乙锭，加入去离子水100ml，充分搅拌数小时完全溶解。转移至棕色瓶中，室温避光保存。(4)1%琼脂糖凝胶称取lg琼脂糖于三角烧瓶中，力[]100mllxTAE，微波炉加热至完全溶化，冷却到6(TC左右，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液lxTAE)，即可上样。(5)X-gal(5-溴-4-氯-3-吲跺-P-D-半乳糖苷)溶液20mg/mlX-gal。称量lgX-gal置于50ml离心管中。加入40mlDMF(二甲基甲酰胺)，充分混合溶解后，定容至50ml。小份分装(lml/份)后，-2(TC保存。(6)IPTG(异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷)溶液24mg/mlIPTG。称量1.2gIPTG置于50ml离心管中。加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml，用0.22拜过滤膜过滤除菌。小份分装(lml/份)后，-20"C保存。(7)氨苄青霉素(Ampicillin，Amp):100mg/ml贮存浓度。溶解lg氨苄青霉素钠盐于足量的水中。最后定容至lOml。过滤除菌，小份分装(lml/份)后，-2(TC保存。工作浓度100|ig/ml。(8)提取液200mmoHTris陽HCl，250mmoHNaCl，25mmoFLEDTA，0.5%SDS。称取1.2114gTris，0.7305gNaCl，0.3653gEDTA，0.25gSDS，置于50ml离心管中。加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml，室温保存。(9)平衡苯酚液的配制提取液和苯酚按体积比l:l混匀，静置5-10min，去除上层液，留底液备用。(10)RNase缓冲液:lO隱okLTris-HCl(pH7.5)，15mmotLNaCl。称取0.l21gTris誦HCl，O扁gNaCl，置于50ml离心管中。加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml，再煮沸10min，放凉后按20mg/ml加入RNase。2方法和步骤2.1无花果曲霉(A.ficuum)总DNA的提取(1)将无花果曲霉菌丝接种于液体PDA培养基上，3(TC,100r/min摇床培养23d,用八层高压过的纱布过滤收集白色菌球，再放入高压过的滤纸中，挤压尽量除去所有水分。(2)把上述收集到的干菌体放入高压过的研钵中，加入液氮，尽快用锤子研碎。按每离心管50mg分装，-2(TC保存。(3)加入500pl提取液，上下颠倒混匀10min，然后加入350pl平衡苯酚，混匀后放置5min，再加入150^1氯仿，混匀后放置5min，13000转/min离心30min。(4)取上清液放置另一干净离心管中，加入含有RNase的缓冲液25^1，在37"C下保持10min。(5)按现有离心管中液体体积1:1加入氯仿，混匀静置5min，13000转/min离心10min。(6)取上清液放置另一干净离心管中，按现有离心管中液体体积l:2加入异丙醇，混匀后放置4。C保持lh。13000转/min离心10min，去除上清液，用吸管吸干所有水分。(7)管内沉淀用70%乙醇溶解，混匀后放置4。C保持lh。13000转/min离心10min，去除上清液，用吸管吸千所有水分，在室温下打开盖子凉干15min。(8)加入100plTE缓冲液，用吸枪吹打几次混匀，4。C保持2h后-2(TC保存。2.2植酸酶cDNA的克隆(1)PCR引物设计从GenBank中査到Alficuum的DNA全序列,参照李桂兰报道的从信号肽下游开始不含信号肽的phyA基因上设计得到的引物，上游引物引入Xbal酶切位点,下游引物引入Kpnl酶切位点。为了表达时翻译的需要，在上游引物的起始处加上了"ATG"起始密码子，在下游引物的末尾加上了"TAG"终止密码子。(此引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。上游引物Pl:5'隱ATGTCTAGACTGGCAGTCCCCGCCTCGAGA-3，勘I下游引物P2:5'-CTAGGTACCCTAAGCAAAACACTCCGCCCAATC-3，争I(2)PCR扩增以提取的无花果曲霉(A.ficuum)总DNA为模板，加入引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、10xbuffer及ddH20，旋涡振荡混匀后进行PCR扩增。反应体系为25(^1，组成见下表1。PCR反应条件94'C预变性8min，然后94'C变性lmin，55°Clmin，72°C延伸3min，共30个循环，最后72。C延伸10min以补齐末端。由于退火温度偏低，出现了非特异性条带，为避免扩出非特异性条带，再以上述扩出的PCR产物为模板，进行二次PCR扩增。