82]分析软件：AnalystI. 4. 2(AppliedBiosystems/MDSSciex)
[0283] <HPLC条件 >
[0284]实施例 2 :5' 一GmUGmAAmGUmCAmACmAUmGCmCUmGCdT- 3'（与带有d的碱 基键合的糖为脱氧核糖，与从5' 一端开始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18个的带有m的碱 基键合的糖为2' 一 0 -甲基取代核糖）（序列号15)
[0285] 5' 一mGCmAGmGCmAUmGUmUGmACmUUmCAmCdT- 3'（与带有d的碱基键合的 糖为脱氧核糖，从5' 一端开始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的带有m的碱基键合的糖 为2' 一 0 -甲基取代核糖）（序列号16)
[0286]实施例 3 :5' 一GmUGmAAmGUmCAmACmAUmGCmCUmGCdT- 3'（与带有d的碱 基键合的糖为脱氧核糖，与从5' 一端开始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18个的带有m的碱 基键合的糖为2' 一 0 -甲基取代的核糖）（序列号17)
[0287] 5' 一GCAGGCAUGUUGACUUCACdT- 3'（与带有d的碱基键合的糖为脱氧核 糖）（序列号18)
[0288] 比较例2 :5' 一GUGAAGUCAACAUGCCUGCdT- 3'（与带有d的碱基键合的糖 为脱氧核糖）（序列号19)
[0289] 5' 一GCAGGCAUGUUGACUUCACdT- 3'（与带有d的碱基键合的糖为脱氧核 糖）（序列号20)
[0290]柱：XbridgeC18 (3. 5ym、2.ImmI.D.X50mm、Waters)
[0291]预滤器：Xbridgeguardcartridge(3. 5ym、2.ImmI.D.X10mm、Waters)
[0292]柱温：65°C
[0293] 流动相：三乙胺/六氟异丙醇/水（0.4/30/1000):甲醇=93:7~75:25
[0294]注入量：25yL
[0295] 检测：质谱仪（离子化法：电喷雾离子，负离子，离子源温度：500°C)
[0296] 图3~5显示，给与了实施例2及3中所得制剂的小鼠与给与了比较例2中所得 制剂的小鼠相比，RNA的血液中浓度推移较高。SP，表明与序列X及互补序列X'的碱基键 合的糖的总计1~90%为2'位上被修饰基团取代的核糖的本发明的组合物的血中滞留性 被进一步改善，能够降低副作用或者增大药物在含有靶基因表达部位的组织或脏器中的蓄 积。
[0297][实施例4]
[0298] 实施例4中使用的RNA是含有BCL2基因的mRNA的连续23个碱基的序列（以下 记为序列X4)及与该序列互补的碱基的序列（以下记为互补序列X4'）的双链RNA[有义链： 5' 一GmAAmGUmGAmCAmUCmUUmCAmGCmAAmAUmAAdAdC- 3'（与带有d的喊基键合的 糖为脱氧核糖，与从5' 一端开始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22个的带有m的碱基 键合的糖为2' 一 0 -甲基取代的核糖）（序列号21)、反义链：5' 一GUmUUmAUmUUmGCmUG mAAmGAmUGmUCmACmUUmCmUmU- 3'（与从 5' 一端开始的第 3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25~27个的带有m的碱基键合的糖为2' 一O-甲基取代核糖）（序列号22)](以 下称为2' 一OMeBCL2siRNAExp. 4)，与序列X4及互补序列X/的碱基键合的核糖的总计 50%为2' 一 0-甲基取代核糖。有义链及反义链均从北海道SystemScience获得，通过 退火制备双链RNA。
[0299]将DOTAP(AvantiPolarLipids公司制）/PEG-DSPE(日本油脂公司制）/蒸馈 水（大塚制药公司制）按40mg/16mg/lmL混合，用祸流混合器振动搅拌。将该悬池液于 70°C下通过0. 4ym的聚碳酸酯微孔滤膜（Costar公司制）10次、0. 2ym的聚碳酸酯微孔 滤膜（Whatman公司制）5次、0.Iym的聚碳酸酯微孔滤膜（Corning公司制）10次、再通过 0. 05ym的聚碳酸酯微孔滤膜（Whatman公司制）20次。采用动态光散射法（DLS)测定所得 的前导粒子的平均粒径，结果为72. 93nm。
