抑制ADAM17基因的siRNA及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制ADAM17基因的siRNA及其应用。本发明公开一种化学修饰的双链siRNA分子，是由如下A所示的siRNA分子中至少一条链经过如下(1)-(13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子。本发明公开的siRNA可以作为关节炎及相关炎症的治疗药物，可通过骨关节腔局部注射siRNA及其制剂抑制炎症因子表达实现对关节炎症的治疗。
【专利说明】抑制ADAM17基因的s i RNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抑制ADAM17基因的SiRNA及其应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 骨关节炎（Osteoarthritis，OA)是一种严重危害人类健康，目前尚缺乏有效治疗 手段的慢性退行性骨关节病变，迫切需要研宄出能有效防治骨关节炎的新方法。骨关节炎 临床病理特征之一是软骨破坏和hFLS细胞外基质降解，而软骨的破坏最终都来源于胞外 基质的蛋白水解。因此多种蛋白水解酶活性增高引起继发性软骨外基质（extracellular matrix，ECM)的降解异常是软骨退变的直接原因，最终导致覆盖关节骨表面的软骨破坏。白 介素-I(IL-I)和肿瘤坏死因子-a (TNF-α)都有促进hFLS细胞分解代谢及降解细胞外基 质的作用，有研宄表明在关节炎患者的关节液中发现高浓度的IL-I和TNF-α，它们被认为 是在关节炎发病机制中起关键作用的促炎细胞因子。
[0003] ADAM17(解聚素-金属蛋白酶17)是ADAMs家族（解聚素和金属蛋白酶）的一员， ADAMs家族是近年来发现的一类具有多种功能的细胞膜表面糖蛋白家族，它们共同参与细 胞与细胞、细胞与基质的黏连、细胞融合、胞外基质的降解及信号传导等多种生理过程，如 白细胞的迀移。除此之外，它们还参与了肿瘤形成、增殖及转移等病理过程。ADAM17将膜 结合型的TNF-α切断，产生游离型的TNF-α，因此被称作为TNF-α转换酶（TACE)。游离 型的TNF-α引起炎症性细胞因子的过量分泌、细胞凋亡、细胞内信号传导的障碍等，导致 各种疾病，包括风湿性关节炎（RA)、系统性红斑狼疮（SLE)、多发性硬化症、急性感染病、哮 喘、特应性皮炎、牛皮癣等。ADAM17除以TNF-α为底物外，巨噬细胞集落刺激因子或趋化 因子FKN也受ADAM17的调节。因此，认为抑制ADAM17的化合物有望作为炎症疾病的治疗 药。然而，金属蛋白酶家族高度保守，开发选择性的小分子抑制剂已经被证明具有非常大的 挑战。先前使用更广谱的金属蛋白酶抑制剂的试验已经被证明具有组织毒性，因此开发高 度选择性的ADAM17抑制剂（Moss，2008)是需要解决的问题。
[0004] 1998年克雷格·梅洛和安德鲁?法尔发现了基因沉默现象，随后Tuschl和他的同 事在哺乳动物细胞中发现化学合成的19 一 25个碱基的小干扰RNA(SiRNA)，可特异高效的 沉默靶mRNA。从此siRNA被广泛用于基因功能研宄，疾病治疗。siRNA可特异的同序列互 补的靶mRNA结合，并使其降解。长片段的双链RNA被Dicer酶切割成21 - 23个碱基长度 短片段RNA。两条链中同靶mRNA结合的链称为反义链，另一条链称为正义链或信使链。体 外化学合成的siRNA进入细胞后同样发挥RNA干扰作用，而且有效降低了长链RNA引起的 免疫反应。但针对同一基因不同片段位置可设计出多种siRNA，沉默效果有明显差异。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抑制ADAM17基因的SiRNA及其应用。
[0006] 本发明提供一种化学修饰的双链siRNA分子，是由如下A所示的siRNA分子中至 少一条链经过如下（1)-(13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子：
[0007] A、一种SiRNA分子，为如下1)或2)所示：
[0008] I) SEQ ID No. 1所示的RNA单链和SEQ ID No. 2所示的RNA单链互补而成的双链 siRNA分子；