反应体系为25pl，组成见下表2。表1植酸酶PCR反应组成(25pl)ddH2012.0-10xbuffer2.5jxldNTPsPI(lOiimoKJl単P2(lO)imokL)l単模板DNA5年TaqDNA聚合酶l単表2植酸酶PCR反应组成(25^1)ddH2012単10xbuffer2.5|ildNTPs2.5jilPI(lO(xmcMJl.O)ilP2(lOpmol/L)l単模板DNA5羊TaqDNA聚合酶l.OjilPCR反应条件94。C预变性3min，然后94。C变性lmin，60°Clmin，72°C延伸2min，共30个循环，最后72"C延伸5min以补齐末端。G)PCR产物纯化回收用硅胶膜型TMPCR产物(DNA片段)纯化试剂盒纯化回收PCR产物，基本步骤如下a、切取含DNA片段的琼脂糖后捣碎，按重量/体积比l:3(琼脂糖重量NE结合液的体积)加入NE结合液。如200mg琼脂糖加60(^1NE结合液。将切取的琼脂糖捣碎有利于加速下一步凝胶的融化。b、50-6(TC水浴3-5min，胶完全融化即可，其间可上下颠倒2-3次。c、将溶液转入禽心纯化柱中，静置5min使DNA充分与硅胶膜结合，13000r/min离心10-20s，倒掉收集管中的废液。适当增加DNA与硅胶膜结合的时间，使DNA与硅胶膜结合的时间，使DNA与硅胶膜充分结合，能在一定程度上提高回收率。d、加入500^1的80%异丙醇(或80%乙醇)于离心纯化柱中，13000r/min离心10-20s,倒掉收集管中的废液。e、重复步骤d。f、13000r/min再次离心lmin，尽量除去异丙醇或乙醇。g、将离心纯化柱置于新的离心管中，开盖放置2-3min，使乙醇挥发殆尽。一定使乙醇挥发干净，否则影响其回收率及纯度。h、加入40-50ki1无菌TE溶液或超纯水，静置3-5min，使洗脱液充分将硅胶膜浸透。TE溶液或超纯水有用量视用户对DNA尝试的要求而定。将TE或超纯水5(TC预热对提高回收率有一定帮助。I、13000r/min离心lmin，管底溶液即为所需的DNA溶液。将DNA贮存于-20'C可长期保存。(4)植酸酶基因与T载体的连接按照表3的反应体系，进行植酸酶基因与T载体的连接。连接反应在1.5ml离心管中进行，在T4DNA连接酶的作用下，16。C维持16-18h。表3连接反应体系(lOpil)ddH202単10xLigasebufferl年PCR回收产物5牟PUCm-TVectorl年T4DNALigasel単(5)连接产物的转化A、从-8(TC取出感受态细胞，握于手心快速融化，立即置于冰浴上，将要转化的DNA片段加入到装有感受态细胞的离心管中(5(^1感受态细胞需25ngDNA)，同时做阳性和阴性(不加DNA)对照，体积不应超过感受态细胞的5%，轻弹管壁，冰浴30min。B、取离心管在42t:水浴中预热，然后把混匀的感受态细胞和连接产物的混合物放入预热的离心管中，42。C热激恰恰90s，不要摇动。C、快速将离心管转移到冰浴中，冷却l-2min。D、每管加入800^1LB或SOC培养基，轻轻混匀，然后放在已设置为37。C的摇床上，培养时间应大于50min，转速不要超过200r/min。E、取10(^1转化菌液，涂布于含Amp、IPTG和X-gal的LB平板培养基上，放37"C至液体被吸收(30min)。倒置平板，于37。C培养，12-16h小时可出现菌落。(6)克隆植酸酶DNA片段的鉴定A、蓝白斑筛选取出平板于4X:放置数小时使菌落显色。有重组质粒的细菌无p-半乳糖苷酶活性，菌落呈奶白色；而无重组质粒的细菌有p-半乳糖苷酶活性，菌落的中央呈淡蓝色，外周呈深蓝色。B、提取质粒从转化菌平皿中挑取白斑多个，另选少量蓝斑(1-3个)做对照，接种于含Amp的LB液体培养基中(培养基的体积不应超过所盛容器量程的20%)，过夜培养。次日用树脂型TM质粒DNA提取试剂盒提取质粒，基本步骤如下a、将3-5ml菌液13000r/min离心30秒收集沉淀(菌体)。b、倒掉上清液，将沉淀(菌体)完全悬浮于lOO^il悬浮液(溶液I)中。上清液要尽可能去除干净，可用滤纸吸干。沉淀要用混旋器完全悬浮，否则将直接导致下一步的裂解不彻底，进而影响质粒DNA的产量和纯度。c、加入15(^1裂解液(溶液n)，轻柔地颠倒混匀IO次左右，溶液逐渐变得粘稠、清亮。不可用混旋器剧烈振荡，否则会使质粒DNA断裂;裂解时间不宜超过5min，否则会造成染色体DNA的污染。d、加入i50pi裂解液(溶液m)，轻柔地颠倒混匀IO次左右。此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。e、13000r/min离心8-10min，将上清液小心转入一个新的1.5ml离心管中，加入0.4ml纯化树脂(使用前充分混匀)，颠倒混匀3分钟。'此步是通过离心去除染色体DNA及细菌碎片，并使处于高盐状态下的质粒DNA与纯化树脂结合。