粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法
【专利摘要】本发明涉及一种粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法。所述方法包括：在获得粗枝云杉的体细胞胚后，对体细胞胚采用“滤纸桥法”、“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理0～21天，然后再进行萌发。本发明提供了一种粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，包括了基于体细胞胚颜色变化的干化标记策略，能够极显著地提高体细胞胚的萌发率；同时，体细胞胚萌发的质量也得到明显提高；而且不会受到基因型和细胞系的影响，具有普遍的适用性；为实现粗枝云杉体细胞胚的工厂化育苗奠定了理论基础，并提供了切实可行的技术方案。
【专利说明】粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法【技术领域】[0001]本发明涉及林业中细胞工程种苗繁殖领域，具体地，涉及一种粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法。【背景技术】[0002]植物体细胞胚胎发生技术，是指在离体条件下，已分化的体细胞在特定的环境条件下，发育成与合子胚类似的胚状体的过程。植物体细胞胚胎发生是利用细胞工程手段实现植株再生的重要途径之一，作为一种利用人工手段能够最大限度地实现植物扩繁的措施，尤其对于难以扦插繁殖且繁殖周期较长的针叶树树种来说具有巨大的应用价值。同时， 由于体细胞胚和合子胚具有相似的形态结构和发育过程，体细胞胚胎发生过程又具有相对的遗传稳定性；开展植物体细胞胚胎发生的研究，已经为揭示植物胚胎的发生机理研究和开展遗传转化研究提供了一种模式研究系统。[0003]一个完整的植物体细胞胚胎发生技术包括胚性愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的增殖、体细胞胚的分化和成熟体细胞胚的萌发等四个阶段；其中，成熟体细胞胚的萌发阶段作为整个技术体系的最后一步，体细胞胚萌发率的高低及萌发质量，直接决定着最终体胚苗的收获量和整个体胚技术体系构建的成败。目前，在针叶树树种体细胞胚萌发阶段， 为提高体细胞胚的萌发率和萌发质量，国外常用的方法是将体细胞胚萌发之前进行干化 (Desiccation)预处理。通常，失水现象是体细胞胚由成熟阶段向萌发阶段转变的最直接响应，可以促使体细胞胚由形态成熟向萌发所需的生理成熟转变；因此，对体细胞胚而言，给予适当的干化失水处理，不仅能够抑制分化培养基中体细胞胚的提早萌发，还能够提高体细胞胚在萌发阶段中的萌发数量和质量。[0004]一般根据体细胞胚失水速率的变化，可以将体细胞胚的干化处理方法分为完全干化(Full Desiccation)和部分干化(Partial Desiccation)两种；前者主要由渗透压调节物质实现，而后者主要通过水蒸气变化调节。尽管干化处理能够提高萌发频率，然而影响干化处理效果的因素有很多:干化方法的差异、干化处理持续的时间、树种的不同、甚至相同树种不同基因型之间对相同干化处理方法的响应都存在很大差异。如果不考虑影响干化处理效果的因素，采用单一的干化处理条件，肯定不能够满足所有基因型或者细胞系体细胞胚的萌发需要。因此，国外有学者甚至提出，每一个细胞系都可能对应一个独一无二的干化处理方案，若想建立合适的干化处理方案，需要对每个细胞系的体细胞胚干化条件逐一探索。这种逐一探索的方法费时费力，在实际生产中可行性较差。[0005]粗枝云杉(Picea asperata Mast)为松科,云杉属树种，国内俗称云杉,为我国特有种，也是我国分布最广的云杉属树种。常绿乔木，高达45m，胸径达lm。主要分布于川西高原、甘肃东南部和陕西西南部的亚高山地区，平均海拔分布在2400~3600m的高山丘陵地带。木材黄白色，较轻软，纹理直，结构细，有弹性。是重要的造纸、建筑、家具及木纤维工业的原材料。材质优良，生长快，适应性强，是分布区的主要造林树种。目前，人工造林用苗 主要通过实生繁殖，但粗枝云杉结实晚，种子成熟率低，且伴有严重的“大小年”现象，致使粗枝云杉优良种苗供不应求。[0006]在过去几年，本申请的发明人尝试首次构建粗枝云杉体细胞胚胎发生技术体系。 在此过程中，胚性愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的增殖、体细胞胚的分化等阶段的技术体系已经非常成熟，并符合生产需要。然而，在体细胞胚的萌发过程中，尽管经过大量的探索工作，对影响体细胞胚萌发的因素做了尽可能多的尝试，筛选出的萌发条件虽能显著地提高粗枝云杉体细胞胚的萌发率，但是萌发率还是不够高(平均为20%左右)，仍然不能尽可能高地满足实际生产的需要。[0007]因此，若能在粗枝云杉体细胞胚萌发之前，确定其合适的干化处理方法，可以极显著地提高体细胞胚的萌发率和明显提高体细胞胚萌发的质量；并且该处理方法如果不会受到基因型和细胞系的影响，具有普遍的适用性，将为实现粗枝云杉体细胞胚的工厂化育苗， 提供了巨大的应用前景。