[0009] 2) SEQ ID No. 2所示的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有60%以上同 源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0010] 或，SEQ ID No. 1所示的RNA单链和与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有60%以上 同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0011] 或，与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0012] (1)磷酸骨架的硫代磷酸修饰；
[0013] 所述硫代磷酸修饰为磷酸骨架的P-S键代替P-OH键；
[0014] (2)核糖或脱氧核糖的2' -甲氧基修饰；
[0015] (3)核糖或脱氧核糖的2' -氟修饰；
[0016] (4)锁核酸修饰；
[0017] 所述锁核酸修饰为核糖或脱氧核糖的2' -0位和4' -C位通过缩水作用形成环 状结构；
[0018] (5)开环核酸修饰；
[0019] 所述开环核酸修饰为核糖或脱氧核糖中2' -C和3' -C间的C-C键断裂；
[0020] ⑶叼丨噪修饰；
[0021] 所述吲哚修饰为碱基被吲哚替代；
[0022] (7)碱基的5 -甲基胞嘧啶修饰；
[0023] (8)碱基的5-乙炔基尿嘧啶修饰；
[0024] (9)单链5'末端胆固醇修饰；
[0025] (10)单链3'末端半乳糖修饰；
[0026] (11)单链5'末端多肽修饰；
[0027] 所述多肽具体为从N端到C端的序列为Arg-Gly-Asp的多肽；
[0028] (12)单链5'末端磷酸化修饰；
[0029] (13)单链5'末端荧光标记修饰；
[0030] 所述荧光标记具体为Cy系列荧光标记；
[0031] 所述与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子具体为SEQ ID No. 3所示的单链和SEQ ID No. 4所示的单链互补而成的双链siRNA分子。
[0032] 上述化学修饰的双链siRNA分子中，所述化学修饰后互补而成的双链siRNA分子 的正义链和反义链分别具有如下Bl和Cl所示的序列：
[0033] Β1、5' -Γ -L' P' M' UCAUGUAUCUGAA P' Μ' M' dTdT-3' ；
[0034] Cl、5' -R' -Q' Q' L' UUCAGAUACAUGA Q' L' P' dTdT-3' ；
[0035] 所述K '为5 '末端胆固醇修饰；
[0036] 所述R'为无修饰或5'末端磷酸化修饰；
[0037] 所述dT为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；
[0038] 所述L'、Μ'、P'和Q'分别为脱氧核糖的2' -甲氧基修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷 酸、脱氧核糖的2' -甲氧基修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2' -甲氧基修饰的 胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和核糖的2' -甲氧基修饰的尿嘧啶核糖核苷酸；
[0039] 或，
[0040] 所述L'、M'、P'和Q'分别为鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧 啶脱氧核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸；
[0041] 所述反义链为同ADAM17(解聚素-金属蛋白酶17)mRNA结合的单链，所述正义链 为与所述反义链互补结合的单链。
[0042] 一种SiRNA分子也属于本发明的保护范围，为如下（1)或（2)所示：
[0043] (I) SEQ ID No. 1所示的RNA单链和SEQ ID No. 2所示的RNA单链互补而成的双链 siRNA分子；
[0044] (2) SEQ ID No. 2所示的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有60%以上 同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0045] 或，SEQ ID No. 1所示的RNA单链和与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有60%以上 同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0046] 或，与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0047] 所述siRNA分子应用于制备预防和/或治疗炎症的产品；