[0300] 另一方面，将EPC(日本油脂公司制）/PEG-DSPE(日本油脂公司制）/乙醇（和 光纯药公司制）/水按15mg/3. 125mg/0. 625mL/0. 375mL混合，制备脂双层膜的构成成分的 溶液。
[0301] 在所得的前导粒子的分散液0.0125mL中混合0.00417mL以24mg/lmL混合2' 一 OMeBCL2siRNAExp. 4/水所得的水溶液，制备复合粒子。将所得的复合粒子的分散液添 加到0. 06667mL脂双层膜的构成成分的溶液中，接着添加0. 02083mL蒸馏水。然后添加在 40vol% 乙醇中按 62. 5mg/62. 5mg/mL溶解有EPC/PEG-DSPE所得的溶液 0. 00667mL，然 后缓缓加入〇. 7758mL蒸馏水，将乙醇的浓度调节至5vol%以下。用食盐水使所得的脂质 体悬浊液等渗。然后用生理盐水（大塚制药公司制）使最终液体容量为lmL，将2' 一OMe BCL2siRNAExp. 4浓度调节为0?lmg/mL，得到制剂。
[0302] 采用DLS测定脂质体的平均粒径，结果为87. 50nm。
[0303] 比较例3
[0304] 比较例3中使用的RNA为含有序列X4及互补序列X4'的双链RNA[有义链：5' 一 GAAGUGACAUCUUCAGCAAAUAAdAdC- 3'（与带有d的碱基键合的糖为脱氧核糖）（序 列号 23)、反义链：5' 一GUUUAUUUGCUGAAGAUGUCACUUCUU- 3'（序列号 24)](以 下称为BCL2siRNACom. 3)。有义链及反义链均从北海道SystemScience获得，通过退火制 备双链RNA。
[0305]除了用BCL2siRNACom. 3 代替 2' 一OMeBCL2siRNAExp. 4 之外，与实施例 4 同样 地得到制剂。
[0306] 采用DLS测定脂质体的平均粒径，结果为94. 32nm。
[0307] 试验例3
[0308] 将100yL含有实施例4及比较例3中所得制剂的药液（siRNA浓度50yg/mL) 通过尾静脉以7天间隔给与雄性Balb/c小鼠出周龄、日本CLEA) 2次（给药量为5yg/ mouse)。给与第2次后，通过尾动脉在投与3小时后的时间点取血10yL，添加90yL变性 溶液（4mol/L硫氰酸胍、25mmol/L梓檬酸钠、lmmol/L二硫苏糖醇、0. 5w/v%N-月桂酰肌 氨酸钠；以下称为D溶液）进行混合，得到10v/v%血液。
[0309] 在各给药组的10v/v%血液的IOOyL中添加焦碳酸二乙酯水溶液（以相对于 超纯水为0.lv/v%的容量添加焦碳酸二乙酯并进行混合）IOyUI.S.溶液（将浓度为 0. 3ymol/L的上述焦碳酸二乙酯水溶液作为I.S.) 10yL、2mmol/L乙酸钠（pH4. 0) 10yL 及酸性饱和苯酚/氯仿溶液（使用将酸性饱和苯酚和氯仿以1/1的容量比混合后的下 层）150yL进行混合，于4°C下、以132000Xg离心10分钟。在30yL上清液中添加 10yLGenTLE溶液（被上述焦碳酸二乙酯水溶液稀释15倍的GenTLEprecipitation carrier(TakaraBio))并进行混合，之后，添加100yL乙醇进行混合，于室温下静置10分 钟以上。于4°C下、以132000Xg离心10分钟后，丢弃上清液，在沉淀中添加75v/v%乙醇 100yL。于4°C下、以132000Xg离心15分钟后，丢弃上清液，风干沉淀后，溶解于50yL 再溶解液（以〇. 1/0. 4/30/1000的容量比混合焦碳酸二乙酯/三乙胺/六氟异丙醇/水） 中。于4°C下、以132000Xg离心10分钟，以上清液作为分析样品，采用HPLC法定量。结果 分别示于图6及图7。
[0310] < 装置 >
[0311]HPLC装置：ACQUITYUPLCsystem(Waters)
[0312]质谱仪：API4000QTRAP(AppliedBiosystems/MDSSciex)
[0313] 分析软件：AnalystI. 4. 2(AppliedBiosystems/MDSSciex)
[0314] <HPLC条件 >
[0315] 内标物质（I.S.)