【发明内容】
[0008]为了解决现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法。[0009]为了实现上述目的，本发明提供的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，包括:在获得粗枝云杉的体细胞胚后，对体细胞胚采用“滤纸桥法”、“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理O~21天，然后再进行萌发。[0010]本发明所述的方法，优选对体细胞胚采用“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理。[0011]本发明所述的方法，更优选对体细胞胚采用“滤纸法”的方式进行干化处理。[0012]其中，所述的“滤纸桥法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个培养容器内，然后将该培养容器(放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器)放置在另一个更大的培养容器内，在更大的培养容器内放置水，用滤纸覆盖在放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器上做成“滤纸桥”，最后将更大的培养容器封口。[0013]其中，所述的“空培养容器法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个培养容器内，然后将该培养容器(放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器)放置在另一个更大的培养容器内， 在更大的培养容器内放置水，最后将更大的培养容器封口。[0014]其中，所述的“滤纸法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个垫有一层以上滤纸的培养容器内，然后将该培养容器(放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器)放置在另一个更大的培养容器内，在更大的培养容器内放置水，最后将更大的培养容器封口。[0015]其中，所述的“滤纸法”中，放置粗枝云杉体细胞胚的培养容器内垫有滤纸的层数优选I~4层，更优选3层。[0016]本发明中，在培养容器内放置的滤纸可以大小相同，也可以不同，但最好相同。[0017]本发明中，所用的培养容器可以为塑料培养皿或玻璃培养皿，优选玻璃培养皿。[0018]本发明所述的方法，优选干化处理I~14天，更优选7~14天，最优选14天。[0019]其中，对体细胞胚进行干化处理的条件还包括:温度为23~25°C ;光照强度为 15 ~18 μ mo I.m 2.s S 优选 15 μ mo I ^m2-S10[0020]其中，采用液体悬浮`增殖或半固体增殖的胚性愈伤组织分别进行体细胞胚的分化培养，获得粗枝云杉的体细胞胚。[0021]本发明所述的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，还包括:在对粗枝云杉的体细胞胚进行干化处理后，对体细胞胚进行干化标记，然后再进行萌发。[0022]其中，对体细胞胚进行干化标记的方式为:根据干化处理后体细胞胚颜色的变化， 将其标记成三种类型:“无变化型”，“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”。[0023]进一步地，对标记为“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。[0024]更进一步地，对标记为“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。[0025]本发明提供的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，包括:在获得粗枝云杉的体细胞胚后，对体细胞胚采用“滤纸桥法”、“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理O~21天，对体细胞胚进行干化标记，然后再进行萌发。