[0048] 所述炎症具体为关节炎症，再具体为骨关节炎。
[0049] 含有上述siRNA分子的载体也属于本发明的保护范围；
[0050] 所述载体为阳离子脂质体、壳聚糖纳米粒、多肽、聚合物材料。
[0051] 上述siRNA分子中，所述与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有70%以上同源性的 RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链 siRNA分子为SEQ ID No. 3所示的单链和SEQ ID No. 4所示的单链互补而成的双链siRNA 分子。
[0052] -种能产生上述siRNA分子的DNA分子也属于本发明的保护范围。
[0053] 上述DNA分子中，所述siRNA分子为SEQ ID No. 1所示的RNA单链和SEQ ID No. 2 所不的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0054] 所述DNA分子为含有SEQ ID No. 5中自5'末端起第38-56位核苷酸的DNA分子， 具体为含有SEQ ID No. 5所示的DNA单链和SEQ ID No. 6所示的DNA单链互补而成的双 链DNA的DNA分子，再具体为SEQ ID No. 5所示的DNA单链和SEQ ID No. 6所示的DNA单 链互补而成的双链DNA的分子替换pGCsi-Hl/Neo的BamHI和HindIII酶切位点间序列， pGCsi-Hl/Neo的其余序列不变得到的重组siRNA表达质粒。
[0055] -种试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述任一所述的化学修饰的 双链siRNA分子、上述任一所述的siRNA分子和/或上述任一所述的DNA分子；
[0056] 所述试剂盒还含有记载在可读载体上的使用说明，该使用说明记载内容如下：在 发生炎症部位注射上述任一所述的化学修饰的双链siRNA分子或其制剂、上述任一所述的 siRNA分子再经化学修饰得到的siRNA分子或其制剂和/或上述任一所述的DNA分子产生 的RNA分子再经过化学修饰得到的双链siRNA分子或其制剂。
[0057] 上述任一所述的化学修饰的双链siRNA分子、上述任一所述的siRNA分子和/或 上述任一所述的DNA分子和/或上述试剂盒在制备预防和/或治疗炎症的产品中的应用也 属于本发明的保护范围；
[0058] 所述炎症具体为关节炎症，再具体为骨关节炎。
[0059] 上述任一所述的化学修饰的双链siRNA分子、上述任一所述的siRNA分子和/或 上述任一所述的DNA分子和/或上述试剂盒在制备如下D1-D4任一所示的产品中的应用也 属于本发明的保护范围：
[0060] D1、抑制关节表面纤维化的广品；
[0061] D2、抑制软骨侵蚀的产品；
[0062] D3、预防和/或治疗滑膜炎的产品；
[0063] D4、保护软骨和/或滑膜的产品。
[0064] 上述任一所述的化学修饰的双链siRNA分子、上述任一所述的siRNA分子和/或 上述任一所述的DNA分子和/或上述试剂盒在制备如下E1-E6任一所示的产品中的应用也 属于本发明的保护范围：
[0065] E1、预防和/或治疗类风湿性关节炎的产品；
[0066] E2、预防和/或治疗系统性红斑狼疮的产品；
[0067] E3、预防和/或治疗多发性硬化症的产品；
[0068] E4、预防和/或治疗急性感染病的产品；
[0069] E5、预防和/或治疗特应性皮炎的产品；
[0070] E6、预防和/或治疗牛皮癣的产品。
[0071] 本发明提供的siRNA可以作为关节炎及相关炎症的治疗药物，可通过骨关节腔局 部注射siRNA或其制剂抑制炎症因子表达实现对关节炎症的治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0072] 图1为抑制ADAM17基因的有效siRNA筛选。
[0073] 图2为siRNA-AD-08免疫印迹实验。
[0074] 图3为siRNA-AD-08下调炎症因子。
[0075] 图4为siRNA结构对靶基因沉默效果的影响。
[0076] 图5为硫代磷酸（P-S键）的修饰位置示意图。
[0077] 图6为化学修饰增强寡聚核酸血清稳定性。
[0078] 图7为大鼠组织病理切片分析。
[0079] 图8为大鼠关节液炎症因子含量。
【具体实施方式】
