专利名称：一种基因抑制细胞K562-siWnt5a及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因细胞的构建，尤其涉及一种基因抑制细胞K562_siWnt5a 及其制备方法。
背景技术：
Wnt5a蛋白是一种分泌型的糖蛋白，属于Wnt家族,在不同肿瘤中，Wnt5a发挥着不同的作用，如在它能促使乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等肿瘤生长甚至可促使肿瘤的侵袭， 而在甲状腺肿瘤、结肠直肠癌等肿瘤中fct5a可能发挥着抑制肿瘤的作用。Wnt5a在肿瘤发生中的作用和机理仍不清楚。
在前期的研究中，我们使白血病细胞K562细胞过表达Wnt5a基因，并研究过表达 Wnt5a对K562细胞的生物学形状的影响(牛长春，司维柯，李军等。稳定过表达fct5a对 K562细胞生物学性状的影响.第三军医大学学报.2009; 31 (22) :2199-2201.)。为了更全面的研究Wnt5a对K562的影响，在本发明中我们使用逆转录病毒的方法，用siRNA干扰 K562细胞中Wnt5a基因的表达，使之处于稳定低表达水平。发明内容
本发明的目的在于提供一种基因抑制细胞K562_siWnt5a，所述基因抑制细胞 K562-siffnt5a有利于进一步的研究Wnt5a表达降低对白血病细胞的影响及机制。
本发明的技术方案是一种基因抑制细胞K562-S iWnt5a细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址是中国湖北武汉武汉大学，保藏日期是2012年7月12日，保藏编号为CCTCC N0:C201291，分类命名是 K562-siWnt5a 细胞。
所述基因抑制细胞包含SEQ ID NO:1所示的基因片段Wnt5a。
所述基因抑制细胞进一步包含siRNA启动子，所述siRNA启动子可以来自以 PSEB-HUS为载体的逆转录病毒。
所述基因抑制 细胞进一步包含siRNA启动子为H1、U6双启动子。
制备基因抑制细胞K562_siWnt5a细胞的方法，包含下列步骤1)质粒pSEB-HUS-Wnt5a 的构建；2)质粒pSEB-HUS-Wnt5a和pCL_Ampho去内毒素大量提取；3)pSEB-HUS-ffnt5a 和 pCL_Ampho 与脂质体 2000 共转染 HEK293 细胞；4)感染K562细胞并筛选阳性细胞克隆；5)鉴定阳性细胞克隆，获得所述基因抑制细胞K562-siWnt5a。
所述步骤I)可包含将基因片段Wint5a酶切后与pSEB-HUS载体连接。
所述步骤5)鉴定阳性克隆的方法为Real-time PCR检测K562 mRNA表达水平及 Western Blotting检测Wnt5a蛋白表达水平。
本发明使用逆转录病毒作为载体，可以把外源性的siRNA启动子(H1，U6双启动子)和Wnt5a基因目标序列片段(SEQ ID NO:1 : 5-GTGGATAACACCTCTGTTT-3)整合到细胞的基因组中，从而能够稳定内源性表达Wnt5a而不丢失,便于对Wnt5a的研究。其不同于使用转染的方法把siRNA瞬间转入细胞。基因抑制细胞K562-siWnt5a细胞的构建，对于进一步研发白血病诊断和预后判断指标和Wnt5a作为基因治疗靶点的研究具有重要意义，有利于进一步的研究表达过表达Wnt5a对于白血病的作用以及机制。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
图1为Real-time PCR鉴定K562 mRNA表达水平结果；图2为Western Blotting检测Wnt5a表达水平及JNK活性的变化；图3为pSEB-HUS质粒图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明基因抑制细胞K562-siWnt5a 及制备方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。
本发明以质粒pSEB-HUS-Wnt5a为载体包装逆转录病毒，构建基因抑制细胞 K562-siWnt5a细胞，达到了使K562细胞中Wnt5a表达水平下降的效果，并且表明Wnt5a表达水平的下降可以导致JNK活性的降低。