f、将纯化树脂及上清夜的混合物吸入离心纯化柱中，13000r/min离心30秒，倒掉收集管中的废液。g、将离心纯化柱重新套入废液收集管中，加入600(11180%异丙醇(或80%乙醇)，13000r/min离心l分钟，倒掉收集管中的废液。如果纯化柱底部残留有异丙醇(或乙醇)，可用滤纸吸干，否则将影响以后的酶促反应。此步是洗涤质粒DNA中混有的杂质和盐类。h、重复第7步1-2次，尽可能将杂质去除。j、取出离心纯化柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管，加入50HlTE缓冲液于纯化树脂上，不能粘在管壁上。室温下放置5min后，13000r/min离心lmin。k、离心誉中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取l-2^d龟泳检测其纯度并目测定量。剩余-20'C保存备用。C、重组质粒的检测利用以上所挑选的重组克隆，通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测滞后质粒(图2)，再用用引物P1、P2进行PCR检测(图3)，和XbaI和KpnI双酶切检测(图4)。检测重组成功的克隆，制备甘油菌，进行测序。PCR检测以P1和P2为引物，按照下面的反应体系进行检测表4。表4植酸酶基因PCR扩增检测(2(^1)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>37°C，酶切过夜，12-14h。c、克隆基因的测序挑取经PCR检测和酶切鉴定本试验所需要，且理想的克隆，取10nl质粒，送北京三博远志公司测序，用DNAMAN软件分析序列测定结果。3结果与分析3.1植酸酶重组克隆的蓝白斑筛选将含有外源插入片段的T载体转入ExdiDH5a中。当外源DNA片段插入到T载体后，由于外源DNA的核苷酸序列存在改变了LaeZ基因的编码，从而影响了其产物(3-半乳糖苷酶a-片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色。因此，可通过蓝白斑筛选出含有外源插入片段的白色重组克隆见附图1。3.2植酸酶重组克隆的鉴定挑选阳性克隆，提取质粒DNA，进行重组克隆PCR检测和双酶切检测。提取的阳性克隆质粒DNA、PCR产物和双酶切过的质粒通过1%的琼脂糖凝胶电泳，结果如附图2、附图3和附图4。从附图2中可看出，阳性克隆质粒DNA比阴性的滞后，说明植酸酶基因片段已插入到T载体中。图3中PCR检测，6-10阳性克隆质粒在1400bp处均有一条亮带。在酶切之后，由图4可知，3-5阳性克隆质粒在1400bp处均有一条亮带，说明克隆的基因与试验所需的大小相符。克隆基因片段的序列分析用DNAMAN软件对测得的核苷酸序列与不含信号肽的目标序列进行比较，结果见Ref.EF206311。克隆序列编码蛋白与目的氨基酸序列的同源性为99.63%。两个样品克隆序列编码蛋白除在第118处的突变不同外，其它处突变均有相同趋势。第118处第一个样品天冬酰胺(N)变成了酪氨酸(Y)，而第二个样品没变。突变相同趋势是第52处的组氨酸(H)变成了谷氨酰胺(Q)，第93处的甘氨酸(G)变成了谷氨酸(E)，第228处的丝胺酸(S)变成了苏氨酸(T)，第373处的精氨酸(R)变成了色氨酸(W)。因此，克隆是可靠的。对于两个克隆序列的不同突变可能是由于PCR反应过程中Taq酶引起的，而其它与目的序列具有相同趋势的突变，是由于个体差异引起的。二、植酸酶基因原核表达载体的构建1材料1.1仪器设备紫外分光光度计，离心机，超净工作台，高速冷冻离心机，恒温摇床，消毒离心管，玻璃培养皿(直径90mm)，微型凝胶电泳装置等。1.2菌种与质粒大肠杆菌DH5a购自宝生物工程有限公司，原核表达载体pIAp8购自Invitrogen公司。1.3酶与试剂限制性内切酶XbaI、KpnI和DNAMarker为TaKaRa公司产品，树脂型TM质粒DNA提取试剂盒和硅胶膜型TMPCR产物(DNA片段)纯化试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司，T4DNALigase购自promega公司，琼脂糖、常用试剂Tris、无水乙醇、异丙醇等均为进口或分析纯。1.4培养基(1)LB液体培养基(Luria-Bertani，LB):称取胰蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml的去离子水中，充分搅拌溶解。滴加5NNaOH调节pH值至7.0，加入去离子水将培养基定容至1L，在121"C、1.034xl05Pa条件下高压下蒸汽灭菌20min，4。C保存。(2)LB固体培养基液体培养基中按2%体积比添加琼脂粉，同法高压蒸汽灭菌20min。待培养基温度降至5(TC时，加入抗生素等不耐热物质。然后直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。