[0026]其中，对体细胞胚进行干化标记的方式为:根据干化处理后体细胞胚颜色的变化， 将其标记成三种类型:“无变化型”，“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”。[0027]进一步地，对标记为“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。[0028]更进一步地，对标记为“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。[0029]本发明提供的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，包括:在获得粗枝云杉的体细胞胚后，对体细胞胚采用“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理O~21 天，对体细胞胚进行干化标记，然后再进行萌发。[0030]其中，对体细胞胚进行干化标记的方式为:根据干化处理后体细胞胚颜色的变化， 将其标记成三种类型:“无变化型”，“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”。[0031]进一步地，对标记为“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。[0032]更进一步地，对标记为“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。[0033]其中，所述的“滤纸桥法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个培养容器内，然后将该培养容器(放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器)放置在另一个更大的培养容器内，在更大的培养容器内放置水，用滤纸覆盖在放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器上做成“滤纸桥”，最后将更大的培养容器封口。[0034]其中，所述的“空培养容器法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个培养容器内，然后将该培养容器(放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器)放置在另一个更大的培养容器内， 在更大的培养容器内放置水，最后将更大的培养容器封口。[0035]其中，所述的“滤纸法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个垫有一层以上滤纸的培养容器内，然后将该培养容器(放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器)放置在另一个更大的培养容器内，在更大的培养容器内放置水，最后将更大的培养容器封口。[0036]本发明提供的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，包括:对粗枝云杉的体细胞胚进行干化处理后，再进行干化标记，然后进行萌发。`[0037]其中，所述干化标记的方式为:根据体细胞胚颜色的变化情况，将其标记成三种类型:“无变化型”，“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”。[0038]其中，标记为“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚，其所需的干化时间为O~21天,优选I~14天,更优选7~14天,最优选14天。[0039]进一步地，对标记为“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。[0040]更进一步地，对标记为“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。[0041]本发明所述方法中，对体细胞胚进行萌发，所用的培养基为:1/4LM培养基，加入鹿糖20g.L_\凝胶6g.L—1和活性炭2g.L_\再附加谷氨酰胺500mg.L—1和水解酪蛋白 Ig.L'[0042]截至目前为止，国内关于针叶树树种体细胞胚的干化处理尚未见报道。本申请的发明人首次对国内针叶树树种粗枝云杉的体细胞胚进行干化处理，研究表明干化处理能够普遍促进粗枝云杉体细胞胚的萌发。基于干化处理后体细胞胚颜色的变化，将“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚作为最适合萌发的干化标记，这种标记极大地提高了体细胞的干化处理效率，避免了干化处理的盲目性。