[0080] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0081] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0082] hFLS细胞（人成纤维样滑膜细胞）为Cell Applications产品，产品目录号为 408_05aD
[0083] 293T细胞为ATCC产品，产品目录号为CRL-3216。
[0084] MCF-7细胞为ATCC产品，产品目录号为HTB-22。
[0085] Human IL-I β immunoassay检测试剂盒为AssayPro产品，产品目录号为 EI2200-1。
[0086] pGCsi-Hl/Neo在文献"季国忠，张发明，黄曙等.Smad4/DPC4基因小发夹RNA质粒 表达载体的构建和鉴定[J].医学研宄生学报，2006，19(11) :973-977"中公开过，公众可从 广州市锐博生物科技有限公司获得。
[0087] Lipofectamine2000 试剂盒为 Invitrogen 产品。
[0088] 雄性SD大鼠（220±20g)为广东省医学实验动物中心产品。
[0089] 下述实施例中的SiRNA均为双链SiRNA分子，注射大鼠的各注射液的溶剂均为 PBS0
[0090] 实施例1、抑制ADAM17基因 mRNA表达的有效寡聚核酸的筛选
[0091] 一、进行siRNA设计以确定靶向于ADAM17的siRNA，并进行生物信息筛选，确保 序列对于ADAM17序列是特异性的且对于来自任何其他基因的序列不是特异性的。靶序列 使用NCBI提供的BLAST搜索引擎相对于GenBank中的序列进行核对，经过初步实验筛选 出 8 个有效 siRNA，分别命名为 siRNA-AD-01、siRNA-AD-02、siRNA-AD-03、siRNA-AD-04、 siRNA-AD-05、siRNA-AD-06、siRNA-AD-07、siRNA-AD-08。以上 siRNA 为针对 ADAM17 基因 序列不同位置设计的siRNA。
[0092] 二、细胞转染
[0093] 实验分为 10 组，分别为 siRNA-AD-01 至 siRNA-AD-08 实验组，Notarget (NTC)为 阴性对照组、NC为空白对照组。
[0094] siRNA-AD-01至siRNA-AD-08实验组的设置方法如下：
[0095] 将hFLS细胞用0. 25 %的胰酶进行消化，用DMEM培养基制成浓度为I X IO4个/ml 的细胞悬液，将其接种于12孔培养板中，每孔500ul，当hFLS细胞生长至对数生长期（即 生长达80%融合成片）时，按照Lipofectamine2000试剂盒的说明书，将各个对应的siRNA 按照50nM的终浓度转染hFLS细胞。
[0096] No target (NTC)阴性对照组：将实验组的siRNA替换为随机非特异siRNA，其余步 骤不变。其中，随机非特异siRNA不是特异针对于靶基因（ADAM17基因）所设计的siRNA :
[0097] 正义链：5' -AGUAUGCCACAUAAGCAUC dTdT-3' ；
[0098] 反义链：5' -GAUGCUUAUGUGGCAUACU dTdT-3'。
[0099] NC空白对照组：不加 siRNA，其余步骤与实验组一致。
[0100] 三、在转染24h后收集各组hFLS细胞，于IOOOrpm离心5分钟，去除上清，Trizol 法提取各组的RNA。
[0101] 四、将各组的RNA反转录为CDNA，以各组的CDNA为模板，以ADAM17-F1和 ADAM17-R1为引物，进行实时荧光定量PCR，检测结果如图1所示，以β -actin为内参基因。
[0102] ADAM17-F1:5 ' -GGACCAGGGAGGGAAATA-3，
[0103] ADAM17-R1:3' -TTGCTGTGGACGACGTTG-5'
[0104] 图1表明，经过前期筛选获得的8个有效siRNA中，siRNA-AD-08对ADAM17的沉 默效果最好，抑制了 86%的基因表达量。
[0105] 其中siRNA-AD-08正义链的序列如SEQ ID No. 1所示，反义链的序列如SEQ ID No. 2所示。
[0106] siRNA-AD-08 正义链：5,-GCAUCAUGUAUCUGAACAA-3'（SEQ ID No. I)
[0107] siRNA-AD-08 反义链：5, -UUGUUCAGAUACAUGAUGC-3,（SEQ ID No. 2)
[0108] 五、Western blot 检测
