专利名称：：一种与猪肌肉品质相关分子标记csrp3克隆及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于家畜基因工程
技术领域：
，具体涉及一种与猪肌肉品质相关的分子标记CSRP3克隆及应用。
背景技术：
：猪肉是我国人民动物蛋白的主要来源。在过去数十年时间里，随着国外高瘦肉率和快生长速度种猪的引进，我国猪肉生产在数量上逐渐满足了市场的需求。但是，对瘦肉率和生长速度过度选择而培育的种猪在肌肉品质方面却不及中国地方猪。随着生活水平的提髙和消费观念的改变，色、香、味俱佳且安全、营养的瘦肉越来越受到消费者的青睐。因此，肌肉品质的改良已成为当今优质猪育种工作的重耍目标，相关分子标记的寻找是实现这一目标的重要手段。肌肉品质是一个综合性状，常常通过肌肉pH值、肌内脂肪含量、大理石纹、系水力、剪切力、滴水损失、肉色、嫩度、肌纤维直径等指标进行度量。这些指标之间并不是独立的，而是彼此联系，共同决定最终的肌肉品质。对于猪肌肉品质等复杂性状的分子标记筛选通常采用QTL扫描结合候选基闪克隆的策略，即首先构建一个资源群体，测定肌肉品质相关的各种指标，并进行全基因组的QTL扫描，再在QTL区域内采用功能候选基因法或位置克隆的策略筛选相应的标记。依据PigOTLdbfhttp:〃www.animalgenome.org/OTLdb/Die.html)的统计数据，与肌肉品质相关的OTL己经超过1000个，几乎分布在猪所有的染色体上，其中2号、4号、5号、6号、7号、11号、14号、15号和17号染色体上与肌肉品质相关的QTL最为密集。尽管大量与肌肉品质相关的QTL被定位，但是影响肌肉品质的基因及分子标记硏究却远远落后于-此。目前，国内外己经鉴定的影响肌肉品质的主效基因包括(1)/I7W基因(Fujii,J等，Identificationofamutationinporcineryanodinereceptorassociatedwithmalignanthyperthermia.Sc/ence，1991，253:448^451),硏究表明该基冈的C1843T错义突变是导致猪产生应激综合症而发生肌肉品质下降的主要原因，(2)户i^G3基因(Milan,D等，AmutationinPRKAG3associatedwithexcessglycogencontentinpigskeletalmuscle.ScZence,2000，288:1248-1251),研究表明该基因的一个突变是导致汉普夏猪产生"酸肉"的主要原因。这两个基因的致因突变均已被鉴定，且得到了很好的分子生物学解释，因此已被作为分子标记用于淘汰"氟烷"敏感基因和"酸肉"基因的育种实践中。而其他一些与肌肉品质相关的基因尽管现在还没找到致闪突变，但是却发现其多态与肌肉品质性状存在显著相关，这些基因包括(1)C4Sr基因(Ciobanu,DC等，Newallelesincalpastatingeneareassociatedwithmeatqualitytraitsinpigs.Jouma/ofiAW/na/Sc/ence,2004,82:2829-2839),研究表明该基因的多个SNP与肌肉嫩度等多个肉质性状存在显著相关。(2)//-/545户基因(Gerbens，F等，Theeffectofadipocyteandheartfattyacid-bindingproteingenesonintramuscularfatandbackfatcontentinMeishancrossbredpigs.Jou/na/oMn/Vra/ScZerce,2000，78:552-559),研究表明该基闪的突变与肌内脂肪含量存在显著相关。(3)CO基因(Wang，H匕等，MolecularcharacterizationandassociationanalysisofporcineCA3.CytogeneticandGenomeResearch,2006，115:129-133),研究表明该基闪的突变与肌内脂肪含量及腿臀比例存在极显著相关。与已经定位的QTL相比，已经鉴定出致因突变或发现存在相关的基因数目远远不够，说明大量的与肌肉品质相关的基因有待进一步鉴定。猪2pl4-17染色体区段存在大量与肌肉品质相关的QTL，而CS/iW基因是位于此区域的一个重要的功能候选基闪。(cysteineandglycine-richprotein3，CSRP3)基因，乂称为MuscleLIMprotein(MLP)或cardiacUMprotein(CLP)，是编码LIM结构域蛋白CSRP基因家族成员之一。研究表明小鼠CS/J/y基因仅在横纹肌中表达，且其表达与肌分化过程相一致，是一个肌发生的正调节因子(Arber,S.等，MuscleLIMprotein,anovelessentialregulatorofmyogenesis,promotesmyogenicdifferentiation,Ce//，1994,79:221-31)。CS/IPJ基図敲除小鼠表现出增生性心肌炎及心脏功能紊乱的形态及临床特征(Arber,S.