一种CpG核酸药物输送系统及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种CpG核酸药物输送系统，其特征在于：包含载体及储存在载体中的CpG核酸药物，1mg载体中储存有50～155μg的CpG核酸药物，载体为用氨基硅烷偶联剂修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，颗粒粒径为50nm～100nm，介孔孔径为2nm～15nm，CpG核酸药物为CpG寡脱氧核苷酸，含有12～72个碱基对。本发明还提供了两种制备该CpG核酸药物输送系统的方法。本发明所提供的CpG核酸药物输送系统，CpG核酸药物的储存量大，且能被细胞高效内吞至内涵体，从而可显著提高白细胞介素IL-6和IgG抗体的分泌量，以提高抑制和治疗花粉过敏症的效果。
【专利说明】一种CpG核酸药物输送系统及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种CpG核酸药物输送系统及其制备方法，属于药物制剂领域。
【背景技术】
[0002]花粉过敏是人们生活中常见的过敏症状，严重的还会诱发气管炎、支气管哮喘及肺心病等，若不及时进行治疗可能危及生命。目前，全世界的花粉过敏患病率已达到约5%?10%，我国的病人也在逐年增多。发病机理是过敏体质的人的鼻粘膜上的肥大细胞中含有免疫球蛋白IgE (Immunoglobulin E),入侵的花粉与IgE抗体结合,使肥大细胞脱粒，释放出过敏介质组胺，而组胺使毛细血管通透性增加，从而引起黏膜水肿、腺体分泌增加及瘙痒等过敏反应。
[0003]传统的花粉过敏防治方法主要是避免过敏源和采用抗组胺药、类固醇激素药等以控制和缓解过敏症状，降低机体对抗原的敏感性，但这无法从根本上治愈花粉过敏。研究发现，机体内免疫球蛋白IgG(Immunoglobulin G)抗体能与IgE抗体竞争肥大细胞表面受体而封闭IgE抗体，从而抑制IgE抗体与花粉的反应，从根本上抑制花粉过敏的发生。
[0004]在抗原提呈细胞和B细胞中，CpG寡脱氧核苷酸(Cytosine-phosphoroth1ate-guanine Oligodeoxynucleotide)能够被细胞内涵体膜上的 toll 样受体 TLR9 (Toll-likereceptor9)识别而诱导免疫反应,包括分泌白细胞介素(Interleukin(IL)-6，IL_12)、I型干扰素(IFN-α/β)等细胞因子，进而促进IgG抗体的分泌。因此，有效输送CpG核酸药物到抗原提呈细胞和B细胞内活化TLR9，促进机体内IgG抗体的高水平分泌，可以从根本上抑制和治疗花粉过敏。但是，跟很多蛋白质和DNA —样，CpG寡脱氧核苷酸本身很容易在细胞外被DNA酶(DNase)、血清等分解而不能进入细胞活化TLR9。
[0005]文献报道的CpG核酸药物输送系统主要包括通过病毒携带CpG核酸药物的输送系统、通过有机质材料携带CpG核酸药物的输送系统和通过无机纳米颗粒携带CpG核酸药物的输送系统等。通过病毒携带CpG核酸药物的输送系统的输送效率最高，但是会引起免疫原反应，且病毒载体自身存在一定的危险性，价格也较为昂贵，限制了该输送系统的使用。有机质材料主要有有机胶束、脂质体、生物降解高分子材料等，但是由于这些材料的热化学稳定性差而导致释放不可控，同时也有免疫反应，使得其应用也受到很多限制。无机纳米颗粒是目前研究较多的一类CpG核酸药物载体，例如磷酸钙、氮化硼、氧化硅、氧化锰等，虽然这些无机纳米颗粒制备可控，毒性较低，可功能化修饰，但其CpG核酸药物携带量小、输送效率低。
[0006]文献曾报道了 SBA-15介孔氧化硅颗粒用于输送CpG核酸药物至293XL_hTLR9细胞，由于SBA-15介孔颗粒为直径500纳米、长径比为2的短棒较大尺寸颗粒，细胞较难摄取介孔颗粒，所以其CpG核酸药物输送系统的输送效率较低。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种CpG核酸药物输送系统及其制备方法的方法，以解决上述问题。
