专利名称：：Mx1基因作为猪生产性状的遗传标记及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于猪遗传(分子)标记辅助选择领域，具体涉及一种与猪生产性状关联的遗传标记的筛选及其应用。
背景技术：
：根据生产性状的表型值估算出育种值进行动物育种，己经大大促进了家畜生产性状的遗传改良。九十年代以来，随着分子生物学技术的发展以及在猪育种中的应用，逐步出现了以分子标记为核心的分子标记辅助选择和分子标记渗入等分子育种技术，这些技术与常规育种技术相结合大大加速了猪育种的进程，能够应用于分子标记辅助选择的基因或标记必须对目标性状具有较大的贡献率，即主基因或标记，因此寻找这些主基因或与之紧密连锁的分子标记成为分子标记辅助选择的基础和前提，也是当前和今后一段时间猪分子生物学领域研究的重点和急需解决的问题。目前巳有多个位于功能基因的内部与生产性状紧密连锁的分子标记被发现并申请专利，例如在传统的猪育种计划中，由于消费者对瘦肉的兴趣，因此主要选择降低脂肪，降低脂肪主要以降低背膘厚来衡量，然而背膘厚下降同样导致了肌内脂肪的卜降，脂肪最后沉积的部位是肌肉，导致了肌肉品质的下降。由于肌内脂肪是难以在活体测量，并为了防止肌内脂肪的进一步下降，必须找到影响此性状的分子标记。Gerbens等证实了位于猪6号染色体上的心脂肪酸结合蛋白与肌内脂肪含量和其它生产性状的关系，该基因已被申请专利，专利号为W097/35878，另夕卜，Rothschild等发现Leptin受体基因与瘦肉率有关的分子标记，其专利号为U.S.Pat.Nos.5972621。MX蛋白是由Lindenmann等在研究近交系A2G小鼠对流感病毒具有天然免疫力这一现象时发现，并命名的一种GTPase结合蛋白，主要对RNA病毒敏感，具有抗流感病毒功能(LindenmannJ,LaneCA,HobsonD.TheresistanceofA2Gmicetoorthomyxoviruses.JImmunol,1963，90:942—951)。体内外试验研究表明，皿基因受I型干扰素、双链RNA的诱导或在病毒感染的情况下被激活，表达MX蛋白发挥GTP酶活性水解病毒核衣壳，抑制病毒复制，以抵抗病毒对细胞的感染。猪AQ7基因定位于第13号染色体上与干扰素受体l基因紧密连锁，包含一个663个氨基酸碱基的开放式阅读框，与人和鼠的MW基因相似(RettenbergerQBruchJ，FriesR，ArchibaldAL，HameisterH.Assignmentof19porcinetypeIlocibysomaticcellhybridanalysisdetectsnewregionsofconservedsyntenybetweenhumanandpig.MammGenome,1996,7(4):275—279)。MXl基因是迄今为止找到的为数不多的抗性基因或抗性标记之一，猪的生产性能受疾病感染和遗传机制双重因素影响，如果猪对某种疾病只有部分抗性，则其生产性能下降程度由抗性程度和感染程度决定。目前对抗病力、免疫应答能力与生产性能之间的关系研究结果有一定的差异。例如'Meeker等(MeekerDL,RothschildMF,ChristianLL,WarnerCM,HillHTGeneticcontrolofimmuneresponsetopseudorabiesandatrophicrhinitisvaccines:I.Heterosis,generalcombiningabilityandrelationshiptogrowthandbackfat.JAnimSci.1987，64(2):407-413)发现生长速度与接种了支气管败血巴氏杆菌商品疫苗或伪狂犬病毒疫苗后的免疫应答呈负相关，猪的SLA与生长、背膘和繁殖性状间的联系多呈正相关。本发明提供了抗病基因MY7基因第八内含子内的遗传变异与胴体和肉质性状间的关系。
发明内容本发明的目的在于克隆一个与猪生产性状关联的遗传标记，该遗传标记是从猪MX1基因序列克隆得到的一段特异DNA片段，已知猪MX1基因是调控疾病性状的，而本发明则是与猪生产性状关联的，是一个与猪生产性状关联的新的遗传标记，同时本发明还涉及该遗传标记的制备方法及应用。本发明通过下列技术方案实现一种筛选的与猪生产性状关联的遗传标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:l所示。其中序列表SEQIDNO:1的第167bp处有一个A167—G167的突变，导致HpaII—RFLP多态性。其中检测所述碱基突变的引物对的DNA序列如下所示正向引物F:5'TTACAGAAGTATGGCTCCG3',反向引物R:5'TTGGTAAACAGCCGACAC3'。一种筛选适用于与猪生产性状关联的遗传标记的方法，按照以下步骤-从猪血液中提取基因组DNA，根据猪MW基因序列设计引物，得到的引物序列如下正向引物F:5'TTACAGAAGTATGGCTCCG3',反向引物R:5'TTGGTAAACAGCCGACAC3'。