本发明利用Western blot的方法检测K562_Wnt5a细胞中Wnt5a蛋白表达水平的变化，证实基因抑制细胞K562-siWnt5a中Wnt5a蛋白表达量增高。
本发明制备的基因抑制细胞已保藏在中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期为2012年7月 12日，保藏号为CCTCC C201291，细胞名称 K562-siWnt5a。
材料和来源菌株和质粒大肠杆菌克隆菌株DH5a购自宝生物工程有限公司，细胞株K562、HEK293 购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，中国总代理北京中原公司，pSEB-HUS (图谱见图3)、 pCL-Ampho(见文献Naviaux RK, Costanzi E, Haas M, Verma IM, et al. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high—titer, recombinant retroviruses. J Virol. 1996 Aug; 70(8): 5701-5.)。
双链DNA序列由Invitrogen公司合成。
序列I (SEQ ID NO: 2) 5-AGTGGATAACACCTCTGTTTTTTT-3 ；序列 2 (SEQ ID NO: 3) 5-AAAACAGAGGTGTTATCCACTTTT-3 序列 I 与序列 2 混合，95°C 加热5min,后放室温。
其他主要试剂T4 DNA连接酶、限制性内切酶Sfi I购自TAKARA公司；TIANgel Midi Purification Kit购自天根生化科技有限公司；脂质体2000(Lipofectamine 2000)、 灭痕素(Blasticidin S HCL )购自 Invitrogen 公司；质粒普通纯化试剂盒与去内毒素纯化试剂盒购自Omega公司；RPM1-1640, DMEM培养基购自Gibco公司；Real-time PCR检测引物序列由Invitrogen公司合成；RNA逆转录cDNA试剂盒， real-time PCR试剂盒，Toyoba产品，日本。
实施例1质粒pSEB-HUS_Wnt5a的构建1.DNA小片段(siRNA祀点序列)制备单链DNA序列由Invitrogen公司合成。
序列I (SEQ ID NO :2) 5-AGTGGATAACACCTCTGTTTTTTT-3 ；序列 2 (SEQ ID NO :3) 5-AAAACAGAGGTGTTATCCACTTTT-3
序列I与序列2混合，95°C加热5分钟后放室温。
2. Wnt5a重组质粒构建 ①pSEB-HUS载体酶切及回收将pSEB-HUS载体(图3)用Sfi I酶切50°C消化3小时(酶切反应体系为16 μ 1DNA， 2 μ I限制性内切酶Sfi I，2 μ I IOXBuffer)，电泳。取酶切产物做1%琼脂糖凝胶电泳，证实得到大小为7000bp左右的特异性片段。使用TIANgel Midi Purification Kit回收向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入500 μ I平衡液BL，12，000 rpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；紫外灯下切下含特异DNA条带的胶条，放入EP 管中称重，加入3倍体积溶胶液PN，50°C水浴10分钟直至胶条完全融化，将I个吸附柱放入收集管中，将全部样品移入柱内，离心I分钟，倒出流过柱子的液体，将吸附柱放回同一收集管中，加700μ I的漂洗液于吸附柱内，离心I分钟，倒出流过柱子的液体，将吸附柱放回同一收集管中，重复洗涤，最后离心2分钟，将吸附柱放入I个干净的1. 5 ml离心管，加 50 μ I三蒸水于吸附柱上的膜中心，柱子放置I分钟后离心I分钟，收集洗脱的DNA。
