专利名称：甘薯潜隐病毒的特异性引物、探针制备及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及甘薯潜隐病毒的特异性引物、 探针制备及检测方法。二背景技术：
甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,縮写为SPLV)，是侵染甘薯的主要 病毒之一，1979年台湾学者在台农65号甘薯品种上首次发现。SPLV病毒颗粒 为弯曲丝状，长度为700 750nm。该病毒侵染甘薯一般不产生明显的叶部症状， 有的仅产生轻度斑驳，SPLV可随薯块、薯苗营养繁殖体传播，但蚜虫、白粉虱、 种子不会传播。SPLV属于马铃薯Y病毒属(尸o^v/n^)，具有许多Po/yv/ms病 毒的特性，如在被感染植株的细胞中产生特异性的内含体，与一些Po(yv/n^属 病毒有血清学关系等。SPLV常与甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯G病毒(SPVG)等化0^>^ 病毒混合侵染，造成甘薯产量降低，品质变劣和种性退化，对甘薯生产造成严 重危害。对甘薯病毒病目前尚无特别有效的化学防治方法，利用茎尖分生组织 培养，培育脱毒甘薯是防治病毒病最有效的方法。在培育脱毒甘薯的过程中， 需要对甘薯茎尖苗进行病毒检测，由于大多数情况下SPLV在侵染甘薯时不产生 明显症状，给该病毒的检测、鉴定带来难度。目前用于甘薯病毒检测的常用方 法是酶联免疫吸附(ELISA)技术，但ELISA技术的灵敏度较低，而且SPLV、 SPVG和SPFMV三种病毒的抗体之间常有交互反应，不能对三种病毒进行特异 性检测。三、 发明内容本发明要解决的技术问题提供一种甘薯潜隐病毒的特异性引物和利用该 引物制备探针的方法，建立了可有效区分其它甘薯病毒的核酸斑点杂交检测技 术，为甘薯潜隐病毒的特异性检测提供了一种简便、有效和安全的方法。本发明的技术方案是甘薯潜隐病毒的特异性引物，其序列为SEQ1、 SEQ2， SEQ 1: 5 ，-GCCGACGAAACCATCATCGAT-3'， SEQ2: 5，-CATATGGATGCCACGCATTCC-3，。甘薯潜隐病毒的探针制备方法，运用所述的甘薯潜隐病毒的特异性引物 SEQ1、 SEQ2，以地高辛为标记物制备cDNA探针。所述的以地高辛为标记物制备cDNA探针的步骤为(1) 采用特异性引物SEQ 1 、 SEQ 2，用PCR方法从重组质粒pMDLVCP 中扩增出目的DNA片段，然后电泳回收目的DNA片段；PCR退火温度为56°C;(2) 将l吗的回收DNA片段加灭菌双蒸水至16(il;(3) 在沸水中加热5min使DNA变性，然后在冰上冷却；(4) 充分混匀DIG-HighPrime,力t) 4pl到变性DNA中，混匀，瞬间离心， 于37。C孵育反应16h;(5) 再加入2ji1 0.2mol/L的EDTA，于65。C反应10min，终止反应。 甘薯潜隐病毒的检测方法，运用所述的方法制得的探针建立核酸斑点的杂交检测方法。本发明的积极有益效果(1) 本发明采用甘薯潜隐病毒SPLV的特异性引物SEQ 1、 SEQ2，以非放 射性物质地高辛(DIG)为标记物，制备了甘薯潜隐病毒的cDNA探针，建立了 可有效区分甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯G病毒(SPVG)的核酸斑点 杂交检测技术，为甘薯潜隐病毒(SPLV)的特异性检测提供了一种简便、有效 和安全的方法。(2) 本发明制备的探针具有较高的灵敏度。检测结果表明，检测重组质粒 pMDLVCP的最低浓度为h 1000，相当于可检测出质粒DNA的最低量为0.26ng(见图3)。(3) 本发明制备的探针具有较高特异性。用本发明制备的DIG探针去检测 SPVG和SPFMV的质粒稀释液，结果均无杂交信号出现，说明SPLV的DIG 探针具有较好的特异性。四
图l: SPLV特异性引物的PCR扩增结果其中，泳道l为入DNA/EcoRI+历"din标准分子量marker;泳道2为PCR产物。图2: DIG探针杂交检测结果 其中，1-2为重组质粒pMDLVCP样品。图3: DIG探针标记的灵敏度检测结果其中l-7代表质粒稀释倍数，分别是10"-106。图4: DIG探针检测甘薯病毒结果 其中，A是质粒对照，B是甘薯病叶提取的总RNA， C是牵牛病叶提取的总RNA, l-4表示1(^-103稀释。五具体实施例方式实施例甘薯潜隐病毒的特异性引物、利用该引物制备探针的方法及检测方法。(一)、材料和方法1、 引物的设计与合成运用Vector NT软件进行引物设计，确定制备SPLV探针所使用的引物。目 的片段大小为880bp左右。 SPLV的特异性引物为SEQ1: 5'-GCCGACGAAACCATCATCGAT-3，， SEQ 2: 5 ，-CATATGGATGCCACGCATTCC-3 ，。