用所示的引物在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR产物纯化克隆测序，获得如如序列表SEQIDNO-l所示的核苷酸序列，其中包含A167—G167的突变。本发明进一步提供了利用邵a11—RFLP不同基因型个体与生产性状间的关联分析中的应用。本发明的具体实施方案见《具体实施方式》所述。序列表SEQIDNO:1是本发明克隆的外来品种"大白猪"的核苷酸序列；图l:是外来血缘猪大白猪、长白与和中国血缘猪通城猪和清平猪MW基因序列比对结果和SNP位点；图2:是猪MO基因第8内含子扩增结果；琼脂糖浓度为1.5%;图中泳道M为DL2000Marker;泳道1一4分别为大白猪、长白猪、通城猪和清平—猪中的扩增片段，片段大小为563bp。图3:猪MXl基因i^"II一RFLP检测结果。琼脂糖浓度为1.5%;图中泳道M为DL2000Marker;AA基因型'339bp，224bp;AB基因型'339bp'224bp，174bp，165bp;BB基因型，224bp，174bp,165bp。具体实施例方式实施例1猪iJ/A7基因片段的获得及多态性检测方法的建立选择外来血缘猪"大白猪""长白猪"和中国地方血缘猪"通城猪"和"清平猪"为试验材料根据必17基因的基因组序歹lJ(GenBank登陆号DQ144503)设计以下引物正向引物F:5'TTACAGAAGTATGGCTCCG3'，反向引物R:5'TTGGTAAACAGCCGACAC3'。用上述引物对在大白猪、长白猪、通城猪和清平猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系25UL，体系中各组分的浓度为50ng模板DNA、1XT叫buffer2.5mmol/L、1.5mmol/LMgC12、2.5mmol/LdNTPs、0.5mmol/LPCRprimers、2UTaqDNA聚合酶(MBI)，PCR的运行程序如下预变性94°C4min;94。C45s，59°C40s,72°C40s，35个循环；最后72。C继续延伸10min。对上述四个猪种的PCR产物经GelExtractionKit试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限公司，按照试剂盒说明书操作)纯化、克隆测序。上述扩增片段的人小为563bp，序列经ClusterW软件进行序列比对，其中位于该片段167bp处(位于第8内含子中)A/G变异引起了/^alI酶切位点(C'CGG)多态。取5uLPCR产物加入限制性内切酶0.5uL(IOU/uL),10Xbuffer1nL，ddH203.5uL,置37。C恒温反应过夜，后经1.5。/。的琼脂糖凝胶凝胶电泳分析，在凝胶成像系统观察并记录酶切分型结果。当167bp处的碱基都为A时/f/7alI不识别该位点，记为AA型(339bp+224bp),当突变位点碱基都为G时fl^a11酶识别该位点，记为BB型(224bp+174bp+165bp)，当G和A都存在时记为AB型(339bp+224bp+174bp+165bp)。猪MO基因的PCR--RFLP的酶切分型结果如图3。实施例2本发明克隆的遗传标记在不同猪群中的多态性分布检测在四个中国猪种(梅山、通城、清平、鄂西黑猪)和两个国外猪种(大白、长白)检测猪MW基因第8内含子PCR-i^alI-RFLP多态性分布频率，检测结果如表l所示。在六猪种中基因型频率和基因频率无明显差异，BB基因型占优势，在梅山猪群体中只有BB基因型；等位基因B的的频率较高，在人白、长白、梅山、通城、清平、鄂西六个品种中等位基因的频率分别为0.83、0.89、1.00、0.94、0.87、0.89。表likO:/基因第8内含子g/;3n酶切多态在不同品种中的分布结果IIH#n,等位基因频率品种数量基因型GenotypeAllelefrequencyBreedNumberAAABBBAB大白LargeWhite383(0.08)7(0.18)28(0.74)0.170.83长白Landrace321(0.03)(0.16)26(0.81)0.110.89梅山Meishan300(0,00)0(0.00)30(1.00)01.00通城Tongcheng241(0.04)1(0.04)22(0.92)0.060.94清平Qingping28(0.07)3(0.11)23(0.82)0.130.87鄂西Exi352(0.06)4(0.11)29(0.83)0.110.89实施例3本发明克隆的遗传标记与猪生产性状的关联分析及应用为了确定猪il^W基因多态性与猪表型性状是否相关，选择280头大白x梅山F2代资源群体为试验材料，采用实施例1所建立的i/戶II-RFLP方法进行多态性检测,采用SAS统计软件((SASInstituteInc,Version8.0)glm程序进行单标记方差分析，分析猪基因i/戸II-RFLP不同基因型与猪生产性状的相关关系，同时采用reg程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为模型~，+6r+6妙J^He种为性状表型值，p为平均值，G,为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用-l，0和1分别代表AA，AB和BB基因型，显性效应用1，-1和1分别代表AA，AB和BB基因型)；S、K为固定效应，分别为性别、年度效应，6#为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰体重为协变量，肉质性状以屠宰日龄为协变量，^为残差效应。