一种氧化响应去正电荷的阳离子聚合物、制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于高分子和生物技术领域，具体涉及一种氧化响应去正电荷的阳离子聚 合物、制备方法和作为基因输送载体的应用。
【背景技术】
[0002] 基因治疗即将核酸药物输送到靶细胞中从而达到治疗目的，已被证明是一种有效 的具有低副作用的治疗癌症的方法。目前常用的输送载体可以分为病毒载体和非病毒载 体。非病毒载体包括阳尚子的脂质体、聚合物、树枝状大分子、多肽等，与病毒载体相比具有 良好的安全性，低免疫原性，生物相容性和易于大量生产等优点。但是较之病毒载体，较低 的转染效率一直是困扰其应用的瓶颈，需要通过化学修饰来提高非病毒载体的转染效率。
[0003] 在非病毒载体中，阳离子聚合物常用来中和DNA的负电并将其压缩成纳米颗粒从 而保护DNA不被降解，并帮助其进入细胞。然而通过正/负静电相互作用形成的阳离子聚合 物/核酸药物复合物纳米颗粒是热力学稳定的，该纳米复合物进入细胞后很难解离释放出 核酸药物，导致核酸药物难以发挥药效。因此，需要设计能够响应细胞内微环境而能够快速 释放出核酸药物的载体，提高核酸药物的药效。为此，本发明提供一种聚合物的制备方法， 该聚合物能够在细胞外时带正电荷以与DNA紧密络合、而一旦进入细胞后能够发生反应使 正电荷消失或变得带负电荷，从而快速与DNA快速解离，促进DNA的表达。
[0004] 由于肿瘤异常的生理特点，使得其释放出大量的活性氧自由基（R0S)，包括过氧 化氢（H202)、超氧阴离子（0 2_)、氢氧根自由基（0H*)，这些活性氧自由基能够将苯硼酸 或酯氧化为酚基，进而触发酚基苄醇脱落的反应，应用于药物的释放（Broad ers，K.E.; Grandhe, S. ；Frechet, J. M. , A biocompatible oxidation-triggered carrier polymer with potential in therapeutics. J Am Chem Soc 2011, 133(4), 756-8.)。硼酸可以和二 醇形成环形的硼酯，因此可以用来提高与肿瘤细胞或者基因输送中的DNA和RNA的核苷酸 的相互作用（Piest，M. ；Engbersen, J. F. , Role of boronic acid moieties in poly(amido amine)s for gene delivery. J Control Release 2011, 155(2), 331-40.)，而且硼酸和硼 酯对人体没有毒副作用。
[0005] 本发明中的聚合物就是含硼酸或硼酯取代苄基季铵盐，利用细胞内的R0S氧化苯 硼酸或酯、触发其电荷的反转。目前没有这种去阳离子聚合物的报道，同样也没有对其制备 方法和应用的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种氧化响应去正电荷的阳离子聚合物苯硼酸苄基季胺化的聚合 物带有大量正电荷，能与带负电的DNA等核酸药物通过静电自组装形成稳定的纳米复合 物。进入细胞后，硼酸或硼酯被R0S氧化时发生去酚基苄醇反应，季铵盐会变为三级胺，随 后可通过自催化酯键水解生成带负电的聚合物，从而与带负电的核酸药物相互排斥而与快 速解离，释放出核酸药物进行有效转染。
[0007] 本发明同时还公开了上述氧化响应去正电荷的阳离子聚合物在作为基因输送载 体及其在基因输送中的应用。本发明制备的是高效、低毒的非病毒基因输送载体，其与DNA 形成的纳米复合物具有高的转染效率。
[0008] -种氧化响应去正电荷的阳离子聚合物，其特征在于，包括如下片段：
[0009]
[0010] 上式中：
[0011] Ri、R2分别独立的为C1-C6的烷基或芳香基；
[0012] R3、R4分别独立的为H、C1-C6的烷基酰基；
[0013] m为1-4的正整数；
[0014] 阴离子为溴离子或氯离子。
[0015] 作为优选，所述阳离子聚合物由聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或其他含一级、二级 氨基的聚合物与含有硼酸或硼酸酯基苄基-三烷基季胺基化合物反应制备得到。