同时，这种标记不依赖于基因型和细胞系， 避免了相同干化方法处理下不同来源的体细胞胚萌发率提高不一致的问题。这种标记研究思路，不仅在国内属于首创，国外很多学者进行尝试也未见成功报道。[0043]本发明提供的方法，是专门针对粗枝云杉体细胞胚萌发率低和萌发质量不高的问题，体细胞胚的萌发状况无法满足利用体细胞胚胎发生技术实现植株的规模化生产的需要。和现有国际上同属或同类树种研究的报道相比，本发明提供的粗枝云杉体细胞胚的干化方式，操作更为简单，成本更加低廉；同时干化标记的方法更加高效和新颖，目前尚未见干化标记的应用报道，研究处于领先水平。目前，针叶树树种的体细胞胚萌发率一直很低， 萌发质量也不高，极大制约了体细胞胚胎发生技术的实际生产应用。干化处理后基于体细胞胚颜色变化而进行的体细胞胚的干化标记，这种研究思路极大地提高了粗枝云杉体细胞胚的萌发率和萌发质量，满足了实际生产的需要。[0044]总之，本发明提供了一种粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，包括了基于体细胞胚颜色变化的干化标记策略；本发明的方法能够极显著地提高体细胞胚的萌发率 (达到30%以上，最高可达80%以上);同时，体细胞胚萌发的质量也得到明显提高；而且不会受到基因型和细胞系的影响，具有普遍的适用性；为实现粗枝云杉体细胞胚的工厂化育苗奠定了理论基础，并提供了切实可行的技术方案。【专利附图】
【附图说明】[0045]图1为液体悬浮增殖所分化产生的大量且同步化程度较高的体细胞胚。[0046]图2为半固体增殖所分化产生的大量且同步化程度较高的体细胞胚。[0047]图3为实施例2中，用“滤纸法”干化处理中的体细胞胚。[0048]图4为实施例5中，干化处理14天后，“无变化型”的体细胞胚。[0049]图5为实施例5中，干化处理14天后，“胚根淡红色型”的体细胞胚；其中a为淡黄色的子叶和胚轴部分，b为淡红色的胚根部分。[0050]图6为实施例5中，干化处理14天后，“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚；其中a为绿色的子叶和胚轴部分，b为红色的胚根部分。[0051]图7为实施例6中，`“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚萌发3周后产生的高同步化和生长健壮的幼苗。【具体实施方式】[0052]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。[0053]本发明提供的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，研究过程包括:[0054](I)高同步化粗枝云杉体细胞胚的获得；[0055](2)筛选出适合粗枝云杉体细胞胚的干化方式；[0056](3)筛选合适的干化时间；[0057](4)干化处理方式的普遍适用性论证；[0058]( 5)干化标记的对比筛选；[0059](6)干化方式的进一步优化筛选。[0060]上述高同步化粗枝云杉体细胞胚的获得中:胚性愈伤组织采用液体悬浮增殖或半固体增殖的方式进行，将这两种方式增殖的胚性愈伤组织分别进行体细胞胚的分化培养， 由于分化培养基前期经过优化(即粗枝云杉体细胞胚胎发生体系中的条件筛选)，因此均可以获得量大且高同步化的体细胞胚，为后续体细胞胚的干化处理提供均一化的材料奠定了基础。[0061]上述适合粗枝云杉体细胞胚干化方式的筛选中:采用“滤纸桥法”、“空培养容器法”和“滤纸法”三种干化方式进行对比，优选“空培养容器法”或“滤纸法”，进一步地优选 “滤纸法”。采用“滤纸法”的干化方式，不仅能够使体细胞胚处于相对干燥的环境，促进体细胞胚经历一个充分的干化过程；同时，采用“滤纸法”的干化方式，体细胞胚能够发生颜色变化，为基于颜色变化情况而进行的干化标记提供了可能。[0062]上述合适的干化时间的筛选中:干化时间为O~21天，优选I~14天，更优选7~ 14天，最优选14天。干化14天后，能够最大限度地提高体细胞胚的萌发率。[0063]上述干化处理方式的普遍适用性论中:采用液体悬浮增殖和半固体增殖两种方式增殖的细胞系所分化得到的体细胞胚为材料，按照本发明的方法进行干化处理，然后进行萌发，均得到了较高的萌发率，说明本发明的干化处理对粗枝云杉不同细胞系的体细胞胚的萌发促进作用具有普遍的适用性。 [0064]上述干化标记的对比筛选中:根据对粗枝云杉的体细胞胚进行干化处理后，体细胞胚颜色的变化情况，将体细胞胚分成三种类型(即进行干化标记):“无变化型”，“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”。