一种新的rna干扰载体的构建与筛选方法

专利名称：一种新的rna干扰载体的构建与筛选方法
技术领域：
本发明涉及的是生物基因克隆表达技术，特别是一种快速、高效、高通量 构建动植物RNA干扰(RNA interference ，RNAi)载体的方法。特别适合用于大 规模地构建针对动植物各个基因的RNA干扰单元，用于动植物基因的功能研究， 而且筛选方便快捷。
背景技术：
RNA干扰是指在正常生物体内，由双链RNA引起同源mRNA的特异性降 解，从而抑制相应基因表达的过程。它是一种转录后水平基因沉默，在生物体 内普遍存在。随着研究者对生命现象研究的深入，RNA干扰技术因其高特异性、 高效率、操作简便、重复性好，已经成为当今动植物基因功能、基因治疗、药 物靶点筛选与鉴定、植物代谢以及细胞信号传导通路等研究中的重要手段之一。
归纳起来，现行的RNA干扰载体构建方法主要有以下三种①寡核苷酸退 火法。由化学合成的部分互补、含有干扰目的基因的靶序列的两条寡核苷酸单 链，在离体条件下退火形成双链DNA，退火产生两端突出的粘性末端，能与处 理好的载体的突出末端互补，经连接转化后，得到含有RNA干扰表达单元的重 组质粒。化学合成的寡核苷酸通常为反向重复序列，这样转录得到的单链RNA 能够回折互补配对，形成茎环结构，在细胞内经处理后形成小干扰RNA(siRNA) 而引发RNA干扰效应。②PCR扩增法。构建动物细胞RNA干扰载体时，先设 计一对扩增控制RNA干扰单元表达的启动子的PCR引物，正向引物与启动子 特异性匹配，反向引物5'末端额外加上针对目的基因的干扰靶序列，将PCR产 物克隆到相应的载体上，得到表达RNA干扰单元的载体。构建植物人工微 RNA(miRNA)表达载体时，先按照需要设计三对引物，进行三轮独立的PCR， 获得的三种PCR产物分别含有待干扰的目的基因的靶序列、miRNA的环序列 以及待干扰的目的基因靶序列的互补序列；然后采用重叠延伸PCR的方法将获 得的三种PCR产物拼接成完整的人工miRNA茎环结构序列，再将其克隆到植 物双元载体上。采用PCR方法构建植物人工miRNA载体的另一种方式是先设 计并合成一对引物，引物5'端为额外添加的酶切位点与目的基因的干扰耙序列 或其互补序列，3'端为与骨架miRNA中的环序列退火区域，获得的PCR产物经酶切回收后克隆到载体上。③寡核苷酸退火延伸法。化学合成两条部分互补 的寡核苷酸单链，在非互补的单链区域分别含有干扰目的基因的靶序列及其互
补序列,在特定条件下使两条单链退火，然后延伸形成完整的小双链DNA分子， 经酶切处理后克隆到载体上。
以上方法虽然能够成功构建各种RNA干扰载体，但是明显存在不足，主要 表现在以下几个方面:
一、 步骤繁琐，克隆效率低。以上三种方法都需要对克隆的目的片段和载 体进行特殊处理，需要目的片段与载体的连接反应。方法①需要化学合成的两 条寡核苷酸单链体外退火，得到的产物需要纯化处理，然后与处理好的载体连 接反应。由于待克隆的目的片段通常小于100bp，因此难以纯化，得率低，而且 获得正确的重组质粒较困难，假阳性率高。方法②需要在PCR引物中加上针对 靶基因的干扰序列，通常需要长引物(通常大于70nt)或者多轮的PCR扩增反 应，扩增后的PCR产物也需要酶切纯化，然后与处理好的载体进行连接反应； 方法③中两条寡核苷酸单链退火延伸得到的产物必须经过复杂的回收纯化、酶 切纯化等步骤后，才能克隆到相应载体。方法②③不仅花费时间，工序繁琐， 而且载体连接上非目的片段或自连的几率很高，使后续的筛选鉴定过程复杂化。
二、 不适合高通量的操作。
以上三种方法中的待克隆片段都需要预先纯化处理，都依赖于载体与外源 片段的连接反应，这对于构建单个或少数RNA干扰载体可能可行，但是对于大 规模地构建RNA干扰载体来讲却非常困难，而且效率低下。方法①和②中使用 的寡核苷酸单链通常为60-100nt,合成这样的寡核苷酸单链不仅实验成本高，而 且碱基合成错误率高，进而大大增加了后续的筛选工作量，费时费力。方法② 和③中的外源片段都需要经过复杂的双酶切、回收纯化等步骤，因外源片段一 般都较小(200bp以内)，回收纯化效率较低，这两种方法不仅实验成本昂贵， 而且后续筛选困难，工作量大。