[0016] 作为进一步优选，所述其他含一级、二级氨基的聚合物包括如聚乙烯亚胺、聚胺基 酰胺树枝状大分子。
[0017] 作为优选，上述r3、r4Sh、乙酰基或甲酰基，对应的为硼酸或硼酸甲酯、硼酸乙酯， Ri、R2为甲基、乙基；m为1-3的正整数，进一步优选为1或2,更进一步优选为2。
[0018] 作为优选，所述阳离子聚合物为下列化合物（1)~（4)中的至少一种：
[0019]
[0020] 上式中n为重复单元的个数5-500 ;进一步优选为50-300 %、私分别独立的为 C1-C6的烷基链或芳香基，进一步优选为乙基；PAMAM为2-5代中的至少一种。
[0021] 作为优选，其中化合物（1)和化合物（2)由下述两种方法中任--种方法制备得 到：
[0022] 方法一：由N，N-二取代氨基乙基丙烯酸酯或N，N-二取代氨基乙基甲基丙烯酸酯 经过聚合反应制备得到N，N-二取代氨基乙基聚丙烯酸酯或N，N-二取代氨基乙基聚甲基丙 烯酸酯，然后再与硼酸基卞溴、硼酸酯基卞溴、硼酸基卞氯或硼酸酯基卞氯反应得到；
[0023] 方法二：由N，N-二取代氨基乙基丙烯酸酯或N，N-二取代氨基乙基甲基丙烯酸酯 先与硼酸基卞溴、硼酸酯基卞溴、硼酸基卞氯或硼酸酯基卞氯反应，生成对应的丙烯酸酯单 体，然后进行聚合反应得到；
[0024] 所述丙烯酸酯单体包括溴代或氯代（2-丙烯酰氧）乙基（p-硼酸苄基）二乙铵、 溴代或氯代（2-丙烯酰氧）乙基（p-硼酸酯苄基）二乙铵中的一种；
[0025] 作为优选，所述的化合物（1)结构如下：
[0026]
[0027] 所述的化合物（2)结构如下：
[0028]
[0029] 以上述化合物（1)为例，其制备方法如下式所示：
[0030]
[0031] 作为优选，其中化合物（3)和化合物（4)由下述方法制备得到：丙烯酸酯单体与 聚乙烯亚胺或PAMAM通过迈克尔加成反应制备得到；所述丙烯酸酯单体包括由溴代或氯代 (2-丙烯酰氧）乙基（p-硼酸苄基）二乙铵、溴代或氯代（2-丙烯酰氧）乙基（p-硼酸酯苄 基）二乙铵中的一种。
[0032] 作为优选，所述化合物（3)的结构如下：
[0033]
[0034] 其制备方法如下式所示：
[0035]
D
[0036] 作为优选，所述化合物（4)的结构如下：
[0037]
[0038] 其制备方法如下式所示：
[0039]
[0040] 本发明的氧化响应去正电荷的阳离子聚合物能够被过氧化氢等氧化而去掉季铵 盐正电荷作用下季铵盐会变为三级胺，随后通过自催化酯键水解生成带负电的羧酸基，以 上述化合物（1)为例，其电荷反转的过程如下式所示：
[0041]
[0042] 本法还提供了一种上述氧化响应去正电荷的阳离子聚合物在输送DNA及核酸短 链中的应用。
[0043] 本法还提供了一种上述氧化响应去正电荷的阳离子聚合物在输送紫杉醇中的应 用。
[0044] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0045] (1)本发明制备的氧化响应去正电荷反转型基因输送载体结构简单、易于合成；
[0046] (2)不同于一般的季胺化载体（如用碘甲烷季胺化的聚N，N-二取代氨基乙基丙 烯酸酯）将核酸药物包裹太紧、形成的纳米复合物过于稳定、在细胞内无法与DNA解离的缺 点，本发明制备的硼酸（酯）苄基季胺化阳离子聚合物在细胞内R0S作用下季铵盐会变为 三级胺，随后通过自催化酯键水解生成带负电的羧酸基，促使与DNA的核酸药物解离而使 其有效转染。
[0047] (3)本发明制备的硼酸（酯）苄基季胺化阳离子聚合物在细胞中均表现出较高的 转染活性（与PEI 25KDa相比），同时具有较低的细胞毒性。
【附图说明】
[0048] 图1为本发明实施例2中聚合物⑴在氧化条件下HMP释放曲线；
[0049] 图2为本发明实施例3中聚合物⑴在氧化条件下Zeta电位的变化；
[0050] 图3为本发明实施例4中聚合物⑴/DNA纳米复合物的凝胶阻滞实验电泳图；
[0051] 图4为本发明实施例4中聚合物⑴/DNA纳米复合物的粒径分布和Zeta电位图；
[0052] 图5为本发明实施例4中聚合物⑴/DNA纳米复合物氮磷比为13条件下的透射 电