patatin-like磷脂酶及其编码基因与用途
【专利摘要】本发明公开了一种patatin-like磷脂酶及其编码基因与用途；本发明所述的来源于深海宏基因组的patatin-like磷脂酶基因，该基因大小为912bp，序列如SEQ?ID?NO.1所示，编码303个氨基酸，序列如SEQ?ID?NO.2所示，蛋白分子量为33kDa，等电点为6.21。本发明克隆得到了深海plp基因，并首次分析了其产物及摸索出通过基因工程大量制备该酶蛋白的方法。所述PLP蛋白可水解对硝基苯酚乙酸酯pNPA、对硝基苯酚丁酸酯pNPB、对硝基苯酚辛酸酯pNPO、对硝基苯酚癸酸酯pNPDE、对硝基苯酚月桂酸酯pNPDO。本发明提供的PLP可水解脂类物质，具有工业化生产潜力和经济价值。
【专利说明】patat in-1 i ke磷脂酶及其编码基因与用途
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种patatin-like磷脂酶及其编码基因与用途。
【背景技术】
[0002]酶是一种生物催化剂，周围环境(温度、pH、有机试剂等)对它的活性影响很大，很多酶在一些比较苛刻的反映条件下(高温、低温或者强酸碱环境)均会失去活性，这就限制了其应用范围。极端微生物产生的极端酶一直以来都是研究的热点。极端微生物酶的发现，正好弥补了这一不足。其中来源于嗜热微生物的嗜热酶具有独特的生物稳定性和催化活性。利用嗜热酶作为生物催化剂的优点为:(I)酶制剂的制备成本低。(2)对反应器冷却系统的要求标准低，从而减少了能量的消耗。(3)高温反应条件降低了中温微生物污染反应体系的危险，从而提高了产物纯度。(4)高温反映条件提高了反应速率和产率。由于嗜热酶具有催化效率高和底物专一性强，且酶稳定性极好等特性，因而能够在苛刻的工业生产过程中发挥重要的作用。
[0003]酯类降解酶是所有能够催化酯类化合物水解的酶类的总称。根据作用底物脂肪酸侧链的不同，该类酶可分为3大类，即脂肪酶、酯酶及磷脂酶。脂肪酶水解脂肪酸侧链长度大于10个碳的甘油三酯；酯酶水解脂肪酸侧链小于10个碳的甘油三酯；而磷脂酶的水解底物为不同类型的磷脂。酯 类降解酶可以催化不同酯类的水解合成反应，在生物体内具有重要的生理功能，而且还具有较高的应用价值。酯类降解酶在食品、医药卫生、化学化工、环境保护及能源开发等许多工业领域均具有广泛的应用。比如，脂肪酶可用于作家庭或工业用清洁剂的添加剂；酯酶可应用于奶制品的增香、无脂肪肉的生产、清除有机磷杀虫剂的污染等；磷脂酶可用于抗炎药物、抗肿瘤药物的研制和生产，还可用于油脂脱胶。
[0004]酯降解酶来源丰富，由于微生物来源酯降解酶具有种类繁多、容易大量快速制备和成本低等特点，已经成为当前业应用的最重要途径。但是大部分野生菌株的酯降解酶生产能力往往很有限，无法满足工业生产的要求此外，为了适应工业生产过程中苛刻的反映条件(高温、高压、高酸、高离子浓度以及重金属离子超标的极端环境)。比如在油脂工业，在进行高品质油脂生产过程中，需要对油脂进行脱胶处理以除去磷脂，进而提高油脂的纯度和质量。而高品质油脂生产通常采用物理和化学方法以及酶法进行脱胶。其中酶法脱胶由于工艺相对简单、效率高、环境污染小等优点而受到广泛的青睐。此外，在乳制品加工行业，酯类降解酶的水解催化作用能够在不改变原有奶酪质量的同时提高产量。在烘焙工业中，该类酶可以替代或者增强传统的乳化剂，通过对面粉的极性脂类物质的酶解作用提高产品的乳化质量。油脂脱胶化过程需要较高的温度(70-80°C)，常规酶(猪胰磷脂酶在60°C以内表现最佳活力)，由于反应温度的限制，使脱胶过程的效率和成本都不能达到最佳程度。
[0005]因此需要我们一方面对现有的酯降解酶进行改造，以适应生产的需要，另一方面需要我们继续从环境中寻找特殊的、新的酶源。在人类极少涉足的深海环境中蕴藏有丰富的生物基因资源。随着我国深海探测技术进步和深海微生物研究的深入，各种深海极端酶已成为获取新型生物催化剂的重要来源。特别的，深海热液区域环境条件特殊，存在极高的海水压力(可达300atm)，喷口处更有高达400°C的海水温度并存在急剧的温度变化(4-4000C ) 0瓜伊马斯海盆是加利福尼亚湾众多半封闭海盆中的一个，它大致在最近350万年内由海底扩张形成。两个断陷位于比较平的盆地底内，由一转换断层水平错开约20公里。富饶的表层水和来自下加利福尼亚及墨西哥大陆的内陆性输入导致海底沉淀物深达400多米。相比于其他已知的深海热泉，瓜伊马斯海盆的独特性在于其不断积聚的沉积物中有机物质在高温条件下被热解成类石油产物如汽油酯、芳香烃以及浙青物质，因此在这个环境中存在着大量的生物。特别的，近年来微生物环境基因组学技术体系的建立使从不可培养微生物样品中直接获得酶资源成为可能。