2、 RT-PCR:取田间显症甘薯苗的茎尖，嫁接到巴西牵牛上，待巴西牵牛出现系统花叶 症状后，取其叶片利用上海生工生物工程公司的Flash UNIQ柱式总RNA抽提试 剂盒，并按其说明书方法，提取感病叶片的总RNA。以提取的病叶总RNA为模 板进行反转录和PCR。即在10 )iL反应体系中加入l pL 10xRT buffer、 2 pL MgCL2 、 1 ^LdNTP混合物、0.5 jiL下游引物(SEQ2)、 0.25 ^LRNase抑制剂、 0.5 pLAMV反转录酶、4.75 pL总RNA，于42。C反应30 min, 99。C反应5min， 5°C反应5 min。反应结束后，取反转录产物作为模板，加入l P5引物，10 5xPCR buffer, 0.25jiL7^HS， 28.75 ddH20，进行PCR扩增。扩增条件为94。C预变 性2min， 94。C变性30s， 56。C退火30s， 72。C延伸2min，共30个循环。PCR结束 后，经0.8%琼脂糖凝胶电泳，利用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、回收880bp 左右的目的DNA片段(见附图l)。3、 RT-PCR产物的克隆与鉴定将纯化后的PCR产物与pMD18-Tvector连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a， 经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆；然后由TaKaRa公司测定核苷酸序列 进一步验证，将构建好的SPLV重组质粒命名为pMDLVCP。4、 探针的制备(1) 利用SPLV的特异性引物SEQ 1和SEQ 2，从重组质粒pMDLVCP中 扩增出目的DNA片段；电泳回收目的片段。(2) 将lpg的回收DNA片段加灭菌双蒸水至16^1。(3) 在沸水中加热10min使DNA变性，之后在冰上迅速冷却。(4) 充分混匀DIG-High Prime,加4(il到变性DNA中，混匀，瞬间离心， 于37。C孵育反应16h。(5) 加入2^1 0.2mol/L EDTA(pH 8.0)于65。C反应10min，终止反应。 将标记好的探针放在-7(TC保存。5、 SPLVDIG探针的灵敏度和特异性检测 (1)灵敏度检测1) 样品处理为鉴定所标记探针的灵敏度，对重组质粒pMDMVCP进行了 系列稀释，分别为原液、1:10、 1:102、 1:103、 1:104、 1:105、 1:106，共7个处理。2) 剪取尼龙膜戴手套操作，用镊子夹住膜边，剪取2x4cm膜，剪去右上 角，以方便辨别正反面和左右位置，可用铅笔在膜上做上点样标记。3) 点样将样品在100。C时预变性5min，之后迅速冰上冷却；取2pl样品直 接点于尼龙膜上。4)固定点样后，先置室温自然干燥，之后将膜放置于干净的培养皿中， 上下用原膜衬纸夹住，上压一载薄片，以保持膜的平整；在12(TC烘箱中烘烤305) 预杂交将烘烤后的膜放入杂交袋中，加入预热的标准杂交缓冲液(见 附录)，37。C预杂交0.5h，并伴随着轻微的摇动。6) 杂交将地高辛标记的探针用10(TC沸水煮5min，使其变性，迅速置冰 上冷却，加入预热的标准杂交液中，加入量为0.035mL/cm"尼龙膜，49。C杂交过 夜，并伴随着轻微摇动。7) 洗膜杂交结束后，用2xSSC、 0.1X的SDS洗液常温下洗膜2次，每次 15min，之后用0.5xSSC、 0.1 XSDS于68。C下洗膜2次，每次15min。8) 膜平衡将洗好的膜用Washing buffer (0.1 mol/L马来酸，0.15mol/L氯 化钠，pH值为7.5; 0.3%Tween20)漂洗5 min，以平衡膜。9) 膜封闭膜平衡之后，用镊子把膜装入新杂交袋中，用25mLBlocking solution (1%封闭剂，0.1mol/L马来酸，0.15 mol/L氯化钠，pH值为7.5)封 闭30 min。10) 抗体结合吸出膜中的Blocking solution,加入2-3 mL AP (碱性磷酸酶) 标记的DIG抗地高辛抗体碱性磷酸酶复合物，封膜，平置于摇床上，2(TC下轻 摇30 min。11) 洗膜用Washingbuffer洗涤液洗膜2次，每次15min。12) 膜平衡加入20mL Detection buffer(0.1mol/LTris-HCl， 0.1mol/L氯化 钠，pH值为9.5)平衡5min。13) 生色反应在黑暗条件下，加入10mL新鲜配制的NBT/BCIP，显色lh， 显色结束后，用TE(10mmol/LTris-HCl， lmmol/LEDTA， pH值为8.0)溶液洗膜 5 min结束反应。14) 终止反应观察到理想的显色结果后，将膜移至灭菌水中终止反应。(2) 特异性检测为鉴定SPLV D.IG探针的特异性，分别用SPLV的DIG探针去检测SPVG 和SPFMV的重组质粒，杂交方法、步骤同灵敏度检测。