等，MLP-deficientmiceexhibitadisruptionofcardiaccytoarchitecturaloiganization，dilatedcardiomyopathy,andheartfailure,Ce//，1997,88:393-403:Geier，C等,MutationsinthehumanmuscleLIMproteingeneinfamilieswWihypertrophiccardiomy叩athy，C/rcw/加'ow,2003,107:13卯-1395)。免疫组化分析表明MLP蛋白在大鼠慢肌中组成性的表达，而在快肌中低表达，而且MLP在快型骨骼肌蛋白转换为慢型骨骷肌蛋白过程中上调表达(>Villmann，R等,MuscleLIMproteinisupregulatedinfastskeletalmuscleduringtransitiontowardslowerphenotypes,AmJPhysiolCellPhysiol,2001，280:C273-9);另有研究表明，C5KPJ基因编码产物MLP可以通过一种物理的方式与肌肉组织基本的螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子发生作用，这种作用具有高度的特异性，即MLP不与非肌源性bHLH蛋白(如E12和E47)或成肌增强因子-2(MEF2)发生作用(Kong,Y等,MuscleLIMproteinpromotesmyogenesisbyenhancingtheactivityofMyoD,MolCellBiol,1997，17:4750-60)。MLP可能以共激活因子的形式促进肌源性bHLH蛋白与特定DNA调控元件的结合(Kong,Y等，MuscleLIMproteinpromotesmyogenesisbyenhancingtheactivityofMyoD，MolCellBiol,1997，17:4750-60)。由此可见，CS朋J基因在横纹肌发育中具有重要的正调节作用，且可能参与肌纤维类型及分布的调节。
发明内容本发明的目的在于克隆一种与猪肌肉品质相关的分子标记CSRP3,为猪标记辅助选择提供一种方法的应用。本发明通过以下技术实现克隆得到一种猪肌肉品质相关基因CS/ZP丄它的cDNA序列如序列表SEQIDNO:1所述。所获得的cDNA序列全长为939bp，包含S85bp的完整CDS,编码194个氨基酸。依据获得的如序列表犯QIDNO:1所述CDNA序列设计引物，通过扩增和测序获得了C忍2W基因的部分核苷酸序列，如序列表SEQ1DNO:2所述。该序列长度为6231bp，其中第1924bp处有一个C1924-T1924的碱基突变，导致7b《IPCR-RFLP多态性。本发明设计了一对检测C1924-T1924碱基突变的引物对，其DNA序列如下所示正向引物5'GGTACTGTTCGCCAAGGAGA3'，反向引物《5'TCCAGGAAAGTGGGTGAAGA3'。一种筛选适用于猪肌肉品质性状标记辅助选择的分子标记的方法，按照以下步骤用人CS朋J基因cDNA为探针，作同源序列筛选，获得同源性卯％以上的表达序列标签(EST):然后拼接猪EST-重叠群;根据EST-重费群序列设计引物，通过扩增获得如序列表SEQIDNO:1所述的cDNA序列；依据该cDNA序列设计引物扩增通城猪和长白猪基因组DNA,获得如序列表SEQIDNO:2所述的DNA序列，其中包含C1924-T1924突变。本发明的具体实施方案如《具体实施方式》所述。序列表SEQIDNO:I是本发明克隆的与猪肌肉品质性状相关的GS/JPJ基因的cDNA序列；序列表SEQIDNO:2是本发明克隆的与猪肌肉品质性状相关的CS/y基因的核苷酸序列；图1:是本发明技术流程图2:是本发明中用于r叫IPCR-RFLP分型所用的猪CS/P3基冈DNA序列片段，下划线为引物。图3:是本发明克隆的猪CS/基因第4外显子的r叫IPCR-RFLP的三种基因型电泳结果。图中M:DNA分子量标准(lOObpladder)具体实施例方式实施例lCSJMy基因的核苷酸序列克隆1.CSKP基因的cDNA克隆(1)引物设计利用报道的人GWW基因的mRNA序列(GenBank收录号NM—003476.2)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为卯％以上的ESTs(片段长度大于lOObp),利用DNAStar软件中的SeqMan程序构建猪CS/P3基因EST-重叠群，据此分别设计5'RACE外侧引物P-50、5'RACE内侧引物P-51、3'RACE外侧引物P-30和3'RACE内侧引物P-3I,引物DNA序列如表1所示表1:用于CSJiy基因cDNA克隆的引物序列设计<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(2)RACE扩增参照TriZoL试剂盒(美国G旧CO公司产品)说明书步骤，利用该试剂盒从成年长白猪肌肉组织中提取总RNA;利用经DEPC处理的超纯水溶解总RNA，利用DnaseI酶(美国Promega公司产品)于37°C处理30分钟、并经等体积的酚-仿抽提进行RNA的纯化；通过DU640核酸-蛋白质浓度测定仪(美国Beckman公司产品)测定RNA的浓度，用1.2%的甲醛凝胶电泳检测其完整性。