[0006]前期我们已构建瓜伊马斯深海宏基因组文库，进一步地，通过构建亚克隆文库，筛选得到一个大小为3.3kb的亚克隆子。测序分析表明，该DNA片段包含4个开放阅读框，通过同源序列比对，确定其中一个阅读框为patatin-like磷脂酶(命名为:PLP)。PLP在序列上与目前已报道的酶同源性较低，最高不到45 其中与Caldithrix abyssi中的patatin、Brevibacillus Iaterosporus中的酯酶具同源性最高,而这些酶的特征目前还未被详细报道。此外，根据目前已报道的文献和已构建的进化树分析，该酶为一个新酶。PLP与目前已报道的Mahella australiensis DSM15567 (No:F4A375)具有较近的亲缘关系，而后者属于Thermoanaerobacterales,且PLP来源于瓜伊马斯热液口样品，因此推测PLP具有较好的热稳定性。
[0007]对于从深海宏基因组来源分离得到的patatin-like磷脂酶，目前报道较少。Pacawadee等于2008年通过构建泰国温泉样品宏基因组文库，筛选得到具有脂肪降解活性的patatin-like磷脂酶。该酶对p-nitrophenyl butyrate具有较高的特异性,最适温度为70°C，经70°C处理2h还具有较高的热稳定性。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种来源于深海瓜伊马斯海盆宏基因组文库的patatin-like磷脂酶及其编码基因与用途；该酶能有效的水解对硝基苯酚乙酸酯pNPA、对硝基苯酚丁酸酯PNPB、对硝基苯酚辛酸酯pNPO、对硝基苯酚癸酸酯pNPDE、对硝基苯酚月桂酸酯pNPDO，尤其对对硝基苯酚丁酸酯pNPB和对硝基苯酚癸酸酯pNPDE催化效率最高，而且该patatin-like磷脂酶为嗜热酶，适合用于需要较高反应温度的工业生产中。宏基因组文库的构建方法为现有技术。
[0009]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0010]第一方面，本发明涉及一种如下(a)或(b)的蛋白质:
[0011](a)由如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0012](b)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有patatin-like磷脂酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0013]优选的,所述蛋白质为重组patatin-like磷脂酶,所述重组patatin-like磷脂酶能够水解对硝基苯酚乙酸酯pNPA、对硝基苯酚丁酸酯pNPB、对硝基苯酚辛酸酯pNPO、对硝基苯酚癸酸酯pNPDE、对硝基苯酚月桂酸酯pNPDO中的一种或几种。更优选用于水解对硝基苯酹丁酸酯pNPB和对硝基苯酹癸酸酯pNPDE ;本发明的patatin-like磷脂酶对对硝基苯酚丁酸酯PNPB和对硝基苯酚癸酸酯pNPDE水解的催化效率最高。
[0014]第二方面，本发明涉及一种编码上述蛋白质的核酸序列。
[0015]优选的，所述核酸序列具体为:核酸序列如SEQ ID N0.1所示；或能与SEQ ID N0.1所示的核酸进行杂交的序列。
[0016]优选的，所述核酸序列来源深海瓜伊马斯海盆宏基因组文库。
[0017]第三方面，本发明还涉及一种含有上述核酸序列的重组载体。
[0018]第四方面，本发明还涉及一种上述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
[0019] 第五方面，本发明还涉及一种上述的核酸序列在制备重组patatin-like磷脂酶中的用途。
[0020]优选的，所述制备包括如下步骤:构建含所述核酸序列的重组载体，将所述的重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌，诱导培养，得到重组patatin-like磷脂酶。
[0021]第六方面，本发明还涉及一种重组patatin-like磷脂酶，是通过如下方法制备而得的:构建含如权利要求4所述核酸序列的重组载体，将所述的重组载体转化至大肠杆菌中，获得重组基因工程菌，诱导培养，即得所述重组patatin-like磷脂酶。
[0022]第七方面，本发明还涉及一种上述的重组patatin-like磷脂酶在油脂脱胶中的用途。
[0023]第八方面,本发明还涉及一种上述的重组patatin-like磷脂酶在制备溶血磷脂中的用途。