[0008]为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是:
[0009]—种CpG核酸药物输送系统,其特征在于:包含载体及储存在载体中的CpG核酸药物，Img载体中储存有50?155μ g的CpG核酸药物，其中，载体为用氨基硅烷偶联剂修饰的介孔氧化娃纳米颗粒，颗粒粒径为50nm?10nm,介孔孔径为2nm?15nm, CpG核酸药物为CpG寡脱氧核苷酸，含有12?72个碱基对。
[0010]另外，上述CpG核酸药物输送系统还可以具有这样的特征:氨基硅烷偶联剂为Y-氨丙基二甲氧基娃烧、Y _氨丙基二乙氧基娃烧、N-β (氨乙基)-Y _氨丙基二甲氧基硅烷、Ν-β (氨乙基)-Y-氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷中的任意一种或至少两种的混合物。
[0011]并且，本发明还提供了一种制备上述CpG核酸药物输送系统的方法，其特征在于，包括以下三步:
[0012]步骤一:将表面活性剂和助溶剂完全溶解于一定温度的水中，接着缓慢加入硅源并快速搅拌I?4小时，离心分离得到白色胶体颗粒，用乙醇洗涤多次后干燥，干燥后的产物煅烧除去有机模板，得到介孔氧化硅纳米颗粒，各反应物的摩尔比为:1?5表面活性齐[J: 10?50硅源:I?10助溶剂:2000?6000水；
[0013]步骤二:将介孔氧化娃纳米颗粒和氨基娃烧偶联剂以lg/0.5ml?lg/2ml的比例加入到无水乙醇中，在隔绝空气的条件下搅拌24?72h，过滤、洗涤、真空干燥，得到载体；
[0014]步骤三:将步骤二中得到的载体分散于水得到悬浮液，然后将I?5μ g/μ I的CpG核酸药物的溶液按质量比为1/2?1/50的比例，加入到悬浮液中，在振荡器中室温摇晃2?6小时，离心分离，水洗涤，得到CpG核酸药物输送系统。
[0015]另外，上述提供的一种制备CpG核酸药物输送系统的方法还可以具有这样的特征:表面活性剂为十四烷基对甲苯磺酸酯、十六烷基对甲苯磺酸酯、十八烷基对甲苯磺酸酯、十四烷基三甲基卤化铵、十六烷基三甲基卤化铵、十八烷基三乙基卤化铵中的任意一种或几种的混合物；助溶剂为三乙醇胺、丙三醇中的任意一种或二者的混合物；硅源为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯中的任意一种或二者的混合物；一定温度为70?90°C。
[0016]并且，本发明还提供可另一种制备上述CpG核酸药物输送系统的方法，其特征在于，包括以下两步:
[0017]步骤一:将表面活性剂和助溶剂完全溶解于指定温度的水中，缓慢加入硅源和氨基硅烷偶联剂并搅拌I?4小时，得白色胶体颗粒，离心分离并用乙醇洗涤多次后干燥，将干燥后的产物在酸性溶液中回流、离心分离、乙醇洗涤、干燥，得到载体，各反应物的摩尔比为:1?5表面活性剂:10?50硅源:1?10硅烷偶联剂:1?10助溶剂:2000?6000水；
[0018]步骤二:将步骤一制备的载体分散于水中得到悬浮液，然后将I?5μ g/μ I的CpG核酸药物的溶液按质量比为1/2?1/50的比例，加入到悬浮液中，在振荡器中室温摇晃2?6小时，离心分离，水洗涤，得到CpG核酸药物输送系统。
[0019]另外，上述提供的另一种制备CpG核酸药物输送系统的方法还可以具有这样的特征:表面活性剂为十四烷基对甲苯磺酸酯、十六烷基对甲苯磺酸酯、十八烷基对甲苯磺酸酯、十四烷基三甲基卤化铵、十六烷基三甲基卤化铵、十八烷基三乙基卤化铵中的任意一种或至少两种的混合物；助溶剂为三乙醇胺、丙三醇中的任意一种或两者的混合物；硅源为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯中的任意一种或两者的混合物；指定温度为70?90°C。