(3) 利用SPLVDIG探针检测甘薯和牵牛感病叶片中的病毒用UN1Q-10柱式总RNA抽提试剂盒提取感染病毒的甘薯病叶总RNA，和通过嫁接获得的巴西牵牛感病叶片的总RNA，用RNA稀释液(H2O:20xSSC: 甲醛=5:3:2)对提取的总RNA进行系列稀释。用制备好的SPLV DIG探针进行检测，方法步骤同上。 (二)、结果1、 地高辛探针的获得利用PCR方法从质粒pMDMVCP扩增出SPLV特性的DNA片段；对扩增 的产物回收、纯化；再将所得的纯化产物通过DIG-High Primer,制备地高辛标 记的探针。将标记好的探针与pMDMVCP质粒杂交，呈现了杂交信号，说明标记较为 成功(见附图2)。2、 探针的灵敏度和特异性检测结果 (1)灵敏度的检测结果对重组质粒pMDLVCP进行系列稀释，分别为原液、1:10、 1:102、 1:103、 1:104、 1:105、 1:106共7个处理。结果表明，地高辛标记的探针可检测出重组质粒 pMDLVCP的最低浓度为1:1000，相当于可检测出质粒DNA的最低量为0.26ng (见附图3)。(2) 探针的特异性检测结果 分别用SPLV的DIG探针去检测SPVG和SPFMV的质粒稀释液，结果均无杂交信号出现，说明SPLV的DIG探针具有较好的特异性。(3) 地高辛标记探针检测甘薯叶片中的病毒点杂交结果图显示，利用SPLV的DIG探针能从甘薯病叶总RNA提取原液和 牵牛病叶总RNA提取原液中检测到病毒的存在(见附图4)，说明标记的探针可 用于甘薯病毒的检测。附录1、标准杂交缓冲液(300ml)的组成为20xSSC 一250ml 10% sodium-lauroylsarcosine 10ml 10% SDS 2ml II20 38ml上述缓冲液经DEPC处理，高温高压灭菌，然后隔离贮存。其中20xSSC (1000ml)的组成为NaCl (MW58.44) 175.32g Citrate (C6H807-H20, MW210.14) 63.042g H20 譜ml2、甘薯潜隐病毒的特异性引物序列表(见下页)序歹IJ表<110〉河南省农业科学院植物保护研究所<120>甘薯潜隐病毒的特异性引物、探针制备及检测方法 <160>2<170> Patentln3.4<210>1<211〉21<212>DNA<213>甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus) <400>1GCCGACGAAA CCATC ATCGA T 21<210>2<211>21<212〉DNA<213>甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus) <400>2CATATGGATG CCACGCATTC C 2权利要求
1、甘薯潜隐病毒的特异性引物，其特征在于，该特异性引物序列为SEQ 1、SEQ 2，SEQ 15’-GCCGACGAAACCATCATCGAT-3’，SEQ 25’-CATATGGATGCCACGCATTCC-3’ 。
2、 甘薯潜隐病毒的探针制备方法，其特征在于，运用权利要求1所述的 甘薯潜隐病毒的特异性引物SEQ 1、 SEQ 2，以地高辛为标记物制备cDNA探针。
3、 根据权利要求2所述的甘薯潜隐病毒的探针制备方法，其特征在于， 所述的以地高辛为标记物制备cDNA探针的步骤为(1) 采用特异性引物SEQ 1、 SEQ 2，用PCR方法从重组质粒pMDLVCP 中扩增出目的DNA片段，然后电泳回收目的DNA片段；PCR退火温度为56°C;(2) 将l吗的回收DNA片段加灭菌双蒸水至16^1;(3) 在沸水中加热5min使DNA变性，然后在冰上冷却；(4) 充分混匀DIG-HighPrime,力Q 4^1到变性DNA中，混匀，瞬间离心， 于37。C孵育反应16h;(5) 再加入2pl 0.2mol/L的EDTA，于65。C反应10min，终止反应。
4、甘薯潜隐病毒的检测方法，其特征在于，运用权利要求2或3所述的方 法制得的探针建立核酸斑点的杂交检测方法。
全文摘要
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种甘薯潜隐病毒(SPLV)的特异性引物、探针制备及检测方法。本发明以甘薯潜隐病毒SPLV病毒为材料，采用特异性引物SEQ 1、SEQ 2，以非放射性物质地高辛(DIG)为标记物，制备了SPLV的cDNA探针，建立了可有效区分甘薯G病毒(SPGV)、甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)的核酸斑点杂交检测技术，为SPLV的特异性检测提供了一种简便、有效和安全的方法。
文档编号C12Q1/70GK101230346SQ200810049089
公开日2008年7月30日 申请日期2008年1月15日 优先权日2008年1月15日 公开号200810049089.发明者奇 乔, 张德胜, 张振臣, 王永江, 秦艳红, 蒋士君, 黄玉娜 申请人:河南省农业科学院植物保护研究所