[0024]所述patatin-like磷脂酶完整基因序列的克隆方法如下:设计含NdeI和NotI酶切位点的引物I和引物2，以具有酯类降解活性的亚克隆DNA为模板克隆patatin-like磷月旨酶全长基因序列，引物I的序列如SEQ ID N0.3所不，引物2的序列如SEQ ID N0.4所不；PCR反应在50 μ L体系中进行，反应条件为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，30循环后，最后72°C延伸lOmin。扩增产物以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测并按OMEGA生物小量胶回收试剂盒说明书进行PCR扩增产物的纯化，命名PCR产物为pip。
[0025]所述patatin-like磷脂酶基因的工程菌的构建和表达方法如下:对回收的pip片段及载体pET-28a(+)分别进行双酶切(NdeI和NotI)后割胶回收，割胶回收后的pip片段连接后转化至大肠杆菌DH5 α感受态细胞中。在含卡那霉素抗性的LB平板上培养过夜，挑取单菌落接入含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，培养10~14h后提取质粒，进行酶切验证插入目的片段的质粒进行序列测定，测序正确的质粒命名为pET-28a(+)-plp。将重组质粒pET-28a (+) -pip转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，获得含有重组质粒pET_28a (+) -pip的重组大肠杆菌 BL21 (DE3) /pET-28a(+) -pip。将重组菌体 BL21 (DE3) /pET_28a(+) -pip 接入含卡那霉素抗性的LB液体培养基中37°C培养过夜，转接至含卡那霉素抗性的新鲜LB液体培养基37°C培养至0D600约为0.6，添加终浓度0.1mM的IPTG (异丙基硫代-β -D-半乳糖苷)，在20°C条件下进行诱导12h。
[0026]所述PLP的纯化及酶学性质如下:将上述活得的重组菌株的发酵液离心后收集菌体，用 5 倍体积 binding buffer (含 20mmol/L 咪唑,0.3mol/L NaCl, 50mmoI /T, KH2PO4,pH7.6)重悬菌体，冰上超声破碎菌体，裂解的菌体首先经4000rpm，4°C离心lOmin，收集上清；上清再置于4°C, 13000rpm,离心20min,收集沉淀,得到包涵体。
[0027]将得到的包涵体首先溶于IOOmM Tris-HCl (pH7.5), IOOmM EDTA, 10 % TritonX-100,处理约lh，12000rpm离心lOmin，收集沉淀，并重复操作一次。然后将沉淀溶于5mMGly-NaOH(pH)，8M尿素，室温处理过夜，然后置于4°C，12000rpm离心15min收集上清。对收集的上清进行透析复性，复性缓冲液为5mM EDTA, 20mM Gly ρΗ9.0，20πιΜβ巯基乙醇。复性条件为4°C, 1:10比例,透析48小时，中途更换2次buffer。对透析后的样品置于4°C,12000rpm离心20min收集上清，然后对复性后样品更换缓冲液为lxPBS，得到纯化的PLP。通过SDS-PAGE分析纯化后的PLP的纯度和分子量大小，并测定纯化PLP的酶活及最适反应温度、最适反应pH以及有机试剂和金属离子对酶活的影响。
[0028]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:本发明提供的来源于深海热液口瓜伊马斯海盆宏基因组文库中的patatin-like磷脂酶作为嗜热酶，能水解对硝基苯酚乙酸酯pNPA、对硝基苯酚丁酸酯pNPB、对硝基苯酚辛酸酯pNPO、对硝基苯酚癸酸酯pNPDE、对硝基苯酚月桂酸酯PNPD0，催化效率高。以对硝基苯酚丁酸酯pNPB为底物，该酶的最适反应pH为9.0，最适反应温度为70°C，其最适反应温度较现有技术中的大多数patatin-like磷脂酶要高，非常适合用于需要较高反应温度的工业生产中(比如油脂的脱胶)。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0030]图1为pET-28a (+) -pip重组质粒物理图谱；
[0031]图2为patati n-like磷脂酶基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图谱，其中I为用引物I和引物2扩增得到的pip基因片段；2为Ikb DNA Marker ；