②连接Τ4 DNA连接酶16°C过夜连接(连接反应体系为2 μ I Τ4 DNA Ligase,2y I 10 X T4 DNA Ligase Buffer,质粒酶切回收产物6 μ I, DNA小片段10 μ I,取一无菌离心管,加入已制备好的感受态DH5a细菌200μ 1，冰浴，吸取5μ I连接产物加入管中，转化DH5a细菌， 轻拍管壁混匀，冰浴30分钟，42°C水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800 μ I室温的SOC培养液(成分2% (W/V)胰化(蛋白)胨，O. 5% (W/V)酵母提取物，O. 05% (W/V) NaCl, 2. 5 mM KCl 10 mM MgCl2, 20 mM 葡萄糖)混匀，37°C摇床 220 rpm振荡培养 I 小时， 取50 μ I菌液涂于含氨节西林(浓度为50 μ g/mL)的LB培养板上,37°C恒温培养箱过夜培养，次日挑取单个菌落接种于含氨苄西林的LB培养基扩大培养。
③鉴定将重组质粒pSEB-Wnt5a送往上海生工公司测序。测序的结果显示，插入片段为 5-AGTGGATAACACCTCTGTTTTTTT-3 (SEQ ID NO:2)，与合成序列一致。重组质粒命名为 pSEB-HUS-ffnt5a0
实施例2质粒pSEB-HUS_Wnt5a和pCL-Ampho去内毒素大量提取按照 Omega质粒DNA提取试剂盒操作(Ε· Z. N. A. Fastfilter Endo-free Plasmid maxi Kit):从抗性平板上挑取质粒转化菌落，接种于4ml含氨苄西林的LB培养基中37°C恒温培养，8小时后接种到含有氨苄西林的IOOmlLB培养基中37°C恒温扩大培养12-16小时。沉淀菌体，4500g，离心10分钟，弃上清，尽量吸干，用IOml预冷的溶液I将上述细菌沉淀重悬， 剧烈振荡，加入溶液II IOml轻轻颠倒混匀5次， 使其澄清，加入Buffer N3，温和上下颠倒混匀后倒入针筒过滤器中，收集裂解液上清，加入O.1倍体积ETR溶液，静置，4000g离心5 分钟，将上清移置另一试管中，加入1/2体积的无水乙醇，颠倒5次放置5分钟，将HiBind大量结合柱套入50ml试管中，把过滤液倒入结合柱中，4000g离心5分钟，弃去收集管中的滤液，在结合柱中加入IOml HB Buffer，4000g离心5分钟，弃去收集管中的滤液，在结合柱中加入15ml DNA Wash Buffer, 4000g离心5分钟,弃去收集管中的滤液,重复使用15ml DNA Wash Buffer洗涤柱子，待柱子干燥后加入2ml预热的ddH20，室温放置2分钟，5000g离心 5分钟，收集洗脱下的DNA溶液，-20°C保存。
实施例3 pSEB-HUS-ffnt5a 和 pCL_Ampho 与脂质体 2000 共转染 HEK293 细胞 HEK293细胞使用含10%小牛血清的完全DMEM培养液，置37 °C、5% C02细胞培养箱中(50ml细胞培养瓶)，饱和湿度下培养，当细胞处于对数生长期且细胞浓度为30-40%时准备转染；准备转染的试剂，包括250 μ I DMEM (无血清)、5 μ I pCL-Ampho (约O. 5-1. Oyg DNA)、10 μ I pSEB-HUS-ffnt5a (约 1.0-2· Oyg DNA)、15 μ I Lipofectamine 2000 ( Invitrogen)，混匀，放置15-20分钟；仔细使用无血清的DMEM冲洗细胞三次，加入2. 5ml无血清的DMEM，小心加入转染混合物；加入后3-5小时后，把培养基吸出，加入4ml完整DMEM 培养液；在36小时、60小时、84小时和108小时收集含有逆转录病毒的上清。-80° C保存病毒。
实施例4感染K562细胞并筛选阳性克隆使用以上所得上清液置换培养处于对数生长期的K562细胞的培养液(添加海美溴铵最终浓度为12Pg/ml)，反复感染4次后，换为含有10%小牛血清的RPM1-1640完全培养基， 培养24小时后加入灭瘟素(最终浓度为4(^g/ml)，培养6天后更换为含有10%小牛血清的 RPM1-1640完全培养基，未感染逆转录病毒的细胞已全部死亡，得到阳性的抗性细胞克隆。 阳性克隆细胞命名为K562-siWnt5a细胞。
实施例5提取K562细胞mRNA 以及Real-time鉴定基因Wnt5a的表达空载体pSEB-HUS包含无基因靶点的siRNA表达序列，经去内毒素大抽、与质粒pCL-Ampho共转染HEK293细胞得到逆转录病毒并感染K562细胞得到抗灭瘟素的阳性细胞克隆(K562-si对照组细胞)。