将干化处理并标记后的这三种类型的体细胞胚分别进行萌发，经统计“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的萌发率较高，“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的萌发率最高。这种对体细胞胚进行的干化标记研究， 属于首次报道。[0065]上述干化方式的进一步优化筛选中:在采用“滤纸法”的干化方式中，在放置粗枝云杉体细胞胚的培养容器内垫有I层以上的干燥无菌滤纸，优选I~4层，更优选3层。此种干化方式不仅使得干化处理效率进一步提高，同时极大地降低了干化处理成本。[0066]也就是说，本发明提供的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，包括:在获得粗枝云杉的体细胞胚后，对体细胞胚采用“滤纸桥法”、“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理O~21天，然后再进行萌发。[0067]作为优选的实施方式，采用液体悬浮增殖或半固体增殖的胚性愈伤组织分别进行体细胞胚的分化培养，获得粗枝云杉的体细胞胚。[0068]所述体细胞胚的分化培养，所用培养基为:1/2LM培养基+脱落酸16mg.L^+PEG (聚乙二醇)400050g.L-1+蔗糖30g.L-1+活性炭Ig.L-1+凝胶4g.L-1，附加谷氨酰胺 500mg.L-1和水解酪蛋白Ig.L'使用此种培养基，并添加上述相关成分可以获得大量且同步化程度较高的体细胞胚。也可以采用其他培养基，但本发明的效果较优。[0069]在液体悬浮增殖的胚性愈伤组织进行体细胞胚的分化培养中，胚性愈伤组织的细胞体积和分化培养基的体积比为1:3。[0070]作为优选的实施方式，对体细胞胚采用“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理。[0071]作为进一步优选的实施方式，对体细胞胚采用“滤纸法”的方式进行干化处理。[0072]本发明所述的“滤纸桥法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个培养容器内，然后将该培养容器(放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器)放置在另一个更大的培养容器内，在更大的培养容器内放置无菌水，用两层润湿滤纸覆盖在放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器上做成“滤纸桥”，最后将更大的培养容器封口。[0073]本发明所述的“空培养容器法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个培养容器内， 然后将该培养容器(放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器)放置在另一个更大的培养容器内，在更大的培养容器内放置无菌水，最后将更大的培养容器封口。[0074]本发明所述的“滤纸法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个垫有一层以上无菌滤纸的培养容器内，然后将该培养容器(放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器)放置在另一个更大的培养容器内，在更大的培养容器内放置水，最后将更大的培养容器封口。[0075]作为优选的实施方式，在所述“滤纸法”中，放置粗枝云杉体细胞胚的培养容器内垫有滤纸的层数为I~4层，更优选3层。[0076]本发明中，在培养容器内放置的滤纸可以大小相同，也可以不同，但最好相同。所用的培养容器可以为塑料培养皿或玻璃培养皿，优选玻璃培养皿。[0077]作为进一步优选的实施方式，干化处理I~14天，更优选7~14天，最优选14天。[0078]而对体细胞胚进行干化处理的条件还包括:培养室温度(24±1) °C, Ιδμ,ο?.,2.s-1光照下进行干化处理。所有操作在无菌条件下进行，所采用的培养皿、滤纸和提供无菌环境的去离子水，全部需要高压灭菌后使用。[0079]本发明所述的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，还包括:在对粗枝云杉的体细胞胚进行干化处理后，对体细胞胚进行干化标记，然后再进行萌发。[0080]所述对体细胞胚进行干化标记的方式为:根据干化处理后体细胞胚颜色的变化情况，将其标记成三种类型:“无变化型”，“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”。
