生成的醌在水中很 快变为对羟基苯甲醇（HMP)，以10 %甲醇水溶液作为流动相，流速为lmL/min，用高效液相 色谱法（HPLC)分析HMP，出峰时间为3. 5分钟，通过监测不同时间释放出来的HMP的量可以 得到HMP的释放曲线。该实验证明ImM过氧化氢条件下聚合物聚合物（1)在30分钟内快 速被氧化，2小时内几乎被氧化完全，检测结果参见图1。
[0094] 实施例3 :
[0095] 聚合物（1)在氧化条件下发生的电荷反转
[0096] 第一组：称取一定量的聚合物聚合物⑴溶于HEPES缓冲溶液（pH值为7. 4， 10mM)，浓度为3mg/mL，加入过氧化氢溶液终浓度为80mM。始终维持溶液的pH值为7. 4, 37°C 下孵育，测定溶液在不同时间的Zeta电位。
[0097]第二组：称取一定量的聚合物（1)溶于HEPES缓冲溶液（pH值为7. 4,10mM)，浓度 为3mg/mL，加入过氧化氢水溶液终浓度为80mM，将溶液pH值调为5. 0, 37°C下孵育2小时 后，将溶液pH值调为7. 4,始终维持溶液的pH值为7. 4, 37°C下孵育，测定溶液在不同时间 的Zeta电位。
[0098] 检测结果如图2所示，该实验证明聚合物（1)的Zeta电位很快从28mV降到17mV， 表明季铵盐在氧化条件下变为三级胺，而后通过酯键自催化水解产生聚丙烯酸，电势渐渐 由正向负转变，在10小时的时候变为OmV，同时我们还发现在酸性环境可以促进氧化，在pH 值为5. 0的条件下孵育2小时，电荷反转只需要6小时，这意味着如果聚合物进入溶酶体后 再逃逸出来，电荷反转的速度会加快。
[0099] 实施例4 :
[0100] 聚合物（1)/DNA纳米复合物的制备
[0101]称取一定量的聚合物（1)溶于HEPES缓冲溶液（pH值为7. 4,10mM)，浓度为lmg/ mL (记为聚合物（1)溶液），将质粒DNA用HEPES缓冲溶液（pH值为7. 4,10mM)稀释成40 y g/ mL的溶液（记为DNA溶液），按照设定的一系列氮磷比（N/P摩尔比）将聚合物（1)溶液稀 释成相应的浓度，按体积比1:1迅速加入到DNA溶液中，涡旋振荡10秒，室温静置30分钟， 得到一系列不同氮磷比的纳米复合物溶液。
[0102] 对上述得到的纳米复合物溶液的理化性质表征：
[0103] 1、凝胶阻滞实验
[0104] 取制备好的一系列不同氮磷比（分别选取N/P摩尔比为3、5、7、9的样品）的纳米 复合物溶液20 y L，同时取10 y L纯质粒DNA作对照，将五个样品分别上样于0. 8%琼脂糖 (含有0? 5mg/mL溴化乙锭）制备的凝胶孔中，在1 X TAE缓冲液中100mV，电泳30min。电泳 结束后，置于紫外凝胶成像系统拍摄，得到电泳图如图3所示。从图3中可以看出，聚合物 (1)可以很好地压缩DNA，在N/P大于3的时候即可以很好地阻滞DNA的迀移。
[0105] 2、粒径分布和Zeta电位测定
[0106] 取制备好的一系列不同氮磷比（分别选取N/P摩尔比为3、5、7、9、11、13的样品） 的纳米复合物溶液利用动态光散射仪在25°C条件下对其尺寸，Zeta电位以及聚集性能进 行测定。所得结果是经过DTS软件计算得出。每组实验重复3次并取平均值。结果如图4 所示，粒径可以被压缩到40nm，Zeta电位分布在15~20mV之间。
[0107] 3、聚合物（1)/DNA纳米复合物的透射电子显微镜观察
[0108]取制备好的N/P摩尔比为13的纳米复合物，滴一滴到400目铜网上，用滤纸吸除 多余液体，滴一滴磷钨酸进行负染，用滤纸吸除多余液体，室温自然晾干，用透射电子显微 镜来观察样品的形态，记录透射电镜图。结果如图5所示，通过静电自组装形成的纳米复合 物，呈现出类球形的纳米颗粒，形态规则、均匀，粒径在40nm左右，跟动态光散射仪所测的 结果基本一致。
[0109] 4、聚合物（1) /DNA纳米复合物氧化条件下的凝胶阻滞实验
[0110] 取20 yL制备好的N/P摩尔比为13的纳米复合物，在不同浓度过氧化氢浓度下， 37°C孵育1小时，同时以10 y L纯质粒DNA和在5mM H202的DNA作为对照品，在37°C孵育 1小时作对照，然后上样于0. 8%琼脂糖（含有0. 5mg/mL溴化乙锭）制备的凝胶孔中，在 1XTAE缓冲液中100mV，电泳30min。电泳结束后，置于紫外凝胶成像系统拍摄，得到电泳图 如图6所示。从图6中可以看出，纳米复合物在0. 5mM H202浓度或者大于0. 5mM H 202浓度 下下可以释放出DNA。