提取K562_siWnt5a细胞、K562_si对照组细胞mRNA :将细胞悬液收集至离心管中，1000 1500 r/min离心5 min，弃去上清；将获得的细胞置于EP管中，加入I ml的 TriPure试剂，反复吹打细胞或使用匀浆器将细胞裂解，室温下孵育5分钟；加入1. 2 ml氯仿，小心盖好管盖，用力剧烈振荡15 s ,室温下孵育2 15 min, 4 °C下12000 g,离心15 min。将得到的无色水相转移到一个新的EP管中。加入O. 5 ml异丙醇混匀，盖好管盖，颠倒数次将其充分混匀，室温下孵育5 10 min,4 1下12000 g，离心15 min，弃去上清，加 Al ml 75%乙醇，通过旋转作用洗涤乙醇中的RNA颗粒；DEPC处理过无RNA酶的无菌水重悬RNA样品。使用Toyoba逆转录试剂盒逆转录RNA为cDNA,反应体系(Toyoba, Japan) 无 RNA 酶的无菌纯水，10. 5 μ I ；01igo(DT)20 (lOpmol/μ I)，1. O μ I RNA,1. O μ I ； 5 X RT buffer, 4. O μ I ；dNTP (10mmol/L)，2· 0 μ I ；RANase 抑制剂，O. 5 μ I ；ReverTra Ace (lOOu/μ 1),1.0 μ I。逆转录反应条件30 °C, 10 min ；48 °C, 120 min ；99 °C，5 min ； 4 °C, 5 min。
Real-time PCR 检测 Wnt5a mRNA 的表达。引物Wnt5a : (SEQ ID NO :4)5，-CTTCGCCCAGGTTGTAATTGAAGC-3，，(SEQ ID NO: 5) 5’-CTGCCA AMACAGAGGTGTTATCC-3，； GAPDH (SEQ ID N0:6) 5’_GAAGGTG AAGGTCGGAGTC-3 ’， (SEQ ID NO: 7) 5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC -3’。反应体系(Toyoba, Japan):双蒸水，6· 2 μ I ；SYBR,12.5μ I ；plus-solution, 2. 5 μ I ；上游引物，I μ I ;下游引物，I μ I ; cDNA, 2 μ I。
PCR条件为95°C预变性2分钟，然后95°C变性10秒、58°C退火、延伸45秒，共40 个循环；每个循环结束时进行荧光检测。GAPDH作为内参。结果如图2所示K562-siWnt5a 细胞中Wnt5a基因mRNA表达水平低于K562_si对照组细胞(如图1)。
实施例6 Western Blotting检测Wnt5a表达水平及JNK活性的变化 JNK是参与非经典Wnt信号通路一个分子，其活性形式为磷酸化水平。离心收集培养瓶中细胞，O.1M PBS漂洗一次，取5X IO6细胞收集于1.5 ml离心管中， 加入100 μ I总蛋白提取液和10 μ I Cocktail (O.1M PBS溶解)，混匀，冰浴30分钟， 10000 rpm、4°C离心15分钟，收集上清，测定总蛋白浓度。配制10%Tricine SDS-PAGE分离胶和浓缩胶。电泳80V 30分钟，120V I小时。电泳结束后，取下凝胶置于转印缓冲液中平衡50分钟，剪下凝胶大小的PVDF膜和厚滤纸，将PVDF膜在100%的甲醇中浸泡I分钟后与滤纸一起置于转印缓冲液中浸泡5分钟，12V恒压电转印I小时，取下PVDF膜，蒸馏水洗膜5分钟3次，TBST洗涤10分钟3次，室温下5%脱脂奶粉封闭膜I小时，TBST洗涤10分钟 3 次，加入用 3%BSA/TBS 稀释至 1:1000 的抗体(β -actin, phosphor-JNK, Wnt5a),4°C 孵育过夜，TBST洗涤10分钟3次，加入3%BSA/TBS稀释至1: 1000的二抗，37°C孵育2小时，TBST洗涤10分钟3次，将发光液A和B等体积混匀制成工作液，滴于膜上，作用5分钟， 化学发光检测并采集图像(如图2)。