[0081]作为优选的实施方式，对标记为“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。[0082]作为进一步优选的实施方式，对标记为“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。[0083]本发明提供的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，包括:对粗枝云杉的体细胞胚进行干化处理后，再进行干化标记，然后进行萌发；对体细胞胚进行干化标记的方式为:根据干化处理后体细胞胚颜色的变化，将其标记成三种类型:“无变化型”，“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”。[0084]作为优选的实施方式，对标记为“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。[0085]作为进一步优选的实施方式，对标记为“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。[0086]并且，在本发明提供的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法中，标记为“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚，其所需的干化时间为O~21天，优选I~14天，更优选7~14天,最优选14天。[0087]本发明所述方法中，对体细胞胚进行萌发，所用的培养基为:1/4LM培养基+蔗糖 20g.I71+凝胶6g.I71+活性炭2g.I71,附加谷氨酰胺500mg.L-1和水解酪蛋白Ig.L' 也可以采用其他培养基，但本发明的效果较优。[0088]本发明所述方法中，分化或萌发所用培养基中:由于使用的脱落酸和谷氨酰胺不耐高温，可以采用过滤的方式灭菌，其他所有成分均采用高温高压方式灭菌。[0089]本发明所述方法中，体细胞胚的分化阶段和萌发阶段的培养基:加凝胶前将pH调至5.8，随后在1211:、压力IOlkp高温、高压条件下灭菌20分钟后使用。也可以采用其他方式，但本发明的效果较优。[0090]本发明所述方法中，对体细胞胚进行萌发的条件包括:培养温度为(24±1) V;第一周(以7天为周期)黑暗培养；第二周(以7天为周期),在20μηιο1.m_2.s—1光照下,每天的光周期为16小时光照培养和8小时黑暗培养；随后在50 μ mo I.m_2.s—1光照下,每天的光周期为16小时光照培养和8小时黑暗培养。也可以采用其他方式，但本发明的效果较优。[0091]本发明所述方法中，对体细胞胚进行萌发，在萌发过程中，将体细胞胚水平放置于半固体培养基表面，培养皿倾斜45°角放置，有利于子叶伸展、胚轴和胚根伸长；同时，生长的胚根附着在培养基表面，避免了移栽时幼嫩苗根受损，有利于移栽成活。[0092]本发明所用凝胶,为植物凝胶gellan gum,采用Sigma品牌；它是一种冷凝胶,跟琼脂的作用相同，但效果要好很多，具体表现为培养基的凝结速度和透明程度均明显提高。 本发明所使用的活性炭activated carbon,同样采用Sigma品牌,和一般市场上所售的活性炭相比，其活性吸附能力更强，能够有效地清除培养基中的酚类等有毒物质。本发明所使用的水为去离子水，纯度为18.2兆欧。[0093]本发明所用其他原料和试剂均为从市场上购得的常规试剂，未提及的操作方式和检测方式也均为本领域常规的操作方式。[0094]LM培养基的成分为:[0095]大量元素:1.65g.IZ1NH4NO3, 1.9g.IZ1KNO3, 1.85g.IZ1MgSO4.7H20， 0.34g.L^1KH2PO4j0.022g.L-1CaCl2.2H20 ；[0096]微量元素:0.0304g.L^1H3BO3j0.043g.L-1ZnSO4.7H20，0.021g.L-1MnSO4.H2O, 0.00 126g.L^1Na2MoO4.2H20, 0.00415g.L-1KI, 0.0005g.L-1CuSO4.5H20, 0.000125g.T1CoCl2GH2O ；[0097]铁盐:0.0278g.L-1FeSO4.7H20，0.0373g.L-1EDTA.2H20 (乙二胺四乙酸)；[0098]肌醇:0.1g.L-1Myo-1`nositol ；[0099]有机盐:0.0OOlg.L-1Thiamine-HCl (Vitamin B1), 0.0005g.T1Niacin acid(Vitamin B3), 0.0OOlg.L-1Pyroxidone-HCl (Vitamin B6)。