[0109] 取siRNA-AD-08实验组的hFLS细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗涤细胞2遍，倒 掉PBS，加入适量预冷的2XLysis Buffer，用细胞刮将细胞刮下，置于冰上充分裂解细胞 30min，于低温离心机4°C，12000g，离心15min，取上清液，用Bradford法测定蛋白浓度，最 后将样品蛋白的终浓度均调整为2 μ g/ μ 1，于_80°C冰箱保存备用。分别取12 μ g总蛋白 量的样品，加入等体积的2X loading buffer上样缓冲液。将二者充分混匀后，在沸水中煮 浴10分钟，4°C存放备用。根据目的蛋白分子量大小配制相应浓度的胶（10%的SDS-PAGE 分离胶和5 %的浓缩胶），等胶制备好后，将梳子拔去后用电泳缓冲液清洗上样孔，将之前 准备好的样品上样，每孔加入蛋白样品，进行电泳。电泳结束后，使用转移电泳装置，在4°C， 400mA恒流条件下电转2小时，将蛋白转移到PVDF膜上。随后进行显色和曝光分析。
[0110] 同时以NC空白对照组和No target (NTC)阴性对照组进行上述实验作为对照。结 果如图2所示。
[0111] 图2中，Control为NC空白对照组，no target为No target (NTC)阴性对照组， siRNA 为 siRNA-AD-08 实验组。
[0112] 图2表明，siRNA-AD-08显著抑制了 ADAM17的蛋白表达，后续选用siRNA-AD-08做 进一步的分析。
[0113] 实施例2、寡聚核酸对炎症因子的抑制
[0114] 一、实验分为如下各组：
[0115] 1^1^-8丨1?隱-40-08实验组：原代培养1^1^细胞至6孔板，当细胞密度约50%时， 按照Lipofectamine2000试剂盒说明书，将siRNA-AD-08按照50nM的终浓度转染hFLS细 胞。
[0116] MCF-7-siRNA-AD-08实验组：原代培养MCF-7细胞至6孔板，当细胞密度约50% 时，按照Lipofectamine2000试剂盒说明书，将siRNA-AD-08按照50nM的终浓度转染MCF-7 细胞。
[0117] hFLS-No target (NTC)阴性对照组：将 hFLS-siRNA-AD-08 实验组的 siRNA 替换为 随机非特异siRNA，其余步骤不变。其中，随机非特异siRNA不是特异针对于靶基因（ADAM17 基因）所设计的siRNA :
[0118] 正义链：5' -AGUAUGCCACAUAAGCAUC dTdT-3' ；
[0119] 反义链：5 ' -GAUGCUUAUGUGGCAUACU dTdT-3 '。
[0120] MCF-7-No target (NTC)阴性对照组：将 MCF-7-siRNA-AD-08 实验组的 siRNA 替 换为随机非特异siRNA，其余步骤不变。其中，随机非特异siRNA不是特异针对于靶基因 (ADAM17基因）所设计的siRNA :
[0121] 正义链：5' -AGUAUGCCACAUAAGCAUC dTdT-3' ；
[0122] 反义链：5' -GAUGCUUAUGUGGCAUACU dTdT-3'。
[0123] hFLS-NC空白对照组：hFLS-siRNA-AD-08实验组中不加 siRNA，其余步骤与 hFLS-siRNA-AD-08 实验组一致。
[0124] MCF-7-NC空白对照组：MCF-7-siRNA-AD-08实验组中不加 siRNA，其余步骤与 MCF-7-siRNA-AD-08 实验组一致。
[0125] 二、转染24小时后，换无血清饥饿培养各组细胞24小时。
[0126] 三、在各组细胞中加入IL l-α，使其终浓度为l〇ng/ml，刺激24小时。
[0127] 四、提取各组细胞的RNA并反转录为cDNA，以各组的cDNA为模板，分别以TNF-F和 TNF-R为引物，以cox2-F和cox2-R为引物，以IL-1I3-F和IL-Iii-R为引物，进行实时荧光 定量PCR，对应的检测TNF、C0X-2和IL-Ιβ基因的表达水平，以β-actin为内参基因。
[0128] TNF-F: 5，-CGAGTGACAAGCCTGTAGCC-3，；
[0129] TNF-R: 5 ' -TGAAGAGGACCTGGGAGTAGAT-3 '。
[0130] cox2-F :5'-CAGGGTTGCTGGTGGTAGGA-3' ；
[0131] cox2-R :5'-GCATAAAGCGTTTGCGGTAC-3' 〇
[0132] IL-Iβ -F :5'-ACGAATCTCCGACCACCA-3' ；
[0133] IL-Iβ -R :5'-GGACCAGACATCACCAAGC-3'。
[0134] 结果如图3中A所示。
[0135] 图3Α中的NTC组均表示的是在之后的步骤中加入上述IL 1- α的NTC组。
[0136] 收集各组细胞的上清液，利用Human IL-I β immunoassay检测试剂盒检测各组细 胞IL-I β的分泌水平。