利用RACE试剂盒(美国CLONTECH公司产品)首先进行cDNA第一链的合成，cDNA笫一链合成之后首先以此产物为扩增模版，利用基因特异性外侧引物(GSP-50和GSP-30)及上述RACE试剂盒中的通用引物进行第一轮PCR扩增，扩增体系按照该试剂盒说明书配置；扩增条件为95"C3min;34*(94C30sec，65t;,30sec，72X:,lmin):72t:,5min;15匸，2min'在此基础上，将第一轮PCR扩增产物稀释100倍，以此稀释液为模版，利用基因特异性内侧引物(GSP-5I和GSP-3I)及RACE试剂盒中的内侧通用引物进行第二轮PCR扩增，扩增体系按照说明书配置，PCR反应条件与第一轮扩增条件相同。(3)RACE产物纯化、克隆与测序按照PCR产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)说明书操作耍求进行RACE产物的纯化，将纯化RACE产物与pGEM-T载体(美国Promega公司产品)连接，迕接反应总体积是5pl，其中包括2.5fil2xbuffer,0.5pl的pGEM-T载体，0.5(il的纯化PCR产物，0.5pl的T4DNA连接酶(美国Promega公司产品)，最后加入1(il灭菌水置161C水浴过夜无菌状态下取100~120jJ感受态细胞于1.5mlEpendorff管中，将5(il的连接产物加入泡匀，在冰上放置30rnin,热激卯s.其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3~4tnin，加入400nl无抗生素的LB液体培养基，37"C振荡培养45min。取100til涂布于已提前4h涂布了IPTG(Is叩opylthio^-D-辟lactoside,异丙基硫代一P-D—半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37"C平放lh后倒置培养；用牙签挑取单克隆置于1.5mlEppetidorf管中，37C培养68小时，取菌液作为PCR扩增的模版，利用RACE扩增的内侧引物(GSP5I/GSP31)配合通用引物进行PCR扩增，有阳性扩增产物者即为阳性克隆子；阳性齒液送由北京奥科生物技术有限公司完成测序。猪CSRW基因cDNA克隆的结果对于CSKW基因的双向RACE扩增均获得了特异的扩增产物。经测序验证发现，5'RACE和3'RACE产物实际大小分别为539bp和562bp，通过Seqman拼接测序序列并去掉外源的通用引物发现猪CSRP3基因cDNA全长为939bp,包含103bp的5'UTR，585bp的CDS和251bp的3'UTR。通过ORF预测发现猪CS7JP3基因编码194个氨基酸。2.CSRiy基因的DNA克隆与SNP扫描(1)引物设计利用获得的猪CHW基闪DNA序列比对人CSRP3基因的基因组DNA，初步推测猪CSRPJ基因的结构，在第三至最后一个外显子上设计引物，引物序列设计如表2所示。表2:用于CSiWy基因DNA克隆的引物引物引物序列引物位置退火温度产物大小PrimerPrimersequences(5，-3，)PrimerlocationAnnealTemperatureProductsize(bp)E3S1gcagctcacgagtcagagatctaExon3601951E3A1gcagcatagactgactttccacatE4S1cagcaacccttccaagttcactExon4602519E4A1gtctttgtcagtgacg卿ggaExon5E5S1cctgttttcgctgtgccatctExon5621902E5A1ctcccagcccaggtatcatcaExon6(2)PCR扩增及SNP扫描利用宝生物工程(大连)有限公司的rTaqDNA聚合酶进行PCR扩增，反应体系为20W，包括如下组分IXPCRbuffer,75拜ol/L的dNTP,0.3nmol/L引物，0.9-1.5mmol/L的Mg2+,IUT叫DNA聚合酶，50ng猪基因组DNA。PCR反应程序为标准PCR扩增程序，退火温度如表3所示，延伸时间为1分钟30秒。PCR扩增产物用天根生化科技(北京)有限公司的纯化试剂盒回收后，直接送交北京奥科生物技术有限公司完成测序。在上述DNA克隆过程中，对于每一段序列的PCR扩增，同时利用外来猪长白猪和中国地方猪通城猪基因组DNA作为模版,即在扩增过程中，对于每一对引物，分别扩增8个长白猪DNA和8个通城猪DNA,将长白猪与通城猪DNA来源的PCR扩增产物分别回收，送北京奥科生物技术有限公司完成测序；利用DNAStar软件的S叫man程序进行拼接^H序列比对，搜寻其中的SNP位点。CSRPJ基因的DNA克隆与SNP扫描结果三对跨内含子引物扩增获得了三个DNA片段，经测序验证其大小分别为1951bp，2519bp，l卯2bp。