在培养基完全凝结后，倒置平皿-4'C保存。1.5溶液配制(1)TE缓冲液10mmol/LTris隱HCl(pH8.0)，lmmo^LEDTA(pH8.0)。lmol/LTris-HCl(pH8.0)lml,0.5mo化EDTA(pH8.0)0.2ml，加ddH20至100ml。在121"C、1.034xl05Pa条件下高压下蒸汽灭菌20min，室温保存。(2)50xTAE缓冲液2mol^Tris-醋酸，100mmol^LEDTA。称取Tris242g，Na2EDTAJH207.44g，溶于800ml的去离子水中，充分搅拌溶解。加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，再加入去离子水将培养基定容至1L，室温保存。(3)溴化乙锭(ethidiumbromide,EB):10mg/ml贮存浓度。称量lg溴化乙锭，加入去离子水100ml，充分搅拌数小时完全溶解。转移至棕色瓶中，室温避光保存。(4)1%琼脂糖凝胶称取lg琼脂糖于三角烧瓶中，加100mllxTAE,微波炉加热至完全溶化，冷却到6(TC左右，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液lxTAE)，即可上样。(5)X-gal(5-溴-4-氯-3-吲跺-p-D-半乳糖苷)溶液20mg/mlX-gal。称量lgX-gal置于50ml离心管中。加入40mlDMF(二甲基甲酰胺)，充分混合溶解后，定容至50ml。小份分装(lml/份)后，-2(TC保存。(6)IPTG(异丙基-P-D-硫代半乳糖苷)溶液24mg/mlIPTG。称量1.2gIPTG置于50ml离心管中。加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml，用0.22nm过滤膜过滤除菌。小份分装(lml/份)后，-2(TC保存。(7)氨苄青霉素(Ampicillin，Amp):100mg/ml贮存浓度。溶解lg氨苄青霉素钠盐于足量的水中。最后定容至lOml。过滤除菌，小份分装(lml/份)14后，-2(TC保存。工作浓度100pg/ml。2方法2.1植酸酶基因原核表达载体pIAP8的构建(1)植酸酶基因的回收A、挑取经过鉴定的含有植酸酶基因的T载体克隆载体单菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中(培养基的体积不应超过所盛容器量程的20%)，过夜培养。次日用树脂型TM质粒DNA提取试剂盒提取质粒，方法同前。'B、取上步提取的重组质粒，用Xbal和Kpnl进行双酶切，其中双酶切反应体系为20pl，具体见表6。表6双酶切反应体系(20^1)ddH206.3^110xTbuffer2単重组质粒10単Xbal(15i4iL)0.7^1Kpnl(10m4iL)l鄭lC、通过1%的琼脂糖凝胶电泳，再用硅胶膜型TMPCR产物(DNA片段)纯化试剂盒回收约1400bp的目的基因片段，方法同前。(2)原核表达载体质粒pIA(38双酶切大片段的回收A、挑取经过含有原核表达载体质粒pIA|38的单菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中(培养基的体积不应超过所盛容器量程的20%)，过夜培养。次日用树脂型TM质粒DNA提取试剂盒提取质粒，方法同前。B、取上步提取的原核表达载体质粒pIA[38，用XbaI和KpnI进行双酶切，其中双酶切反应体系为20^1，具体见表7。表7双酶切反应体系(20nl)ddH206.3^110xTbuffer2.0jxlpIAJ38质粒10単Xbal(15n4iL)Kpnl(10f4iL)C、通过1%的琼脂糖凝胶电泳，再用硅胶膜型TMPCR产物(DNA片段)纯化试剂盒回收约7900bp的目的质粒片段，方法同前。(3)植酸酶基因和原核表达载体质粒pIAp8的连接按照表8的反应体系，进行植酸酶基因与原核表达载体质粒pIAJ38的连接，，在T4DNA连接酶的作用下，16。C维持16-18h。表8连接反应体系(lOpl)ddH202単10xLigasebufferl.O(il回收目的基因片段5単质粒pIAp8l.O(xlT4DNALigasel.O(il(4)连接产物的转化A、从-8(TC取出感受态细胞，握于手心快速融化，立即置于冰浴上，将要转化的DNA片段加入到装有感受态细胞的离心管中(50pl感受态细胞需25ngDNA)，同时做阳性和阴性(不加DNA)对照，体积不应超过感受态细胞的5%，轻弹管壁，冰浴30min。B、取离心管在42'C水浴中预热，然后把混匀的感受态细胞和连接产物的混合物放入预热的离心管中，42。C热激恰恰90s，不要摇动。C、快速将离心管转移到冰浴中，冷却l-2min。D、每管加入80(VlLB或SOC培养基，轻轻混匀，然后放在己设置为37°C的摇床上，培养时间应大于50min，转速不要超过200r/min。