[0137] 其中，上述的NTC组又分别设如下各组：
[0138] hFLS-No target (NTC+)阴性对照组：hFLS-No target (NTC)阴性对照组在之后的 步骤中加入上述IL l-α。
[0139] hFLS-No target (NTC-)阴性对照组：hFLS-No target (NTC)阴性对照组在之后的 步骤中不加入上述IL l-α。
[0140] MCF-7-No target (NTC+)阴性对照组：MCF-7-No target (NTC)阴性对照组在之后 的步骤中加入上述IL l-α。
[0141] MCF-7-No target (NTC-)阴性对照组：MCF-7-No target (NTC)阴性对照组在之后 的步骤中不加入上述IL l-α。
[0142] 结果如图3中B所示。
[0143] 图3表明，分别与NTC或NTC+相比，siRNA-AD-08在MCF-7与hFLS细胞中均能有 效抑制C0X-2和IL-I β炎症因子的基因表达量，并抑制IL-I β的分泌，其中在hFLS细胞 中对IL-I β的基因抑制率达到88%。在MCF-7细胞中，转染siRNA-AD-08后TNF的基因表 达量高于NTC组，可能是由TNF的细胞功能比较复杂引起的。
[0144] 实施例3、同源寡聚核酸对ADAM17基因抑制效果的验证
[0145] 为验证同源比率对siRNA-AD-08抑ADAM17基因效果的影响，进行以下三组实验：
[0146] 一、第一组实验
[0147] 第一组的 siRNA 反义链均为 "5' -UUGUUCAGAUACAUGAUGC-3' "
[0148] ，正义链为"5' -GCAUCAUGUAUCUGAACAA-3' "的同源序列，如表1所示。
[0149] 表1反义链组
[0150]
【权利要求】
1. 一种化学修饰的双链siRNA分子，是由如下A所示的siRNA分子中至少一条链经过 如下（1)-(13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子： A、一种siRNA分子，为如下1)或2)所不： 1. SEQ ID No. 1所示的RNA单链和SEQ ID No. 2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA 分子； 2. SEQ ID No. 2所示的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有60%以上同源性 的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 或，SEQ ID No. 1所示的RNA单链和与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有60%以上同源 性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 或，与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 1 所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； (1) 磷酸骨架的硫代磷酸修饰； (2) 核糖或脱氧核糖的2' -甲氧基修饰； (3) 核糖或脱氧核糖的2' -氟修饰； (4) 锁核酸修饰； (5) 开环核酸修饰； (6) 吲哚修饰； (7) 碱基的5 -甲基胞嘧啶修饰； (8) 碱基的5-乙炔基尿嘧啶修饰； (9) 单链5'末端胆固醇修饰； (10) 单链3'末端半乳糖修饰； (11) 单链5'末端多肽修饰； (12) 单链5'末端磷酸化修饰； (13) 单链5'末端焚光标记修饰。
2. 根据权利要求1所述的化学修饰的双链siRNA分子，其特征在于：所述化学修饰后 互补而成的双链siRNA分子的正义链和反义链分别具有如下B1和C1所示的序列： Bl、5' -K' -L' P' M' UCAUGUAUCUGAA P' M' M' dTdT-3' ； Cl、5，-R' -Q' Q' L' UUCAGAUACAUGA Q' L' P' dTdT-3' ； 所述K'为5'末端胆固醇修饰； 所述R'为无修饰或5'末端磷酸化修饰； 所述dT为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸； 所述L'、M'、P'和Q'分别为脱氧核糖的2' -甲氧基修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱 氧核糖的2' -甲氧基修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2' -甲氧基修饰的胞嘧啶 脱氧核糖核苷酸和核糖的2' -甲氧基修饰的尿嘧啶核糖核苷酸； 或， 所述L'、M'、P'和Q'分别为鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱 氧核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸。 