(参见刊物"RNA. 2002 8:1454-1460"; "Plant Cell. 2006 May; 18(5): 1121-33.，，； "Nat Biotechnol. 2006 Nov;24(ll):1420-8. "; "Physiol Genomics. 2007 Nov 14;31(3):554-62."参见网页www.invitrogen .com或Invitrogen公司产品目录)

发明内容
本发明的目的是提供一种新的RNA干扰(RNAinterference,RNAi)载体的
构建方法。该方法主要包括载体的改造、含有干扰靶序列的DNA序列的产生和将上述含有干扰耙序列的DNA序列克隆到载体三个部分。该方法不需要订购 长度大于60nt的引物，不需要对PCR产物进行复杂的酶切纯化处理，而是依赖 载体和外源片段连接重组，从而产生完整的fecrO序列(乳糖操纵基因)，在/^+ 的大肠杆菌菌株中凭借蓝白斑筛选判断重组子。其筛选方法方便、直观、快捷、 高效，得到的重组子不需进行方向鉴定。 本发明中构建RNA干扰载体的具体方法为
一) 载体的改造
首先选定一 目标载体，将该载体上已经存在的万> I (或fiyn)位点以及/acO 序列进行诱变，诱变后的载体不再含有^/"I (或Byn)位点以及/"cO序列。然
后在载体的多克隆位点处引入两端带有B/"i (或5yn)位点以及一端带有部分
/"cO序列的填充片段(如抗性基因、妳等)。
二) 含有干扰靶序列的DNA序列的形成(具体过程见图1) 根据RNA干扰载体种类的不同，采取不同的方法完成该步骤
1) 针对siRNA载体、shRNA载体，首先设计一对包含靶序列的引物，该 引物3，末端含有长度为9-20nt彼此同源的序列，其中一条引物5，端额外加上/oc:O 的部分序列(与载体上的部分/flcO序列正好重构成完整的/"cO序列)，利用具 有末端转移酶活性的耐热DNA聚合酶(具体为TaqDNA聚合酶、ExDNA聚合 酶、LA DNA聚合酶等，下同)使两条引物退火延伸，得到的产物即为所要的 序列(详见图1A);
2) 针对人工微RNA (artificial microRNAs，amiRNAs)载体，首先以出发微 RNA (microRNA， miRNA)的3'端侧翼序列为模板，设计一条通用引物(若3' 端侧翼序列较短，则不需要通用引物)，该引物的5'端额外加上/acO的部分序 列(与载体上的部分/acO序列正好重构成完整的/acO序列)，然后根据出发 miRNA环序列长短不同，又分为以下两种情况
a) 当环序列较短(通常30nt以下)时，设计一对包含靶序列的引物，其3' 末端分别带有部分环序列(两部分环序列可重构成完整的环序列)，且使该引物 3'末端序列彼此部分(通常为9-20nt)同源，其中与出发miRNA 3'端退火的那 条引物5'端与上面设计的通用引物含15-20nt同源序列(若出发miRNA3'端 侧翼序列较短，则不需设计该同源部分)，利用具有末端转移酶活性的耐热DNA 聚合酶使该对引物以及通用引物三者相互退火延伸，得到的产物即为所要的序 列(详见图1 B);
b) 当环序列较长(通常30nt以上)时，设计一对包含靶序列的引物，其3'末端分别带有可以和出发miRNA的环序列退火的部分序列，其中与出发miRNA 3，端退火的那条引物的5'端与上面设计的通用引物含15-20nt同源序列(若出发 miRNA3'端侧翼序列较短，则不需设计该同源部分)，以含有相应环序列的 DNA序列为模板，用上述设计的三条引物(一对特异引物和一条通用引物)和 具有末端转移酶活性的耐热DNA聚合酶进行PCR，得到的产物即为所要的序列 (详见图1C);
三) 载体与外源片段的连接转化
首先将步骤一)中改造好的载体经^/i/i (或丑yn)完全酶切，得到3'端突
出一个碱基的线性载体DNA分子，所得的线性载体经回收纯化，然后与纯化过 的步骤二)中获得的含有靶序列的PCR产物进行连接，转化大肠杆菌菌株 DH10P，涂布含lOO^g/ml氨苄青霉素(或其它抗生素)以及30ng/ml X-gal的 LB固体培养基，37 。C培养12-16小时，呈现蓝色的菌落即为重组子。