[0032]图3为重组patatin-like磷脂酶基因表达图谱，泳道I为标准蛋白分子量Marker ;泳道2为阴性对照，不加IPTG培养的BL21 (DE3)/pET_28a(+)-pip菌株；泳道3为复性后patatin-like磷脂酶(PLP)；
[0033]图4为重组PLP最适反应温度结果图(以对硝基苯酚丁酸酯pNPB为底物反应);
[0034]图5为重组PLP温度稳定性结果图(以对硝基苯酚丁酸酯pNPB为底物反应)；
[0035]图6为重组PLP的最适合反应pH结果图(以对硝基苯酚丁酸酯pNPB为底物反应)；
[0036]图7为重组PLP pH稳定性结果图(以对硝基苯酚丁酸酯pNPB为底物反应)；
[0037]图8为重组PLP底物特异性示意图；
[0038]图9为有机试剂对重组PLP酶活的影响结果图(以对硝基苯酚丁酸酯pNPB为底物反应)。
【具体实施方式】
[0039]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。[0040]实施例1、聚合酶链式反应(PCR)扩增pip基因及扩增产物的纯化
[0041]设计含NdeI和NotI酶切位点的引物I和引物2，以具有酯类降解活性的亚克隆DNA为模板克隆patatin-like磷脂酶全长基因序列，引物I的序列如SEQ ID N0.3所示，引物2的序列如SEQ ID N0.4所示；PCR反应在50 μ L体系中进行，反应条件为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，30循环后，最后72°C延伸IOmin0扩增产物以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，发现明显阳性扩增带，即大小与理论大小相近的DNA片段，切下含目的基因的凝胶块，放入一洁净1.5mL EP管中，按OMEGA生物小量胶回收试剂盒说明书进行PCR扩增产物的纯化，纯化后的产物以0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果。回收后PCR产物命名为pip。由图2可知，PCR扩增的pip基因片段，经电泳显示主要为一条带，为后续步骤打下基础。
[0042]实施例2、表达载体的构建[0043]对回收的pip片段及载体pET_28a(+)分别进行双酶切(NdeI和NotI)后割胶回收，割胶回收后的PlP片段连接后转化至大肠杆菌DH5ci感受态细胞中。在含卡那霉素抗性的LB平板上培养过夜，挑取单菌落接入含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，培养10~14h后提取质粒，进行酶切验证插入目的片段的质粒进行序列测定，测序正确的质粒命名为pET-28a (+) -pip。将重组质粒pET_28a (+) -pip转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，获得含有重组质粒 pET-28a(+) -pip 的重组大肠杆菌 BL21 (DE3) /pET_28a(+) -pip。
[0044]实施例3、重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
[0045]挑取含重组质粒的单个DH5a大肠杆菌分别接种于3mL LB液体培养基中(含Kan30 μ g/L)，置37°C摇床振荡培养过夜，次日提取质粒，并将重组质粒转化入表达宿主菌BL21 (DE3)感受态细胞中，分别取100 μ L菌液用玻棒均匀地涂布到含Kan (终浓度为30 μ g/L)的LB平板的表面，37°C倒置培养过夜。然后待菌长出，随机挑取含重组质粒的单菌落，接种于3mL含Kan的LB培养液中37°C过夜培养，次日按I %的接种量分别转接到3mL含Kan的LB培养液中，37°C培养至OD6tltl为1.2，一根含重组质粒培养管中不加诱导剂做阴性对照，另外I根培养管中加入终浓度为0.5mM IPTG，于30°C继续培养3h。各取0.5mL培养物，1000Orpm室温离心lmin，收集菌体，加60 μ L的无菌水悬菌，然后再加入20 μ L4X SDS上样缓冲液，震荡处理，蛋白纯化时的样液直接取30μ L加10 μ L4 X SDS上样缓冲液，混匀后于100°C水浴5min，1000Orpm室温离心5min，取上清液进行SDS-PAGE电泳，由图3可知，与对照相比，用0.5mM的IPTG诱导3h后，在大约35KDa处的一条条带的量明显增多，这个大小与预期结果一致。
[0046]实施例4、重组PLP的纯化