3?-种siRNA分子，为如下⑴或⑵所不： (l)SEQ ID No. 1所示的RNA单链和SEQ ID No. 2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA 分子； (2) SEQ ID No. 2所示的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有60%以上同源 性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 或，SEQ ID No. 1所示的RNA单链和与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有60%以上同源 性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 或，与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 1 所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子。
4. 根据权利要求3所述的siRNA分子，其特征在于：所述与SEQ ID No. 2所示的RNA单 链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有70%以上同源性的 RNA单链互补而成的双链siRNA分子为SEQ ID No. 3所示的单链和SEQ ID No. 4所示的单 链互补而成的双链siRNA分子。
5. -种能产生权利要求3所述的siRNA分子的DNA分子。
6. 根据权利要求5所述的DNA分子，其特征在于：所述siRNA分子为SEQ ID No. 1所 示的RNA单链和SEQ ID No. 2所示的RNA单链互补而成的双链siRNA分子； 所述DNA分子为含有SEQ ID No. 5中自5'末端起第38-56位核苷酸的DNA分子，具体 为含有SEQ ID No. 5所示的DNA单链和SEQ ID No. 6所示的DNA单链互补而成的双链DNA 的DNA分子，再具体为SEQ ID No. 5所示的DNA单链和SEQ ID No. 6所示的DNA单链互补而 成的双链DNA的分子替换pGCsi-Hl/Neo的BamHI和Hindlll酶切位点间序列，pGCsi-Hl/ Neo的其余序列不变得到的重组siRNA表达质粒。
7. -种试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2所述的化学修饰的双链siRNA分子、权利 要求3或4所述的siRNA分子和/或权利要求5或6所述的DNA分子。
8. 权利要求1或2所述的化学修饰的双链siRNA分子、权利要求3或4所述的siRNA 分子和/或权利要求5或6所述的DNA分子和/或权利要求7所述的试剂盒在制备预防和 /或治疗炎症的产品中的应用； 所述炎症具体为关节炎症，再具体为骨关节炎。
9. 权利要求1或2所述的化学修饰的双链siRNA分子、权利要求3或4所述的siRNA 分子和/或权利要求5或6所述的DNA分子和/或权利要求7所述的试剂盒在制备如下 D1-D4任一所示的产品中的应用： D1、抑制关节表面纤维化的产品； D2、抑制软骨侵蚀的产品； D3、预防和/或治疗滑膜炎的产品； D4、保护软骨和/或滑膜的产品。
10. 权利要求1或2所述的化学修饰的双链siRNA分子、权利要求3或4所述的siRNA 分子和/或权利要求5或6所述的DNA分子和/或权利要求7所述的试剂盒在制备如下 E1-E6任一所示的产品中的应用： E1、预防和/或治疗类风湿性关节炎的产品； E2、预防和/或治疗系统性红斑狼疮的产品； E3、预防和/或治疗多发性硬化症的产品； E4、预防和/或治疗急性感染病的产品； E5、预防和/或治疗特应性皮炎的产品； E6、预防和/或治疗牛皮癣的产品。
【文档编号】A61P19/04GK104498498SQ201410827650
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】张必良, 米其·托尔托雷, 王喆, 杨秀群, 王秋云 申请人:广州市锐博生物科技有限公司, 中国科学院广州生物医药与健康研究院