四) 含有耙序列的RNAi表达单元克隆到植物双元表达载体上 对于可以直接用于步骤一)改造的RNAi载体(如动植物细胞中用于瞬间
检测的RNAi表达载体)则可省略该步骤。对于不能或不方便用于步骤一)直 接改造的植物双元表达载体，可先选择一个比较小的克隆载体按步骤一)进行 改造(如pBluescript SK 、 pMAGIC等)，然后通过酶切连接、Gateway重组克 隆以及接合转移等方法将RNAi表达单元克隆到植物双元表达载体上。
本发明的基本原理是①1Is型限制性核酸内切酶5/"I(或^n)的识别序 列中均含有一定数量的可变碱基，且双链DNA经该酶切割后会在3，末端突出一 个碱基；②带有完整/^0序列的载体导入/^+的大肠杆菌菌株后，载体上的 /wO位点由于竞争性结合菌体中的Lacl阻遏蛋白而使得菌体中的Lac操纵子表 达开启，表达的卩-半乳糖苷酶因分解半乳糖类似物X-gal而使得菌落呈蓝色。根 据以上两个原理，我们将某特定载体改造成携带一填充片段(如抗性基因、 她等)的载体，填充片段两端分别带有一个B>I (或断I)酶切位点，同时， 在其中的一个丑>1 (或5力1)位点附近带有/"cO的部分碱基序列，/mO的剩余 碱基序列在外源片段的末端，只有外源片段按照正确的方向连接到载体上，才 能构成完整的/"cO序列，进而筛选出重组子。
本发明所述的或限制性核酸内切酶，还包括所有酶切后的DNA具 有5'端突出特点的lis型限制性核酸内切酶。
本发明与现有技术相比具有明显的优势
一、本发明中，在改造后的载体中插入了易于筛选的填充片段(如抗性基因、她等)，经B/"I (或必力I)酶切后填充片段丢失，这样在重组子筛选过 程中使得因酶切不完全造成的背景极易辨别。
二、 本发明在载体与含有干扰靶序列的PCR产物末端各包含一部分/wO序 列，只有当两者按照正确的方向连接成功，重组质粒上才能产生完整的/acO序
列，重组子才有可能呈现蓝色，这种正向筛选的/^o序列重构的方法使得载体
自连、非目的序列与载体连接以及连接方向不正确等产生的菌落与我们想要的 正确重组子极易区分。
三、 本发明在构建siRNA和shRNA干扰载体的过程中，利用两条引物相互 退火延伸，得到的PCR产物不需复杂的回收纯化(必要时可用两倍体积乙醇或 一倍体积异丙醇沉淀)就可直接与处理好的载体进行连接，大大简化了实验工 序，提高了实验效率，降低了实验成本。
四、 本发明在构建人工微RNA (amiRNA)载体的过程中巧妙地利用了一 条通用引物搭桥，使得所有设计的引物长度都不受侧翼序列长度的限制，而且 都被控制在60nt以内，这样不仅节约了实验成本，而且大大降低了引物合成中 的碱基错误率。
五、 本发明的整个过程操作简单方便，实验周期短，重组效率高，成本低， 筛选方便、直观、快捷，很容易实现自动化和高通量操作。


图1:含RNAi表达单元的载体构建过程 其中①②表示包含干扰耙序列的一对引物；③表示通用引物；/acO'表示位 于载体上的部分/aoO序列，碱基序列为5'-agcgctcacaatt-3' ; /acO'表示位于通 用引物上的部分/aoO序列；GeneX表示填充片段；丑/mI表示酵切位点，其识别 序列及切割位点为 5'-GTATCCNNNNNN」3'
3' -CATAGGNNNNN |一5，
图2:实施例l中改造的目标载体结构图
其中5' flanking seq表示选定miRNA骨架的5'端侧翼序列，B/wI表示酶切位点； lacO'表示完整/aoO的部分序列；Promoter表示启动子序列；Terminator表示终 止子序列；GeneX表示填充片段。
具体实施方式
下面以实施例对本发明进一步说明实施例1:
利用本发明构建以拟南芥的miR319a为骨架，以査尔酮合成酶(CHS)基 因作为干扰靶基因的植物人工微RNA (amiRNA)表达载体。
1) 克隆载体的改造