[0047]所述PLP的纯化及酶学性质如下:将上述活得的重组菌株的发酵液离心后收集菌体，用 5 倍体积 binding buffer (含 20mmol/L 咪唑,0.3mol/L NaCl, 50mmoI /T, KH2PO4,pH7.6)重悬菌体，冰上超声破碎菌体，裂解的菌体首先经4000rpm，4°C离心lOmin，收集上清；上清再置于4°C, 13000rpm,离心20min,收集沉淀,得到包涵体。
[0048]将得到的包涵体首先溶于IOOmM Tris-HCl (pH7.5), IOOmM EDTA, 10 % TritonX-100,处理约lh，12000rpm离心lOmin，收集沉淀，并重复操作一次。然后将沉淀溶于5mMGly-NaOH(pH)，8M尿素，室温处理过夜，然后置于4°C，12000rpm离心15min收集上清。对收集的上清进行透析复性，复性缓冲液为5mM EDTA, 20mM Gly ρΗ9.0，20πιΜβ巯基乙醇。复性条件为4°C, I:10比例,透析48小时，中途更换2次buffer。对透析后的样品置于4°C,12000rpm离心20min收集上清，然后对复性后样品更换缓冲液为lxPBS，得到纯化的PLP。通过SDS-PAGE分析纯化后的PLP的纯度和分子量大小，结果如图3所示，经复性后的PLP蛋白较纯，可用于后续的研究。
[0049]实施例5、酶活测定[0050]脂肪酶活性测定是根据水解酯类化合物生成的对硝基苯酚的含量来测定酶活。具体步骤:在灭菌的Eppendorf管中加入终浓度为IXPBS缓冲液(900uL)、50uLlmM底物，50uL纯化的蛋白(体系为lmL)。立即在相应温度下水浴，开始计时。反应10min后，立即加入250uLlM三氯乙酸以终止反应，然后再加入250yL10%碳酸钠进行显色，然后在410nm处测定其光吸收值。每个反应做3个平行对照。酶活力根据以下方法进行计算:1个酶活力单位是指在特定条件下，在I分钟内能转化I微摩尔底物的酶量。
[0051 ] 实施例6、反应温度对PLP活性的影响
[0052]以ImM pNPB为底物，按照标准酶活测定方法将反应物分别置于4°C，30°C，40°C，50 V ,60 °C, 70 V，85 V和95 V条件下反应3min后，终止反应，检测反应液在410nm处光吸收值。结果如图4所示，在所选择的各温度下具有酶活性，随着温度升高，酶活性逐渐增大，在70°C时达到最高，随着温度进一步升高，酶活有所降低。说明PLP最适反应温度为70°C。在较宽范围内^O-S(TC)都具有较高的酶活性，说明它在高温催化方面具有良好的应用前景，有成为工业用酶的潜质。
[0053]实施例7、温度对PLP酶稳定性的影响
[0054]将酶液在不同温度下(50°C，60°C，7(TC )分别进行处理，每隔30min后取出样品，按照标准酶活测定方法测定酶活性。结果如图5所示，在经50°C条件下处理120min后依然能残留73%的活性，而经60°C处理60min后，残留活性能保持在85%以上，经120min处理后，该蛋白依然能保留约70%的活性；而经70°C处理120min后，该酶活力有所降低，但依然具有约60%以上的活性。
[0055]实施例8、pH值对PLP酶活性的影响
[0056]以ImM pNPB为底物，在上述测得的最适温度条件下按照标准酶活测定方法将反应物在不同pH(pH3.0-10.0)的缓冲液中进行反应，缓冲系统如下:pH3.0为50mMglycine-HCl, ρΗ4.0 到 6.0 为 50mM HAc-NaAc 缓冲液，pH6.0 到 8.0 为 50mM 磷酸钠缓冲液，ρΗ8.0 到 9.0 为 Tris-HCl (50mM), pH9.0 到 10.0 为 glycine-Na0H(50mM)。结果如图 6所示，在所能检测的pH条件下，PLP在甘氨酸-盐酸缓冲液pH3.0中活性较高，但pH为4.0时，活性反而降低，随着PH值逐渐升高，PLP活性逐渐增大，在Tris-HCl缓冲液pH9.0时活性最高，随着PH进一步升高，酶活有所降低，在pH为10.0时该酶依然保持80%的活性，说明该酶是一个偏碱性酶。
[0057]实施例9、pH对PLP酶稳定性的影响
[0058]将酶液在不同pH(pH7.0，pH8.0，pH9.0)下分别处理，每隔30min后取出样品，按照标准酶活测定方法测定酶活性。结果如图7所示，在经PH70-9.0条件处理120min后，活力虽然有损失，但依然能保持较高的活力，尤其以在PH9.0的Tris-HCl中最稳定，处理120min后能残留约87%的活力。说明该酶具有良好的pH稳定性。