E、取lOO)il转化菌液，涂布于含Amp、IPTG和X-gal的LB平板培养基上，放37。C至液体被吸收(30min)。倒置平板，于37。C培养，12-16h小时可出现菌落。(5)重组载体质粒的鉴定A、蓝白斑筛选取出平板于(C放置数小时使菌落显色。有重组质粒的细菌无p-半乳糖苷酶活性，菌落呈奶白色；而无重组质粒的细菌有P-半乳糖苷酶活性，菌落的中央呈淡蓝色，外周呈深蓝色。B、提取质粒从转化菌平皿中挑取白斑多个，另选少量蓝斑(1-3个)做对照，接种于含Amp的LB液体培养基中(培养基的体积不应超过所盛容器量程的20%)，过夜培养。次日用树脂型TM质粒DNA提取试剂盒提取质粒，方法同前。C、重组质粒的检测利用以上所挑选的重组克隆，通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测滞后质粒(图6)，再用XbaI和KpnI双酶切检测(图7)。检测重组成功的克隆，制备甘油菌。a、酶切鉴定用XbaI和KpnI双酶切鉴定阳性克隆，双酶切buffer为Tbuffer。双酶切反应体系为20pl，具体见表9。表9双酶切反应体系(20^1)ddH2011.3nl10xTbuffer2.0jxl质粒5単Xbal(15(j/jiL)0，Kpnl(10淋)l単37°C，酶切过夜，12-14h。反应结束后，取5^1酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。3结果与分析3.1植酸酶重组克隆的蓝白斑筛选将含有外源插入片段的pIA(38载体转入E.coliDH5a中。当外源DNA片段插入到pIA(38载体后，由于外源DNA的核苷酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物P-半乳糖苷酶a-片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色。因此，可通过蓝白斑筛选出含有外源插入片段的白色重组克隆(图5)。3.2植酸酶重组克隆的鉴定挑选重组克隆，提取质粒DNA，进行双酶切检测。提取的重组克隆质粒DNA和双酶切过的质粒通过1%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图6、图7。从图6中可看出，重组表达质粒DNA比阴性的滞后，对照DNAmarker重组克隆质粒DNA大约在10Kb左右，说明植酸酶基因片段已插入到原核表达载体pIA(38中。挑取几个重组表达质粒酶切之后，由图7可知，1，5和6重组表达质粒在1400bp处均有一条亮带，而在7.9Kb处条带均与7处原核表达载体pIAp8位置相一致，说明植酸酶基因磁切已插入到原核表达载体pIAf38上。三、植酸酶基因真核表达载体的构建1材料和方法部分参阅上面的"原核表达载体的构建方法"其不同点在于(1)扩增植酸酶基因所用的引物有别A、挑取经过鉴定的含有植酸酶基因的T质粒克隆载体单菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中(培养基的体积不应超过所盛容器量程的20%)，过夜培养。次日用树脂型T"质粒DNA提取试剂盒提取质粒，方法同前。B、根据真核表达载体pGAPZaA上的酶切位点重新设计了引物。如下上游引物P3:5，-ATGGGTACCCTGGCAGTCCCCGCCTCGAGA-3'勘"I下游引物P4:5，-CTATCTAGACTAAGCMAACACTCCGCCCAATC-3'勘I以上步提取的T质粒克隆载体为模板，加入引物、dNTPs、s-PfuDNAPolymerase、10Xbuffer及ddH20，旋涡振荡混匀后进行PCR扩增。反应体系为20ul。PCR反应条件:94。C预变性3min，然后94"C变性lmin，60°Clmin，72。C延伸2min，共30个循环，最后72'C延伸5min以补齐末端。(2)植酸酶基因和真核表达载体质粒pGAPZaA的连接按照表4的反应体系，进行植酸酶基因与真核表达载体pGAPZaA质粒的连接，连接反应在1.5ml离心管中进行，在T4DNA连接酶的作用下，16"C维持16-18h。2植酸酶真核表达载体重组克隆的抗生素筛选及重组克隆的鉴定挑选重组克隆菌落，培养提取质粒DNA，进行重组克隆PCR检测和双酶切检测。提取的重组克隆质粒DNA、PCR产物和双酶切过的质粒通过1%的琼脂糖凝胶电泳。对照DNAmarker重组克隆质粒DNA大约在4一5Kb之间，说明植酸酶基因片段已插入到真核表达载体pGAPZaA上。PCR检测，7个重组克隆质粒在1400bp处均有一条亮带。在酶切之后，1、2和6重组克隆质粒在1400bp处均有一条亮带，说明植酸酶基因确切已插入到真核表达载体pGAPZaA上。其操作方法参阅上面的"原核表达载体的构建方法"。四、植酸酶基因在不同表达载体中表达的酶活比较1材料1.1仪器设备紫外分光光度计，离心机，超净工作台，高速冷冻离心机，恒温摇床，消毒离心管，玻璃培养皿(直径90mra)，等。