由表2可以看出/^alI-RFLP基因型不同时，屠宰率、瘦肉率、眼肌高存在显著差异，该位点在屠宰率、眼肌高表现为加性效应，加性效应值分别为0.689±0.374和-0.399±0.155;眼肌高和瘦肉率表现为显性效应，显性效应分别为-0.208±0.123和-0.56±0.233。表2猪MA7基因第8内含子PCR-及/;aZr-RFLP基因型与胴体和肉质性状的统计分析表^0^01-77戸//-虹0>基因型(n±SE)基因效应(n±SE)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><110〉湖北省农业科学院畜牧兽医研究所〈120〉^i7基因作为猪生产性状的遗传标记及应用<130><141>2008-08-22〈160〉1<170>Patentlnversion3.1〈210〉1〈211>563<212>腿〈213〉猪(Susscrofa)〈220〉<221〉gene<222>(1)..(563)<223>〈220>〈221>primer—bind<222>(l)..(19)〈223〉<220>〈221>primer—bind<222>(546)..(563)<223><220>〈221>mutation〈222>(167)..(167)<223〉〈400〉1ttscag肌gtatggctccgat8ttCC3g3gg3tg3卿Cggg卿atgttttttctgata60g3tgtgsgtgctgcc鄉ggcgcc犯ggtggagaagcatccaccattgtcC3g卿gggg120ccatgtgctttgcacgtgtctcgcttcattcccctcaggctg3tCC3g3Ctcatgctgcc180cacttagcccC3C卿gCggcc鄉ttgggggCtgggt3g3C￡Lggg3gtgggggaccgtc240ccattcacgccactggctcttcatc犯gtgcgctcacctggcagtaggga300gggtgggattgcctgctgccaaagcccctgctctccctccggacgcgcacctgctcccca360cccgcaccctgcccsttaggggctcgccagccctgtctgcaccctctcca420aatcacctcttatatttgcaatatttccgcttatacgaatgtgtttcctt480atcgatgcattt犯tsgtgatatcactgctg卿gg獄tggtggtggag540tacgagtgtcggctgtttacC3￡l56权利要求1、一种筛选的与猪生产性状关联的遗传标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。2、根据权利要求1所述的遗传标记，其特征在于，序列表SEQIDNO:1第167bp处有一个A167—G167的突变，导致i7戸n—RFLP多态性。3、检测权利要求2所述碱基突变的引物对的DNA序列如下所示正向引物F:5'TTACAGAAGTATGGCTCCG3'，反向引物R:5'TTGGTAAACAGCCGACAC3'。4、一种筛选适用于猪生产性状关联的遗传标记的方法，按照以下步骤从猪血液中提取基因组DNA，根据猪MH基因序列设计引物，得到如权利要求3所示的引物，用权利要求3所示的引物在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR产物纯化克隆测序，获得如如序列表SEQIDNO:l所示的核苷酸序列，其中包含A167—G167的突变。5、权利要求1或2所述的遗传标记在猪标记辅助选择中应用。全文摘要本发明属于猪遗传标记制备
技术领域：
，具体涉及一种猪生产性状基因MX1第八内含子突变位点多态性检测方法及作为猪生产性状遗传标记的克隆和应用。从猪血液中提取基因组DNA，设计引物PCR扩增，克隆测序获得563bpDNA序列，序列比对分析发现在序列表SEQIDNO1第167bp处有一个A167-G167的突变，导致HpaII-RFLP多态性。利用该遗传标记，在不同猪群中检测了该标记基因的基因型频率和基因频率及与猪生产性状的关联分析，表明该遗传标记与猪某些重要生产性状存在显著相关。本发明公布了猪MX1基因第八内含子的SNP分型检测技术，为猪的标记辅助选择提供了新的标记和检测方法。文档编号C12N15/12GK101353700SQ200810048949公开日2009年1月28日申请日期2008年8月22日优先权日2008年8月22日发明者政冯,刘贵生,华孙,宋忠旭,彭先文,李明波,李良华,梅书棋,武华玉,锐郭,郭万正,黄京书申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所