[0111] 实施例5:
[0112] 聚合物⑴~⑷的细胞毒性实验
[0113] 采用3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐（MTT)法来检测聚合物在 A549细胞的体外细胞毒性。将细胞培养于96孔板中，细胞密度为5000个/孔，每孔中加 入100 y L培养基（10 % (v/v)胎牛血清和1 % (v/v)青-链霉素溶液），PEI (25KDa)作为 对照组，细胞置于5% C02浓度和95%湿度的37°C恒温培养箱中培养24h。24h后，每个孔 中加入100 y L不同浓度聚合物培养基溶液（分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、 80mg/ml)，空白组加入100 y L的培养基溶液，细胞继续培养48h。培养48h时后，1 lOOrpm离 心6min并弃尽每个孔中的培养基，加入100 y L的MTT溶液（使用新鲜培养基配制，MTT的 浓度为〇. 75mg/mL)，细胞继续培养3h。其后2800rpm离心7min并弃尽每孔中的MTT培养 液，加入100 y L的DMS0,震荡使每孔中的结晶全部溶解在DMS0中。最终用酶标仪测试样品 在562nm和620nm处的吸光度。细胞存活率（百分比）是以实验组的吸光度值去除以空白 组的吸光度值来表示。每一组数据均为同组试样三个孔的平均值。结果如图7所示，聚合 物⑴对A549细胞的毒性随着浓度的增大而增大，在相同浓度下细胞存活率比PEI (25KDa) 尚。
[0114] 按照相同的方法也对制备得到的聚合物（2)_(4)做了上述检测，检测结果同样见 图7,由图7可知聚合物（2)-(4)对A549细胞的毒性随着浓度的增大而增大，在相同浓度下 细胞存活率远比PEI(25KDa)高。
[0115] 实施例6:
[0116] 聚合物（1)-(4)/DNA纳米复合物的细胞转染实验
[0117] (1)荧光素酶基因转染
[0118] 将A549细胞培养于48孔板中，细胞密度为25000个/孔，每孔含有0. 4mL培养 基，并将细胞置于5 % C02浓度和95 %湿度的37 °C恒温培养箱中培养24h。之后将每孔中 培养基替换为〇. 4mL培养基（血清FBS含量为0 %或者10 % )，并分别加入制备好的含有聚 合物⑴-⑷的一系列氮磷比的纳米复合物溶液50yL(含luciferase pGL4. 13质粒DNA 1 y g)，培养4h。然后弃尽板中含有纳米复合物的培养基，替换为新鲜的培养基继续培养至 48h。弃去培养基，每孔加入100 y L 1 X细胞裂解液，离心取上清，加入荧光素酶底物，用化 学发光检测仪测定化学发光强度。蛋白浓度用Bradford蛋白检测试剂盒测定。化学发光 强度利用蛋白浓度归一化，单位是每毫克蛋白发光强度（RLU/mg protein)。每一组数据均 为同组试样三个孔的平均值。结果如图8所示，荧光素酶基因的转染体现的是细胞整体水 平的转染，N/P为13的聚合物（1)/DNA纳米复合物的无血清转染值最高，比对照组碘甲烷 季胺化TOEAEA (简称DEM，与DNA结合紧密，进入细胞后难以从溶酶体逃逸，不能将DNA释放 出来进行有效转染）转染值高15400倍，证明氧化响应的电荷反转型基因输送载体确实能 有效地将DNA释放出来促进转染。同时它的转染值还比阳性对照组PEI/DNA高出8倍。更 为重要的是，氮磷比达到60的时候，聚合物（1)/DNA纳米复合物表现出抗血清的特性，其在 10%血清中的转染值可以达到跟无血清一样，比同等条件下的PEI/DNA的转染值高出100 倍。
[0119] ⑵绿色荧光蛋白基因转染
[0120] 将A549细胞培养于24孔板中，细胞密度为80000个/孔，每孔0. 8mL培养基，并 将细胞置于5 % C02浓度和95 %湿度的37 °C恒温培养箱中培养24h。之后将每孔中培养基 替换为〇. 8mL培养基（血清含量为0%或者10% )，并加入制备好的纳米复合物溶液（聚 合物（1)的纳米复合物，氮磷摩尔比分别