[0316]实施例 4 :5' 一GmUGmAAmGUmCAmACmAUmGCmCUmGCdT- 3'（与带有d的碱 基键合的糖为脱氧核糖，与从5' 一端开始的第2、4、6、8、10、12、14、16、18个的带有m的碱 基键合的糖为2' 一 0 -甲基取代核糖）（序列号25)
[0317] 5' 一mGCmAGmGCmAUmGUmUGmACmUUmCAmCdT- 3'（与带有d的碱基键合的 糖为脱氧核糖，与从5' 一端开始的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19个的带有111的碱基键合 的糖为2' 一 0 -甲基取代核糖）（序列号26)
[0318] 比较例3 :5' 一GUGAAGUCAACAUGCCUGCdT- 3'（与带有d的碱基键合的糖 为脱氧核糖（序列号27)
[0319] 5' 一GCAGGCAUGUUGACUUCACdT- 3'（与带有d的碱基键合的糖为脱氧核 糖）（序列号28)
[0320]柱：XbridgeC18 (3. 5ym、2.ImmI.D.X50mm、Waters)
[0321]预滤器：Xbridgeguardcartridge(3. 5ym、2.ImmI.D.X10mm、Waters)
[0322] 柱温：65°C
[0323] 流动相：三乙胺/六氟异丙醇/水（0.4/30/1000):甲醇=93:7~75:25
[0324] 注入量：25yL
[0325] 检测：质谱仪（离子化法：电喷雾离子，负离子，离子源温度：500°C)
[0326] 图6及图7显示，给与了实施例4中所得制剂的小鼠与给与了比较例3中所得制 剂的小鼠相比，RNA的血液中浓度推移较高。即，表明了与序列X及互补序列X'的碱基键 合的糖的总计1~90%为2'位上被修饰基团取代的核糖的本发明的组合物的血中滞留性 被进一步改善，能够降低副作用或者增大药物在含有靶基因表达部位的组织或脏器中的蓄 积。
[0327] 产业上的可利用性
[0328] 通过将本发明的含有脂质体的组合物给与哺乳动物等，所述脂质体包封有RNA，所 述RNA含有靶基因mRNA的连续15~30个碱基的序列及与该序列互补的碱基的序列，能够 抑制该靶基因的表达。
[0329] 序列表自由文本
[0330] 序列号1 一实施例1的SiRNA有义链
[0331] 序列号2 -实施例1的SiRNA反义链
[0332] 序列号3 -比较例1的SiRNA有义链
[0333] 序列号4 一比较例1的siRNA反义链
[0334] 序列号5 -实施例1的siRNA有义链用IS
[0335] 序列号6 -实施例1的siRNA反义链用IS
[0336] 序列号7 -比较例1的siRNA有义链的IS
[0337] 序列号8 -比较例1的siRNA反义链的IS
[0338] 序列号9 一实施例2的siRNA有义链
[0339] 序列号10 -实施例2的siRNA反义链
[0340] 序列号11 一实施例3的siRNA有义链
[0341] 序列号12 -实施例3的siRNA反义链
[0342] 序列号13 -比较例2的siRNA有义链
[0343] 序列号14 一比较例2的siRNA反义链
[0344] 序列号15 -实施例2的siRNA有义链用IS
[0345] 序列号16 -实施例2的siRNA反义链用IS
[0346] 序列号17 -实施例3的siRNA有义链用IS
[0347] 序列号18-实施例3的siRNA反义链用IS
[0348] 序列号19 一比较例2的siRNA有义链的IS
[0349] 序列号20 -比较例2的siRNA反义链的IS
[0350] 序列号21 -实施例4的siRNA有义链
[0351] 序列号22 -实施例4的siRNA反义链
[0352] 序列号23 -比较例3的siRNA有义链
[0353] 序列号24 -比较例3的siRNA反义链
[0354] 序列号25 -实施例4的siRNA有义链用IS
[0355] 序列号26 -实施例4的siRNA反义链用IS
[0356] 序列号27 -比较例3的siRNA有义链的IS
[0357] 序列号28 -比较例3的siRNA反义链的IS
[0358] 序列号 29 -bcl2mRNA
【主权项】