1.2菌种与质粒大肠杆菌DH5ct购自宝生物工程有限公司，表达载体pIAP8和pGAPZaA购自Invitrogen公司o1.3培养基(1)LB液体培养基(Luria-Bertani，LB):称取胰蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml的去离子水中，充分搅拌溶解。滴加5NNaOH调节PH值至7.0，加入去离子水将培养基定容至1L，在121。C、1.034X10Spa条件下高压下蒸汽灭菌20min,4。C保存。(2)LB固体培养基液体培养基中按2%体积比添加琼脂粉，同法高压蒸汽灭菌20min。待培养基温度降至5(TC时，加入抗生素等不耐热物质。然后直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。在培养基完全凝结后，倒置平皿4'C保存。(3)低盐LB液体培养基称取胰蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeastextract)5g，NaCl5g，溶于800ml的去离子水中，充分搅拌溶解。滴加5NNaOH调节pH值至7.0，加入去离子水将培养基定容至1L，在121°C、1.034X105Pa条件下高压下蒸汽灭菌20min，4。C保存。(4)低盐LB固体培养基低盐液体培养基中按2%体积比添加琼脂粉，同法高压蒸汽灭菌20min。待培养基温度降至5(TC时，加入抗生素Zeocin，浓度至100iig/ml。然后直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。在培养基完全凝结后，倒置平皿4'C保存。1.4溶液配制(1)生理盐水浓度是0.9%，称取0.9gNaCl，溶解在少量蒸馏水中，稀释到IOO毫升。(2)氨苄青霉素(Ampicillin，Amp):100mg/ml贮存浓度。溶解lg氨苄青霉素钠盐于足量的水中。最后定容至lOml。过滤除菌，小份分装(lml/份)后，-20。C保存。工作浓度100ug/ml。(3)抗生素Zeocin:购买时为100mg/ml贮存浓度，-2(TC保存。工作浓度100ug/ml。2方法和步骤2.1将已转植酸酶基因于表达载体pIAP8和pGAPZaA的菌种，分别挑取5个菌落接种于100ml的LB液体培养基和低盐LB液体培养基中，37'C,100r/min摇床培养34d。2.2培养期间按24h时间间隔，分别从三角瓶取出2份4ml的菌液，置于5ml的离心管中，13000r/min，离心2min，一份(取菌液前应称量离心管的重量)取其上清液测定植酸酶酶活并保留菌体沉淀，用滤纸尽量吸干管壁上的液体，再放置烘箱65'C，烘烤12h至恒重，从烘箱取出后放入干燥器中半个小时，进行称重。另一份离心后弃取上清液，留有菌体沉淀，用滤纸尽量吸干管壁上的液体，用液氮冷冻浸泡处理后，进行研磨，(研磨的菌体不要有损耗，应尽量溶解在生理盐水中)，粉碎后加入等体积于离心前菌液体积4ml的生理盐水，混匀后，取混合液测定植酸酶酶活。按以下时间点分别取培养物24h，48h,72h,96h，120h。当某个时间点酶活达到高峰，而后降低至接近0时，停止测定酵活。2.3植酸酶酶活的测定酶活定义为每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1^mol的无机磷为一个酶活单位(U)。具体步骤见下表IO。表10植酸酶活性测定操作程序空白组试验组取样品液500nl，室温放置取样品液500yl，37。C放置5min加入lml15%TCA混匀加入500ulP/。植酸钠混匀准确反应15min准确反应15min再加入500w11%植酸钠混匀再加入lml15%TCA混匀取上层反应液200ul,加入1.8ml取上层反应液200加入1.8ml去离子去离子水和2ml显色液，混匀水和2ml显色液，混匀50。C反应20min50。C反应20min取出室温放置15min，测定取出室温放置15min，测定2.4利用SDS-PAGE电泳检测两种基因重组表达载体分别在大肠杆菌中表达的植酸酶蛋白，方法同前。2.5数据处理试验数据以平均值Meani标准差SD表示，采用SAS(8.0)统计软件STAT模块中的ANOVA过程对各数据进行方差分析和D皿can氏多重比较。3结果与分析3.1两种植酸酶基因重组表达载体分别在大肠杆菌中表达的植酸酶酶活比较由图8看出含有pIA(38-phyA重组表达载体的菌体被液氮冷冻处理，研磨后释放出的酶活明显高于生长时期分泌到胞外的酶活(P<0.05)，胞内酶活和胞外酶活的最大值分别是2.31和9.04U/ml;而含有pGAPZaA-phyA重组表达载体的菌体分泌到细胞内酶活明显高于释放到胞外的酶活(P<0.05)，胞内酶活和胞外酶活的最大值分别是8.04和2.93U/ml。