经S叫man软^f牛拼接上述测序序列，获得了6293bp的DNA序列，覆盖了猪CS/y^基因第三到第六外显子的全部序列。通过比较分析，发现了位于1924bp处(第四外显子)的一个C-T碱基突变。实施例2CS/P3基因C1924TZbg/PCR-RFLP基因型与肉质性状的关联分析1.r叫IPCR-RFLP检測方法的建立(1)引物序列CRP3-E4國S:5'GGTACTGTTCGCCAAGGAGA3'CRP3-E4隱R:5'TCCAGGAAAGTGGGTGAAGA3'(2)PCR扩增条《牛PCR反应总体积20jil，其中包含约100ng猪基因组DNA，含1XPCRBuffer,1.5mmol/LMgCl2，150trniol每种dNTP，0.3nmol每条引物，1单位7^DNA聚合酶。PCR扩增程序是94匸5min,(94TC30s，6(TC30s,721C25s)循环35次，72X:延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。(3)r叫IRFLP基因分型PCR产物酶切反应体积是10jil，其中10x7bglBuffer1jJ,PCR产物3~5限制性内切酶r叫I为3U，用灭菌水补充至IOjd,将样品混匀后离心，65"C水浴4小时，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。利用引物CRP3-E4-S与CRP3-E4-R配对扩增，获得扩增产物大小为344bp，序列如图2所示。分析发现该片段包含的C1924T可以引起T叫l限制性内切酶识别位点(5-T~CGA-3)的丢失与保留，即当该位点为C等位基因时，不能被K^I所酶切，而当该位点为T等位基因时，能够被TaqI酶所切开。因此，CC纯合型个体不被嗨切，形成一条大小为344bp的片段，而TT纯合型个体酶切产生的片段大小分别为206bp和138bp，CT杂合型则形成三种大小的条带。因此，通过PCR扩增首先获得344bp的产物，经过酶切可以区分三种不同的基因型个体，部分电泳检测结果如图4所示。2.标记性状关联分析在利用组建的通城猪(通城猪为湖北省通城县地方猪种，为公开推广应用的一个地方猪品种)群进行性状关联分析，制备了156个DNA样品用于基因型检测。所分析的性状有部分生产性能，部分肉质性状。建立了如下最小二乘模型Yijk=ji+GENOTYPEj+BATCHj+COMBrNAnONk+eijk，其中，Yijk是性状观察值，fi为总体均数，GENOTYPEj为基因型效应，BATCHj为性别效应，COMBINATIONk为组合的效应，6砂为随机误差。在一个通城猪实验群体中对CS^y基因第四外显子T叫IPCR-RFLP多态性位点与部分生产肉质性状进行关联分析，这些肉质性状包括肌肉pH值、大理石纹评分、滴水损失、剪切力、肌肉颜色等。在所检测的156个个体中，CC型个体为76个，CT型个体为70个，而TT型个体仅为10个，其中CC型个体剪切力显著低于CT型个体(P-0.0153),基因型间性状观察值的简单均数和标准差分析结果总结于表3所示。表3.猪CSRP3基因SNPC1924T不同基因型与性状关联分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><221〉3'UTR<222>(689)..(939)<223><220><221〉5'UTR<222>(l)..(卿<223〉<220〉<221>CDS<222>(104)..(688)<223〉<400>1ggtgacagtccccatatatttaaggaggacgtgagccccctgactcagctgagccgacaa60agactgcacaggcagacttgaccttgatcagagagtcttc肪gatgccaaactgg115MetProAsnTrp1ggcggaggagcga幼tg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技术领域：
，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与猪肌肉品质性状相关的分子标记CSRP3及其应用。所述的分子标记由CSRP3基因克隆得到，它的cDNA序列如序列表SEQIDNO1所述。在序列表SEQIDNO2的第1924bp处有一个有一个C1924-T1924的碱基替换，该替换导致TaqIPCR-RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增CSRP3基因完整cDNA序列和部分DNA序列所用的引物以及用于多态性检测的方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。文档编号C12N15/11GK101319252SQ200810048449公开日2008年12月10日申请日期2008年7月21日优先权日2008年7月21日发明者梅余,榜刘,徐学文,朱猛进,奎李,斌樊申请人:华中农业大学