为了后续实验的需要，选定的克隆载体为可用于接合辅助的遗传整合克隆 (mating-assisted genetically integrated cloning, MAGIC)方法的供体质粒。经分 析得知，该质粒DNA序列上携带两个5/wI位点， 一个/acO序列，将两个B/"I 位点诱变成B"mHI位点，将/acO序列缺失突变。在改造好的载体的多克隆位点 处插入下列片段"-启动子(P35S) -5，侧翼序列-5>1位点-她表达单元-5>1位 点-tocO部分序列-终止子(Tnos)-"，得到改造载体pDONOR-gfy。(详见图2)
2) 含有干扰靶序列的人工微RNA —miR319aCHS的形成 按照本发明具体方法步骤二)中的原则，分析拟南芥来源的miR319a序列，
省去通用引物，设计并合成一对特异性引物pF&pR ,以含有miR319a序列的 载体为模板，用TaqDNA聚合酶进行PCR，得到的产物即为miR319aCHS。设
计的引物序列如下
pF: 5 ，ag catctceaagaacattgtgaa tcetc碎gtcgtgatateatt 3 ，
pR: 5 ，cflca"W caaaagagag catctccaag幼cattgtgaa tcaaagagaatcaatgatcc 3 ，
以上引物中，pF中下划" _^"部分表示5'端侧翼序列被切掉的两个碱 基；pR中下划" "部分表示3'端侧翼序列；下划"一"部分表示与miR319a的 环序列退火部分；灰色阴影部分表示选定目的基因的干扰靶序列；斜体部分表 示可与载体上携带的部分/acO序列组成完整/flcO的剩余序列。
3) 载体与外源片段的连接转化
将步骤l)中改造好的载体经5^/I酶切，酶切产物经回收纯化后与步骤2) 中纯化的PCR产物miR319aCHS经连接酶连接，然后转化大肠杆菌DH10p，涂 布LA+X-gal平板，于37 °C培养12小时观察结果，挑选蓝色单菌落抽提质粒验 证，验证结果表明，蓝色菌落为重组子的概率为100%。正确的重组子送给 Invitrogen公司测序。测序正确的重组质粒用于下一步实验。
4) 含有耙序列的RNAi单元克隆到植物双元RNAi表达载体上
采用MAGIC的方法，将步骤3)中测序正确的重组质粒上的RNAi单元 miR319aCHS转移到经改造的受体载体——植物双元载体pl301R上。实验结 果表明，获得含有miR319aCHS序列的植物双元表达载体的阳性克隆率达到 100%。实施例2:
利用本发明构建以哺乳动物的miR30为骨架，以agtagattaccactggagtct为干扰 靶序列的动物人工微RNA (amiRNA)载体。
1) 克隆载体的改造
分析载体pBluescript SK (+)序列，诱变该序列上的Byi/I位点和/flcO序列。 在改造好的载体的多克隆位点处插入下列片段"-启动子(CMV) -5'侧翼序列 -5/wI位点-gfy表达单元-^^I位点-lacO部分序列-终止子(SV40PolyA)-"。
2) 含有干扰耙序列的人工微RNA—mir30-X的形成
按照本发明具体方法步骤二)中的原则，分析miR30序列，设计并合成一 条通用引物pUR和一对特异性引物pF&pR ，混合3条引物，用TaqDNA聚合 酶在25 。C下退火，72 °C延伸，得到的产物即为mir30-X。设计的引物序列如下
pF: agtagattaccactggagtct tagtgaagccacagatgta
pR: cgaggcagtaggca agtagattacctggagtct tacatctgtggcttcac
以上引物中，斜体部分表示可与载体上携带的部分/^0序列组成完整/flcO 的剩余序列；下划"—"部分表示miR30的3'端侧翼序列；灰色阴影部分表示干 扰靶序列(pF中)及其互补序列(pR中)。
3) 载体与外源片段的连接转化
将步骤l)中改造好的载体经5/wI酶切，酶切产物经回收纯化后与步骤2) 中经酒精沉淀的PCR产物miR30-X用连接酶连接，然后转化大肠杆菌DH10卩， 涂布LA+X-gal平板，于37 °C培养12小时观察结果，挑选蓝色单菌落抽提质粒 验证，验证结果表明，蓝色菌落为重组子的概率为100%。正确的重组子送给 Invitrogen公司测序，测序正确的重组质粒即可用于下一步的哺乳动物细胞瞬间 表达检测。