含有pIAp8-phyA重组表达载体分泌到胞内的酶活整体上明显高于pGAPZaA-phyA重组表达载体分泌的胞内酶活20(P<0.05)，可得出pIA(38-phyA重组表达载体可分泌表达胞内植酸酶；而pGAPZaA-phyA重组表达载体分泌到胞外的酶活总体上明显高于pIAp8-phyA重组表达载体分泌到胞外的酶活(P<0.05)，得出pGAPZaA-phyA重组表达载体可分泌表达胞外植酸酶。3.2两种植酸酶基因重组表达载体分别在大肠杆菌中表达的胞内植酸酶酶活比较由图9中看出两种植酸酶基因重组表达载体分别在大肠杆菌中表达，在干细胞中的植酸酶酶活二者比较差异不显著(P>0.05)。3.3种基因重组表达载体分别在大肠杆菌中表达的植酸酶蛋白检测从图10中看出两种基因重组表达载体分别在大肠杆菌中表达出了植酸酶蛋白，在54.61KDa处均有条带，也与商品植酸酶的位置相当。五、植酸酶基因乳酸菌中高效表达及酶学分析1材料1.1仪器设备紫外分光光度计，离心机，高速冷冻离心机，恒温隔水培养箱，超净工作台，酸度计，高压灭菌锅，离心管，玻璃培养皿，电机转化仪，微型凝胶电泳装置等。1.2菌种和质粒菌种为乳酪杆菌(Lactobacilluscasei)，质粒载体为pIA卩8。1.3酶与试剂酵母粉，胰蛋白胨，葡萄糖等均为进口分析纯，蔗糖，MgC12，KH2P04,乙酸钠，柠檬酸钠，吐温(80)，硫酸镁等均为国产分析纯，树脂型TM质粒DNA提取试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司。1.4培养基1.4.1LB液体培养基(Luria-Bertani，LB):称取蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml的蒸馏水中，充分搅拌溶解。滴加5NNaOH调节pH值至7.0，加入蒸馏水将培养基定容至1L，在121°C、1.034xl05Pa条件下高压下蒸汽灭菌20min，4T:保存。1.4.2MRS液体培养基胰蛋白胨10g，牛肉蛋白胨10g，酵母浸出物5g，葡萄糖20g，吐温(80)lml,磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸钠2g，硫酸镁200mg，硫酸锰50mg，定容至1L，pH为6.2-6.6。再按每5ml分装到厌氧管中，通入C0215min，拧紧盖子。在121°C、1.034xl05Pa条件下高压下蒸汽灭菌20min，4'C保存。1.4.3MRS固体培养基在厌氧管中加入60mg琼脂粉，通入C02lmin，添加3ml上述'MRS液体培养基，再通入C0210min。拧紧盖子。在121°C、1.034xl05Pa条件下高压下蒸汽灭菌20min,4'C保存。1.5溶液配制氯霉素(100^ig/ml):量取0.01g氯霉素放入灭菌离心管中，加入50(^1纯无水乙醇，摇勻溶解后，再加入50(^1灭菌去离子水，再用滤菌膜过滤除菌。配制好的100pg/ml氯霉素分装，—20'C保存。电转化缓冲液0.4mo比蔗糖，l讓ol/LMgC12，5mmoM^KH2P04,pH6.0。称取68.458g蔗糖，0.10165gMgC12，0.34025gKH2P04放入烧杯中，加入400ml去离子水，再移至500ml容量瓶中定容至500ml，在121°C、1.034xl05Pa条件下高压下蒸汽灭菌20min,4'C保存。15%三氯乙酸(TCA):称量176.5g的TCA放入烧杯中，加800ml的去离子水搅拌充分溶解，再定容至1L。0.2M拧檬酸钠称量5.882g的柠檬酸钠放入80ml的去离子水搅拌充分溶解，再定容至100mL。0.2M柠檬酸称量4.2028g的柠檬酸放入80ml的去离子水搅拌充分溶解，再定容至100mL。0.2M拧檬酸-柠檬酸钠缓冲液:量取一定量的0.2M拧檬酸钠溶液，再用0.2M柠檬酸去调pH值至5.5。1%的植酸钠称量lg的植酸钠放入烧杯中，加70ml的0.2M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液搅拌充分溶解，溶解后再用0.2M柠檬酸调pH值至5.5，再定容至100mL。lmoVL硫酸量取56.8ml浓硫酸通过玻璃棒引流到1L广口瓶中，慢慢搅拌混匀，室温保存。2.5%钼铵酸称量12,5g钼铵酸放入烧杯中，加入400ml去离子水，再定容至500ml，室温保存。10。/o维生素C(Vc):称量50gVc放入烧杯中，加入400ml去离子水，再定容至500ml，4'C保存。显色液(现用现配)lmol^硫酸2.5%钼铵酸10。/()维生素C(Vc)=3:1:1，三者按以上体积比配制。2方法和步骤2.1原核表达载体质粒pIAp8的提取挑取经过含有原核表达载体质粒pIA|38的单菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中(培养基的体积不应超过所盛容器量程的20%)，过夜培养。次日用树脂型TM质粒DNA提取试剂盒提取质粒。