1. 一种组合物，含有包封了 RNA的脂质体，所述RNA含有靶基因mRNA的连续15~30 个碱基的序列（以下记为序列X)及与所述序列X互补的碱基的序列（以下记为互补序列 X'），与序列X及互补序列X'的碱基键合的糖的总计30~55%为在2'位上被2' 一 O - 甲基、2' 一 O -乙基及2' 一氟中的任一个取代的核糖，所述脂质体是可到达包含靶基因表 达部位的组织或脏器的脂质体， 其中，所述RNA是具有利用RNA干涉（RNAi)抑制所述靶基因表达的作用的RNA，所述靶 基因是血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、纤维芽细胞生长因子、纤维芽细胞生长 因子受体、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长 因子受体、Kruppel样因子、Ets转录因子、核因子及低氧诱导因子中的任一种的基因。2. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述脂质体是具有可静脉内给药的大小的脂质 体。3. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述mRNA是人或小鼠的mRNA。4. 如权利要求1~3中任一项所述的组合物，其中，所述包封了 RNA的脂质体含有复合 粒子及被覆所述复合粒子的脂双层膜，所述复合粒子包含前导粒子和所述RNA， 其中，所述脂双层膜的构成成分可溶于极性有机溶剂，所述脂双层膜的构成成分及所 述复合粒子可以分散在以特定浓度含有所述极性有机溶剂的液体中。5. 如权利要求4所述的组合物，其中，所述极性有机溶剂为醇。6. 如权利要求4所述的组合物，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。7. 如权利要求6所述的组合物，其中，所述前导粒子是含有阳离子性物质的前导粒子， 所述脂双层膜是包含中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物 的脂双层膜。8. 如权利要求1~3中任一项所述的组合物，其中，所述包封了 RNA的脂质体是含有复 合粒子及被覆所述复合粒子的脂双层膜的脂质体，所述复合粒子包含含有阳离子性物质的 前导粒子和所述RNA， 其中，所述脂双层膜是包含中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烃衍生物的脂双层膜。9. 如权利要求7所述的组合物，其中，所述阳离子性物质为选自N - [1 一（2,3-二 油酰丙基）]一 N，N，N-三甲基氯化铵、N - [1 一（2,3 -二油酰丙基）]一 N，N -二甲基 胺、N - [1 一（2, 3 -二油基氧基丙基）]一 N，N，N -二甲基氣化钱、N - [1 一（2, 3 -双 十四烷氧基丙基）]一 N，N-二甲基一 N-羟乙基溴化铵及30 - [N -（N'，N' 一二甲基 氨基乙基）氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上。10. 如权利要求7所述的组合物，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物 或脂肪烃衍生物为聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺。11. 如权利要求8所述的组合物，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物 或脂肪烃衍生物为聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺。12. -种癌症或炎症疾病的治疗剂，所述治疗剂含有脂质体，所述脂质体含有复合粒子 及被覆所述复合粒子的脂双层膜， 所述复合粒子包含前导粒子和RNA，所述RNA含有与肿瘤或炎症相关的靶基因mRNA的 连续15~30个碱基的序列（以下记为序列X1)及与所述序列互补的碱基的序列（以下记 为互补序列X/ )，与序列X1及互补序列X /的碱基键合的糖的总计30~55%为在2'位上 被2' 一 O -甲基、2' 一 O -乙基及2' 一氟中的任一个取代的核糖， 其中，所述脂双层膜的构成成分可溶于极性有机溶剂，所述脂双层膜的构成成分及所 述复合粒子能够分散在以特定浓度含有所述极性有机溶剂的液体中， 其中，所述RNA是具有利用RNA干涉（RNAi)抑制所述靶基因表达的作用的RNA，所述靶 基因是血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、纤维芽细胞生长因子、纤维芽细胞生长 因子受体、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长 因子受体、Kruppel样因子、Ets转录因子、核因子及低氧诱导因子中的任一种的基因。