权利要求
1、一种新的RNA干扰载体的构建与筛选方法，它主要包括载体的改造、含有干扰靶序列的DNA序列的产生和将上述含有干扰靶序列的DNA序列克隆到载体三个部分，其特征在于具体步骤为一、载体的改造首先选定一目标载体，将该载体上已经存在的Bfu I或者Bfi I位点以及lacO序列进行诱变，诱变后的载体不再含有Bfu I或者Bfi I位点以及lacO序列，然后在载体的多克隆位点处引入两端带有Bfu I或者Bfi I位点以及一端带有部分lacO序列的填充片段；二、含有干扰靶序列的DNA序列的形成根据RNA干扰载体种类的不同，采取不同的方法完成该步骤1)针对siRNA载体、shRNA载体，首先设计一对包含靶序列的引物，该引物3’末端含有长度为9-20nt彼此同源的序列，其中一条引物5’端额外加上能够与载体上的部分lacO序列正好重构成完整的lacO序列的lacO部分序列，利用具有末端转移酶活性的耐热DNA聚合酶使两条引物退火延伸，得到的产物即为所要的序列；2)针对人工微RNA(artificial microRNAs，amiRNAs)载体，首先以出发微RNA(microRNA，miRNA)的3’端侧翼序列为模板，该引物的5’端额外加上能够与载体上的部分lacO序列正好重构成完整的lacO序列的lacO部分序列，然后根据出发miRNA环序列长短不同，又分为以下两种情况a)当环序列小于30nt时，设计一对包含靶序列的引物，其3’末端分别带有部分环序列，且使该引物3’末端序列彼此部分同源，序列长度为9-20nt，其中与出发miRNA 3’端退火的那条引物5’端与上面设计的通用引物含15-20nt同源序列，利用具有末端转移酶活性的耐热DNA聚合酶使该对引物以及通用引物三者相互退火延伸，得到的产物即为所要的序列；b)当环序列大于30nt时，设计一对包含靶序列的引物，其3’末端分别带有可以和出发miRNA的环序列退火的部分序列，其中与出发miRNA 3’端退火的那条引物的5’端与上面设计的通用引物含15—20nt同源序列，以含有相应环序列的DNA序列为模板，用上述设计的一对特异引物、一条通用引物和具有末端转移酶活性的耐热DNA聚合酶进行PCR，得到的产物即为所要的序列；三、载体与外源片段的连接转化首先将步骤一中改造好的载体经Bfu I或者Bfi I完全酶切，得到3’端突出一个碱基的线性载体DNA分子，所得的线性载体经回收纯化，然后与纯化过的步骤二中获得的含有靶序列的PCR产物进行连接，转化大肠杆菌菌株DH10β，涂布含100μg/ml氨苄青霉素或其它抗生素以及30μg/mlX-gal的LB固体培养基，37℃培养12-16小时，呈现蓝色的菌落即为重组子；四、含有靶序列的RNAi表达单元克隆到植物双元表达载体上对于能够直接用于步骤一改造的RNAi载体，则能够省略该步骤，对于不能直接改造的植物双元表达载体，应先选择一个比较小的克隆载体按步骤一进行改造，然后通过酶切连接、Gateway重组克隆以及接合转移方法将RNAi表达单元克隆到植物双元表达载体上。
2、根据权利要求1所述的一种新的RNA干扰载体的构建与筛选方法，其 特征在于所述的5>i或5ya限制性核酸内切酶，还包括所有酶切后的DNA具有 5'端突出特点的lis型限制性核酸内切酶。
全文摘要
本发明提出了一种新的RNA干扰载体的构建与筛选方法，它主要包括载体的改造、含有干扰靶序列的DNA序列的产生和将上述含有干扰靶序列的DNA序列克隆到载体三个部分，本发明步骤繁琐，克隆效率低，适合高通量的操作。该方法不需要订购长度大于60nt的引物，不需要对PCR产物进行复杂的酶切纯化处理，而是依赖载体和外源片段连接重组，从而产生完整的lacO序列(乳糖操纵基因)，在lac⁺的大肠杆菌菌株中凭借蓝白斑筛选判断重组子。其筛选方法方便、直观、快捷、高效，得到的重组子不需进行方向鉴定，很容易实现自动化和高通量操作。
文档编号C12N15/82GK101418311SQ20081004865
公开日2009年4月29日 申请日期2008年7月31日 优先权日2008年7月31日
发明者红 严, 俊 徐, 马立新 申请人:湖北大学