[0059]实施例10、PLP底物特异性检测[0060]选择6种底物(对硝基苯酚乙酸酯pNPA(pNPC2)、对硝基苯酚丁酸酯pNPB (pNPC4)、对硝基苯酚辛酸酯pNPO (pNPC8)、对硝基苯酚癸酸酯pNPDE (pNPCIO)、对硝基苯酚月桂酸酯pNPDO (pNPC12)、对硝基苯酚棕榈酸酯pNPP (pNPC16))，按照标准酶活测定方法将反应物置于最适条件下反应10min后，终止反应，检测反应液在410nm处光吸收值，结果如图8所示，将水解pNPC4的活力确定为100%，PLP水解pNPC2、pNPC8、pNPC10、pNPC12、PNPC16 的相对活力分别为 72.10%,69%,95%,28%,5%0[0061 ] 实施例11、有机试剂对PLP酶活的影响
[0062]在最适反应pH条件下，按照标准酶活测定方法，反应体系中分别加入5% (v/v)的甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、1%SDS、0.1mM EDTA,0.1mM PMSF，于4°C处理I小时后再加入ImMpNPB,于最适反应温度条件下反应10min后再检测酶活，结果如图9所示，1% SDS能使PLP完全失去活性，而PLP对其它有机试剂均具有较好的耐受性，经处理I小时，其残留活力均在80%以上。
[0063]实施例12、金属离子对PLP酶活的影响
[0064]在最适反应pH条件下，按照标准酶活测定方法，反应体系中分别加入终浓度5mM的不同金属离子(Ca2+，Cu2+，A13+，Co2+，Fe3+，Ni2+，Zn2+，Mg2+)于 4°C处理 I 小时后再加入ImM pNPB，于最适反应温度条件下反应3min后再检测酶活。以对硝基苯酚丁酸酯pNPB为底物反应时，5mM金属离子对重组PLP酶活的影响结果如表1所示。
[0065]表1
【权利要求】
1.一种如下(a)或(b)的蛋白质: (a)由如SEQID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)SEQID N0.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有patatin-like磷脂酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为重组patatin-like磷脂酶，所述重组patatin-like磷脂酶能够水解对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚辛酸酯、对硝基苯酚癸酸酯、对硝基苯酚月桂酸酯中的一种或几种。
3.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。
4.如权利要求3所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为:核酸序列如SEQIDN0.1所示；或能与SEQ ID N0.1所示的核酸进行杂交的序列。
5.如权利要求3所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列来源于深海热液口瓜伊马斯海盆宏基因 组文库。
6.一种含有权利要求3所述核酸序列的重组载体。
7.一种利用权利要求6所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
8.—种如权利要求3所述的核酸序列在制备重组patatin-like磷脂酶中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述制备包括如下步骤:构建含所述核酸序列的重组载体，将所述的重组载体转化至大肠杆菌中，获得重组基因工程菌，诱导培养，得到重组patatin-like磷脂酶。
10.一种重组patatin-like磷脂酶,其特征在于,所述重组patatin-like磷脂酶是通过如下方法制备而得的:构建含如权利要求3所述核酸序列的重组载体，将所述的重组载体转化至大肠杆菌中，获得重组基因工程菌，诱导培养，即得所述重组patatin-like磷脂酶。
11.一种如权利要求10所述的重组patatin-like磷脂酶在油脂脱胶中的用途。
12.—种如权利要求10所述的重组patatin-like磷脂酶在制备溶血磷脂中的用途。
【文档编号】C12N15/63GK103540576SQ201310462237
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】徐俊, 付玲, 肖湘, 王风平 申请人:上海交通大学