[0100]本发明出现的1/2LM培养基，就是对上述LM培养基的成分，将大量元素、微量元素和铁盐减半，其他不变。本发明出现的1/4LM培养基，就是对上述LM培养基，将大量元素、微量元素和铁盐减到1/4，其他不变。本发明出现的半固体培养基，就是在上述1/2LM培养基中添加凝胶。本发明出现的1/2LM液体培养基，就是对上述LM基本培养基，将大量元素、微量元素和铁盐减半，其他不变，同时培养基中不添加凝胶。
[0101]培养基中的各营养成分实际使用时先配制母液，然后稀释使用。将大量元素和铁盐的母液配制成100倍，微量元素配制成1000倍，肌醇和有机盐配制成500倍。其中，为了避免大量元素中的CaCl2.2H20和其他成分结合而形成沉淀，将其单独配制。
[0102]本发明的内容是在2011~2013年间对粗枝云杉体细胞胚胎发生体系构建的基础上进行的。在粗枝云杉体细胞胚胎发生体系构建过程中，通过大量对比试验，已经获得了体细胞胚最适合的分化培养基和萌发培养基。所采用的实验材料，在实验室保存有一年时间，不同细胞系能够代表粗枝云杉体细胞胚胎发生体系过程的普遍性，也能代表干化处理方式的普遍适用性。
[0103]本发明的萌发率均指所统计的平均萌发率。
[0104]实施例1
[0105]高同步化粗枝云 杉体细胞胚的获得:根据胚性愈伤组织增殖的方式分为两种分化方式获得:一种是对建立起液体悬浮增殖(用的是1/2LM液体培养基)体系的细胞系1921和1931而言，将悬浮增殖的胚性愈伤组织按照静置时细胞体积和无激素添加的液体增殖培养基(B卩1/2LM液体培养基)两者的体积比为1:3的比例混合，取摇匀的添加胚性愈伤组织的培养基5mL放置在一张滤纸(Whatman?2 )上,用布氏漏斗抽滤掉液体培养基后，将附有胚性愈伤组织的滤纸转接到分化培养基上培养；另一种是对于半固体增殖的细胞系1113、1911、1921、2322、2614和2711而言，将转接增殖2周后的胚性愈伤组织直接平铺到滤纸(Whatman?2)上，随后在分化培养基上培养。两种方式米用相同的分化培养基和培养条件:1/2LM 培养基 + 脱落酸 16mg.r1+PEG400050g.L-1+ 蔗糖 30g.L-1+ 活性炭 Ig.L-1+ 凝胶4g.L-1，附加谷氨酰胺500mg.L-1和水解酪蛋白Ig.L-1 ;加凝胶前将培养基pH调至5.8，随后在121°C、压力IOlkp高温、高压条件下灭菌20分钟后使用；(24±1)°C黑暗培养，7周(以7天为周期)后分化产生的成熟体细胞胚作为实验材料。
[0106]需要说明的是:本实验的细胞系1921同时采用两种增殖方式进行研究，能够使得结果更加可靠。
[0107]这两种增殖方式是目前胚性愈伤组织增殖过程中最常用的方式。采用液体悬浮增殖或半固体增殖的胚性愈伤组织，分别进行体细胞胚的分化，并对体细胞胚进行干化处理，更能说明干化处理作用的广泛适用性。同时，由于分化培养基中有相同的最适合体细胞胚分化的培养基成分，因此黑暗分化7周后，两种增殖方式下保持的胚性愈伤组织均能够获得数量较大和同步化程度非常高的体细胞胚(如图1和图2所示，其中图1为液体悬浮增殖所分化产生的大量且同步化程度较高的体细胞胚，图2为半固体增殖所分化产生的大量且同步化程度较高的体细胞胚)；保证了干化处理过程中体细胞胚的均一性，使得干化处理结果更加可靠。[0108]实施例2
[0109]粗枝云杉体细胞胚干化方式的筛选:以实施例1中1921液体悬浮增殖系分化的体细胞胚为材料，采用目前国外常用的“滤纸桥法”，“空培养容器法”和本实验室建立的“滤纸法”进行三种干化方法的比较。具体地:“滤纸桥法”即将体细胞胚放置在塑料培养皿(35X12mm)中，随后将塑料培养皿放置在更大的玻璃培养皿(87X 15mm)内，在玻璃皿中放置IOmL无菌水，用两层湿润滤纸覆盖在塑料皿上做成“滤纸桥”，最后将玻璃皿用封口膜封口。“空培养容器法”操作同“滤纸桥法”，只是不做“滤纸桥”。“滤纸法”(如图3所示，其反映干化处理过程中的整体状态)即将发育完全的体细胞胚放置在垫有两层无菌干燥滤纸(相同大小)的塑料培养皿(35 X 12mm)中，随后将塑料皿放置在更大的无菌玻璃培养皿(87X15mm)内，玻璃皿中放置IOmL无菌水，这样使得体细胞胚处于一个相对干燥的环境中，玻璃皿用封口膜封口。随后，将这三种方法干化处理的体细胞胚放置在15 μ mol.π2 *s_1的弱光、并于(24±1) °C的温度下干化培养2周(以7天为周期)。
[0110]观察塑料培养皿内体细胞胚的形态及颜色变化，干化结果如下表所示:
[0111]
【权利要求】
1.一种粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，包括:在获得粗枝云杉的体细胞胚后，对体细胞胚采用“滤纸桥法”、“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理O~21 天，然后再进行萌发。
