一种对fad2基因起抑制作用的基因的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种对FAD2基因起抑制作用的基因，它们具有序列表中SEQIDNO：1及SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。本发明为为快速检测提供分子基础，可进一步研究FAD2-RNAi载体基因在花生脂肪酸代谢过程中的作用机理，以便对花生种子的油分组成和含量进行特异性遗传改良，从而达到基因工程技术进行高油酸花生育种的目的。
【专利说明】—种对FAD2基因起抑制作用的基因
【技术领域】
[0001]本发明涉及植 物基因工程领域，具体涉及一种对FAD2基因起抑制作用的基因序列。
【背景技术】
[0002]花生脂肪酸中的油酸具有重要医疗保健功能，能降低有害胆固醇、减缓动脉粥样硬化、预防冠心病等心血管疾病的发生等。但是，存在于花生的植物内质网和叶绿体中的FAD2基因会阻止或减缓花生高油酸性状。想要提高花生脂肪酸中的油酸的含量，就要对FAD2基因进行抑制。
【发明内容】
[0003]技术要求
本发明所要解决的技术问题是提供一种对FAD2基因起抑制作用的基因序列。
[0004]本发明是这样实现的:对FAD2基因起抑制作用的基因序列，它是分别具有序列表中SEQ ID NO:1及SEQ ID NO: 2所示的两个核苷酸序列。
[0005]本发明的原理是:
阻止或减缓花生高油酸性状的基因FAD2存在植物内质网和叶绿体中，与之紧密连锁的Λ 12—脂肪酸去饱和酶基因的RNAi载体基因可抑制对该酶基因的表达，在花生中转录，形成发夹RNA(hpRNA)，发夹臂形成的双链RNA(dsRNA)诱导花生的内源同源RNA的降解，从而调控花生脂肪酸代谢途径，降低花生种子亚油酸含量，从而提高油酸含量。本发明所得出的2个基因序列正是与RNAi紧密连锁的基因序列。
[0006]有益效果
为快速检测提供分子基础，可进一步研究FAD2-RNAi载体基因在花生脂肪酸代谢过程中的作用机理，以便对花生种子的油分组成和含量进行特异性遗传改良，从而达到基因工程技术进行高油酸花生育种的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1目的基因克隆片段与回收片段对比图。
【具体实施方式】
[0008]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0009]本发明的实施例1:对FAD2基因起抑制作用的基因的获得:
一、材料
花生品种为Sunolic95R(美国品种，高油酸)和汕油162 (广西地方品种，低油酸)杂交Fl后代的高低油酸个体。
[0010]二、步骤
UDNA的提取及纯化，采用改良CTAB法提取，纯化，干燥，低温保存。
[0011]2、AFLP操作流程(I)双酶切(2)连接(3)预扩增(PCR反应体系:94°C预变性5min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin，30 个循环，72°C再延伸 5min，4°C保存。
(4)选择性扩增(反应体系为94°C 5min,94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 60s，35个循环(前12个循环每循环降0.7°C，最后退火温度保持56.6°C)，72°C再延伸5min，4°C保存。)(5)聚丙烯酰胺变性胶的制作；洗玻璃板一玻璃板的硅化一装玻璃板一配胶一灌胶一预电泳一扩增产物的变性及上样一电泳一银染(脱色，水洗，染色，显影，终止)一干燥及保存。
[0012]3、克隆测序在聚丙烯酰胺变性胶上割取高低油酸个体有差异的片段，TE溶解24h，煮沸lOmin，离心取上清进行PCR扩增，利用DN快速纯化回收试剂盒回收PCR产物，与克隆载PMD18—T连接。制备Ecoil DHlOB感受态细胞并进行转化，涂布转化产物于LB平板上，37°C倒置培养12~16h。挑取白色菌落，接种于含Amp的LB液培养基上于37°C摇床上培养12h，穿刺培养15 h送于上海鼎安生物技术有限公司进行测序。
[0013]4、序列分析在NCB工主页的nucletide blast选项中，将已克隆的待测基因cDNA片段与GenBank数据库中进行同源性比较，用BioXM2.6和DNAssist软件进行序列分析，找到2个与Δ 12—脂肪酸-RNAi载体基因连锁的2个基因序列。
[0014]它们的序列号如下:
分析成功所得到的2个FAD2基因的RNAi植物表达载体基因高度同源，序列同源性达到88-97%，与GenBank中已登记的的FAD2 — RNAi载体基因序列的相似性均达到85%以上，性状表明本发明获得的2个cDNA序列可能为编码Λ 12_脂肪酸脱氢酶基因的RNAi载体基因部分序列。
[0015]本发明涉及的序列及记号分列如下:
基因序列一
CGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGCCGACGATTGACTGCGTACCAATTCACCATGTTACTCAGGACTCATCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTG基因序列
CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGATGA
GTCCTGAGTAACCCAGTGAATTGGTACGCAGTCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAAT
TCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAG
【权利要求】
1.一种对FAD2基因起抑制作用的基因序列，其特征在于:它是分别具有序列表中SEQID NO:1及SEQ ID NO: 2所示的·两个核苷酸序列。
【文档编号】C12N15/29GK103497955SQ201310462216
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】张宁洁, 杜才富, 赵继献, 文克俭 申请人:贵州省油菜研究所