13. 如权利要求12所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述极性有机溶剂为醇。14. 如权利要求12所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。15. 如权利要求12~14中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述前导粒 子为含有阳离子性物质的前导粒子，所述脂双层膜是包含中性脂质及水溶性物质的脂质衍 生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物的脂双层膜。16. -种癌症或炎症疾病的治疗剂，所述治疗剂含有复合粒子及被覆所述复合粒子的 脂双层膜， 所述复合粒子包含含有阳离子性物质的前导粒子和RNA，所述RNA含有与肿瘤或炎症 相关的靶基因mRNA的连续15~30个碱基的序列（序列X1)及与所述序列互补的碱基的 序列（互补序列X/ )，与序列X1及互补序列X /的碱基键合的糖的总计30~55%为在2' 位上被2' 一 O -甲基、2' 一 O -乙基及2' 一氟中的任一个取代的核糖， 其中，所述脂双层膜是包含中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烃衍生物的脂双层膜， 其中，所述RNA是具有利用RNA干涉（RNAi)抑制所述靶基因表达的作用的RNA，所述靶 基因是血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、纤维芽细胞生长因子、纤维芽细胞生长 因子受体、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长 因子受体、Kruppel样因子、Ets转录因子、核因子及低氧诱导因子中的任一种的基因。17. 如权利要求15所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述水溶性物质的脂质衍 生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺。18. 如权利要求16所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述水溶性物质的脂质衍 生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺。19. 如权利要求12所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述mRNA是人或小鼠的 mRNA〇20. 如权利要求16所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述mRNA是人或小鼠的 mRNA 〇
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种用于抑制靶基因表达的组合物等。本发明提供下述组合物等，所述组合物含有包封了RNA的脂质体，所述RNA含有靶基因mRNA的连续15～30个碱基的序列(以下记为序列X)及与该序列X互补的碱基的序列(以下记为互补序列X’)，与序列X及互补序列X’的碱基键合的糖的总计1～90％为在2’位上被修饰基团取代的核糖，所述脂质体是可到达包含靶基因表达部位的组织或脏器的脂质体。
【IPC分类】A61P35/00, A61P29/00, A61K47/24, A61K47/34, A61K31/713, A61K47/10, A61K31/712, A61K9/127, A61K48/00, A61K47/28, A61K47/18
【公开号】CN105030809
【申请号】CN201510516173
【发明人】八木信宏, 榎园淳一
【申请人】协和发酵麒麟株式会社
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2009年7月31日
【公告号】CN102112136A, CN103585107A, EP2319519A1, EP2319519A4, US9061042, US20110182980, WO2010013815A1