2.根据权利要求1所述的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，其特征在于，对体细胞胚采用“空培养容器法”或“滤纸法”的方式进行干化处理；优选对体细胞胚采用“滤纸法”的方式进行干化处理。
3.根据权利要求1或2所述的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，其特征在于， 所述的“滤纸桥法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个培养容器内，然后将该培养容器放置在另一个更大的培养容器内，在更大的培养容器内放置水，用滤纸覆盖在放置有粗枝云杉体细胞胚的培养容器上做成“滤纸桥”，最后将更大的培养容器封口 ；所述的“空培养容器法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个培养容器内，然后将该培养容器放置在另一个更大的培养容器内，在更大的培养容器内放置水，最后将更大的培养容器封口 ；所述的“滤纸法”为:将粗枝云杉体细胞胚放置在一个垫有一层以上滤纸的培养容器内，然后将该培养容器放置在另一个更大的培养容器内，在更大的培养容器内放置水，最后将更大的培养容器封口。
4.根据权利要求3所述的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，其特征在于，所述的“滤纸法”中，放置粗枝云杉体细胞胚的培养容器内垫有滤纸的层数为I~4层，优选 3层。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，其特征在于，干化处理I~14天，优选7~14天，更优选14天。
6.根据权利要求5所述的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，其特征在于，对体细胞胚进行干化处理的条件还包括:温度为23~25 °C ;光照强度为15~ 18 μ mo I.π-2.s-1。
7.根据权利要求1~6任意一项所述的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法， 其特征在于，采用液体悬浮增殖或半固体增殖的胚性愈伤组织分别进行体细胞胚的分化培养，获得粗枝云杉的体细胞胚。
8.根据权利要求1~7任意一项所述的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，其特征在于，该方法还包括:在对粗枝云杉的体细胞胚进行干化处理后，对体细胞胚进行干化标记，然后再进行萌发；对体细胞胚进行干化标记的方式为:根据干化处理后体细胞胚颜色的变化，将其标记成三种类型:“无变化型”，“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”。
9.一种粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，包括:对粗枝云杉的体细胞胚进行干化处理后，再进行干化标记，然后进行萌发；所述干化标记的方式为:根据体细胞胚颜色的变化情况，将其标记成三种类型:“无变化型”，“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”。
10.根据权利要求9所述的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法，其特征在于，标记为“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚，其干化时间为O~21天，优选1~14 天，更优选7~14天，最优选14天。
11.根据权利要求8~10任意一项所述的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法， 其特征在于，对标记为“淡红色胚根型”和“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发；优选对标记为“绿色子叶和胚轴及红色胚根型”的体细胞胚进行萌发。
12.根据权利要求1~11任意一项所述的粗枝云杉体细胞胚萌发前的干化处理方法， 其特征在于，对体细胞胚进行萌发，所用的培养基为:1/4LM培养基，加入蔗糖 凝胶 6g.L—1和活性炭2g.L_S再附加谷氨酰胺500mg.L—1和水解酪蛋白Ig.L'
【文档编号】C12N5/04GK103497928SQ201310462072
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】王军辉, 张建伟, 张守攻 申请人:中国林业科学研究院林业研究所