结果显示K562细胞中Wnt5a mRNA表达水平下降,蛋白表达水平下降,达到了构建基因Wnt5a抑制的K562细胞的目的。并且，据报道文献(Nomachi，A.，Nishita, Μ.， Inaba, D. , Enomoto, Μ. , Hamasaki, Μ. and Minami, Y. (2008). Receptor tyrosine kinase Ror2 mediates Wnt5a_induced polarized cell migration by activating c-Jun N-terminal kinase via actin—binding protein filamin A. J Biol Chem 283, 27973-81)，Wnt5a可以激活JNK活性，结果显示，K562细胞中本身表达Wnt5a蛋白，并且通过与对照细胞相比，所得到细胞K562-siWnt5a细胞株稳定低表达Wnt5a基因；磷酸化JNK 表达较低，表明JNK活性受到抑制；β-actin作为内参。表明本发明中，K562细胞中Wnt5a 表达 被抑制后，可抑制Wnt5a下游信号。序列表<110>中国人民解放军第三军医大学药学院 〈120〉一种基因抑制细胞K562-siWnt5a及其制备方法 〈130〉 CN 〈160〉 7<170> PatentIn version 3. 3〈210〉 I 〈211〉 19 〈212〉 DNA〈213〉Wnt5a目的基因序列片段 〈400〉 Igtggataaca cctctgttt19〈210〉 2 〈211〉 24 〈212〉 DNA〈213〉合成的Wnt5a基因序列片段 〈400〉 2agtggataac acctctgttt tttt24〈210〉 3 〈211〉 24 〈212〉 DNA〈213〉合成的Wnt5a基因序列片段 〈400〉 3aaaacagagg tgttatccac tttt24〈210〉 4〈211〉 24〈212〉 DNA〈213〉人 工合成引物〈400〉 4cttcgcccag gttgtaattg aagc24〈210〉 5 〈211〉 24 〈212〉 DNA
权利要求
1.一种基因抑制细胞K562-siWnt5a，其保藏号为CCTCC C201291。
2.如权利要求1所述的基因抑制细胞K562-siWnt5a，其特征在于，包含SEQID NO:1 所示的基因片段fct5a。
3.如权利要求1或2所述的基因抑制细胞K562-siWnt5a，其特征在于，包含siRNA启动子。
4.如权利要求3所述的基因抑制细胞K562-siWnt5a，其特征在于，所述siRNA启动子为H1、U6双启动子。
5.如权利要求3所述的基因抑制细胞K562-siWnt5a，其特征在于，所述siRNA启动子来自以pSEB-HUS为载体的逆转录病毒。
6.如权利要求1所述的基因抑制细胞K562-siWnt5a的制备方法，其特征在于，包含步骤1)质粒pSEB-HUS-Wnt5a 的构建；2)质粒pSEB-HUS-Wnt5a和pCL_Ampho去内毒素大量提取；3)pSEB-HUS-ffnt5a 和 pCL_Ampho 与脂质体 2000 共转染 HEK293 细胞；4)感染K562细胞并筛选阳性细胞克隆；5)鉴定阳性细胞克隆，获得所述基因抑制细胞K562-siWnt5a。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤I)包含将基因片段Wnt5a酶切后与pSEB-HUS载体连接。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤5)所述鉴定阳性细胞克隆为 Western blot鉴定Wnt5a蛋白的表达。
全文摘要
本发明涉及一种基因抑制细胞K562-siWnt5a及其制备方法，其中基因抑制细胞K562-siWnt5a的保藏号为CCTCCC201291。所述制备方法主要包含步骤质粒pSEB-HUS-Wnt5a的构建，质粒pSEB-HUS-Wnt5a和pCL-Ampho去内毒素大量提取，pSEB-HUS-Wnt5a和pCL-Ampho与脂质体2000共转染HEK293细胞，筛选和鉴定阳性细胞克隆。构建的基因抑制细胞K562-siWnt5a细胞，有利于进一步的研究过表达Wnt5a对于白血病的作用和机制。
文档编号C12N5/10GK103060272SQ20121053428
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者司维柯, 牛长春, 赵宸, 潘静, 张晓丽, 吴玮铷 申请人:中国人民解放军第三军医大学药学院