[0020]另外，上述提供的另一种制备CpG核酸药物输送系统的方法还可以具有这样的特征:酸性溶液为5?1ml浓盐酸/10ml乙醇，回流的次数为2?5次，每次回流时间为12 ?48h。
[0021]发明的作用与效果
[0022]根据本发明涉及的CpG核酸药物输送系统，由于所用的载体为氨基硅烷偶联剂修饰的介孔氧化娃纳米颗粒，氨基上带有正电荷，而CpG核酸药物带有负电荷,从而使得CpG核酸药物容易被本发明所采用的载体所吸附，进而使CpG核酸药物的储存量大大提高。同时，该输送系统能被细胞高效内吞至内涵体，从而可显著提高白细胞介素IL-6和IgG抗体的分泌量，以提高抑制和治疗花粉过敏症的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为实施例一中介孔氧化硅纳米颗粒的扫描电镜(SEM)图；
[0024]图2为实施例一中介孔氧化硅纳米颗粒的透射电镜(TEM)图；
[0025]图3为实施例一中的介孔氧化硅纳米颗粒进行氨基修饰前后的氮气吸附-脱附等温线及孔径分布曲线；
[0026]图4为实施例五中氨基修饰的介孔氧化硅纳米颗粒载体的细胞毒性柱状图；
[0027]图5为实施例五中所涉及的FITC修饰的CpG核酸药物输送系统的细胞摄取情况；以及
[0028]图6为实施例五中所涉及的CpG核酸药物输送系统在细胞摄取后诱导白细胞介素IL-6的结果。
【具体实施方式】
[0029]以下结合附图，对本发明所涉及的CpG核酸药物输送系统及其制备方法做进一步说明。
[0030]<实施例一 >
[0031 ] 本实施例所提供的CpG核酸药物输送系统包含载体及储存在载体中的CpG核酸药物，载体为氨基烷偶联剂修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，CpG核酸药物为含有72个碱基对的CpG寡脱氧核苷酸，即:
[0032]5’ -TCAGAGAGTTAGAGAGTTAGAGAGTCAGAGAGTTAGAGAGTTAGAGAGTCAGAGAGTTAGAGAGTTAGAGAG-3，。
[0033]该CpG核酸药物输送系统的制备方法采用的氨基硅烷偶联剂为Y-氨丙基三乙氧基硅烷，采用的硅源为正硅酸乙酯，采用的表面活性剂为十六烷基对甲苯磺酸酯，采用的助溶剂为三乙醇胺，具体包括以下三步:
[0034]步骤一:将3eq的十六烷基对甲苯磺酸酯(CTAT)和5eq的三乙醇胺(TEA)溶于4000eq的80°C的去离子水中，搅拌I小时后使其完全溶解；接着缓慢地加入18eq的正硅酸乙酯(TEOS)后继续搅拌2小时，离心分离得到白色胶体颗粒，将该白色胶体颗粒用乙醇洗涤多次后在60°C下真空干燥，干燥后置于540°C空气氛下煅烧7小时除去有机模板，得到介孔氧化娃纳米颗粒。
[0035]图1为实施例一中介孔氧化硅纳米颗粒的扫描电镜(SEM)图。
[0036]图2为实施例一中介孔氧化硅纳米颗粒的透射电镜(TEM)图。
[0037]将该介孔氧化硅纳米颗粒在扫描电镜和透射电镜下观察，结果如图1，2所示，所得到的介孔氧化硅纳米颗粒为球形颗粒，颗粒粒径为60nm左右，粒径分布均匀，分散性较好。
[0038]步骤二:取Ig步骤一制备的介孔氧化硅纳米颗粒超声分散于无水乙醇中，快速加A2ml的Y-氨丙基三乙氧基硅烷，氮气保护下室温搅拌24小时后过滤，滤饼用无水乙醇洗涤5次，去除未反应的Y -氨丙基三乙氧基硅烷，滤饼在60°C下真空干燥，得到氨基修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，即为载体。
[0039]图3为实施例一中介孔氧化硅纳米颗粒进行氨基修饰前后的氮气吸附-脱附等温线及孔径分布曲线。
[0040]采用BET法将步骤一制备的介孔氧化硅纳米颗粒及步骤二制备的载体分别进行氮气吸附-脱附试验，结果如图3所示，MSN表示介孔氧化硅纳米颗粒，MSN-NH2表示载体。根据图3，介孔氧化硅纳米颗粒和载体的比表面积分别为805和514m2/g，平均介孔孔径分别为3.8和3.1纳米。