其材料和方法见前几章。2.2乳酸杆菌感受态细胞的制备(1)挑取乳酸杆菌单菌落，在3mlMRS培养基中37°C，静止培养12_16h。(2)将过夜培养物按l:50比例稀释，37°C，静止培养3.5—4.0h，使培养物OD600达到0.5左右。(3)立刻取出培养物放入冰中冰浴，并摇动培养瓶，使培养物冰浴均匀，4'C，6000r/m，离心15min,无菌条件下弃去上清。(4)用等体积的预冷电转化缓冲液重悬两次,在4'C，6000r/m条件下,离心15min，无菌条件下弃去上清。(5)最后加入1/100原培养物体积的电转化缓冲液。再每80^1分装于PCR小管中，一2(TC保存，且在一天之内使用。2.3重组植酸酶基因原核表达载体在乳酸杆菌中的电击转化及转化后培养(1)取80W制备的乳酸杆菌感受态细胞置于冰上溶解，将5—10[il重组植酸酶基因原核表达质粒载体加入其中，混匀。(2)取电击杯置冰上冰浴，把上述混合物移入杯中，冰浴15min。G)取出电击杯，电击之前把杯外水珠擦拭干净，按以下参数电击(1.7kvand2.0kv,400Q,256msec,0.2cm。(4)电击完毕后，迅速从电击槽中取出电击杯，并加入500—1000pl的MRS培养基。在无菌条件下转入到1.5ml离心管中，37°C，静止培养1—2h。(5)用lml注射器吸取IOOW，200^1，300nl，400|il，接入到含有氯霉素的MRS固体培养厌氧管中，37°C，静止培养l一2d。另接种至不加氯霉素的MRS固体培养基作为对照。2.4电击转化后的鉴定2.4.1植酸酶活力的测定2.4丄1细胞外酶活力的测定(1)将3-5ml菌液13000r/min离心lmin收集上清液。(2)在两个玻璃试管中分别放入500^1，设为空白组和试验组。(3)细胞外植酸酶活性的测定的结果如图11、12所示。注转化后共生长出四个菌落，其中1、3经检测有酶活。图ll对应的为1号酶活力，图12对应的为3号的酶活力。2.4.1.2细胞内酶活力的测定(1)去转化后的乳酸杆菌培养液1mL，13000r/m条件下离心2min;23(2)弃取上清液，用滤纸吸干液体，用液氮处理后将其转移至研钵中，再在研钵中加入液氮并快速研磨；(3)在研钵中加入5mL的生理盐水，待其充分溶解后，按植酸梅活力测定方法测定其活力。(4)细胞外植酸酶活性的测定的结果如图13、14所示。2.5乳酸杆菌最佳收获时间的确定2.5.1乳酸杆菌培养基pH的测定(1)每隔24h取乳酸杆菌培养液3mL用酸度计测定培养基的pH值。如图15所示2.5.2培养基光密度的测定(1)用培养乳酸杆菌的空白培养基作为空白对照，并调零点；(2)每隔24h取乳酸杆菌培养液3mL，加入比色皿中，在600nm下读取吸光度值，若吸光度值大于1,可用空白培养基稀释至1以下，之后再在600nm下读取吸光度值。培养基不同时间的光密度值如图16所示。2.5.3干细胞重的测定(1)先将离心管在65X:条件下，烘干至恒重，编号并纪录离心管的重量；(2)每隔24h用移液枪准确量取1mL的培养基，在13000转/分的条件下离心2min;(3)弃取上清液，留沉淀，开盖在65。C条件下，烘干至恒重；(4)称量此时的离心管重，减去上一天的重量，即为24h的干细胞重。培养基不同时间的干细胞重如图n所示。2.5.4上清液植酸酶活力的测定'(1)将3-5ml菌液13000r/min离心lmin收集上清液。(2)在两个玻璃试管中分别放入50(^1，设为空白组和试验组。(3)细胞外植酸酶活性的测定的结果如图18所示。权利要求1、一种重组植酸酶基因表达载体，其特征在于该重组载体为pIAβ8-phyA。2、一种重组植酸酶基因表达载体，其特征在于该载体是由在载体质粒pIAp8上插入基因序列如Ref,EF206311所示的植酸酶基因构建的。3、一种转植酸酶基因乳酸杆菌，其特征在于它是按下述方法构建成的将权利要求1所述的重组植酸酶基因表达载体通过电击转化进入乳酸杆菌中，收获高效表达植酸酶的转基因乳酸杆菌。4、一种在乳酸杆菌中高效表达植酸酶基因的方法，其特征在于将权利要求1所述的重组植酸酶基因表达载体通过电击转化进入乳酸杆菌中，收获高效表达植酸酶的转基因乳酸杆菌。全文摘要本发明公开了一种重组植酸酶基因表达载体，该重组载体为pIAβ8-phyA，是由在载体质粒pIAβ8上插入基因序列如Ref.EF206311所示的植酸酶基因构建的。本发明构建的pIAβ8-phyA重组表达载体，可通过高压电击转化进入乳酸杆菌中，并大量复制，从而能分泌大量的植酸酶。转基因的乳酸菌通过饲喂动物，将长期寄居在动物(主要指猪禽)胃肠道内并分泌植酸酶，起到益生菌和酶制剂的双重作用。这对于抗生素的替代、畜产品的安全生产以及环境保护都具有特别重要的意义。文档编号C12N15/63GK101463360SQ20081004916公开日2009年6月24日申请日期2008年1月28日优先权日2008年1月28日发明者华冯,尹清强,左瑞雨,玲路,郑秋红申请人:河南农业大学