[0041]步骤三:将CpG核酸药物溶于去离子水配制成I μ g/μ I的溶液，保存在_20°C备用，使用时先解冻；将载体分散于去离子水，配制成I μ g/y I的悬浮液。
[0042]将载体的悬浮液和CpG核酸药物溶液以质量比为2:1混合，制得二者的混悬液，然后再振荡器中室温下摇晃4小时，离心分离，去离子水洗涤，得到CpG核酸药物储藏的氨基修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，即为目标CpG核酸药物输送系统。
[0043]采用超微量分光光度计测定所得到的CpG药物输送系统，其中，CpG核酸药物的储藏量为155 μ g/mgo
[0044]<实施例二 >
[0045]本实施例所提供的CpG核酸药物输送系统包含载体及储存在载体中的CpG核酸药物，载体为氨基修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，CpG核酸药物为含有72个碱基对的CpG寡脱氧核苷酸，即:
[0046]5’ -TCAGAGAGTTAGAGAGTTAGAGAGTCAGAGAGTTAGAGAGTTAGAGAGTCAGAGAGTTAGAGAGTTAGAGAG-3，。
[0047]该CpG核酸药物输送系统的制备方法采用的氨基硅烷偶联剂为Y -氨丙基三乙氧基硅烷，采用的硅源为正硅酸乙酯，采用的表面活性剂为十六烷基对甲苯磺酸酯，采用的助溶剂为三乙醇胺，具体包括以下两步:
[0048]步骤一:将3eq的十六烷基对甲苯磺酸酯(CTAT)和5eq的三乙醇胺(TEA)溶于4000eq的80°C的去离子水中，搅拌I小时后使其完全溶解；接着缓慢地加入16eq的正硅酸乙酯(TEOS)和2eq的Y -氨丙基三乙氧基硅烷后继续搅拌2小时，得到白色胶体颗粒，离心分离、乙醇洗涤4次后60°C下真空干燥，最后干燥产物在盐酸乙醇溶液(5ml浓盐酸/10ml乙醇)中回流3次，每次回流24小时，离心分离、乙醇洗涤5次、60°C下真空干燥，得到载体。该载体的颗粒粒径为70纳米左右，平均介孔孔径为3.5纳米。
[0049]步骤二:将CpG核酸药物溶于去离子水配制成I μ g/ μ I的溶液，保存在_20°C备用，使用时先解冻；将载体分散于去离子水，配制成I μ g/y I的悬浮液。
[0050]将介孔颗粒载体悬浮液和CpG核酸药物溶液以质量比为2:1混合，制得二者的混悬液，然后再振荡器中室温下摇晃4小时，离心分离，去离子水洗涤，得到CpG核酸药物储藏的氨基修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，即为目标CpG核酸药物输送系统。
[0051]采用超微量分光光度计测定所得到的CpG药物输送系统，其中，CpG寡脱氧核苷酸药物的储藏量为132μ8/π^。
[0052]<实施例三>
[0053]本实施例所用的CpG核酸药物为实施例一所采用的CpG寡脱氧核苷酸，采用的载体为实施例一中制备的载体。
[0054]将实施例一中的制备的载体分散于去离子水，配制成I μ g/ μ I的悬浮液。将该悬浮液和CpG核酸药物以质量比为5:1混合，制得二者的混悬液，然后再振荡器中室温下摇晃4小时，离心分离，去离子水洗涤，得到CpG核酸药物储藏的氨基修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，即为目标CpG核酸药物输送系统。
[0055]采用超微量分光光度计测定所得到的CpG核酸药物输送系统，其中，CpG核酸药物的储藏量为116 μ g/mgo
[0056]〈实施例四〉
[0057]本实施例所用的CpG核酸药物为实施例一所采用的CpG寡脱氧核苷酸，采用的载体为实施例一中制备的载体。
[0058]将实施例一制备的载体分散于去离子水，配制成I μ g/ μ I的载体悬浮液。将载体悬浮液和CpG核酸药物溶液以质量比为10:1混合，制得二者的混悬液，然后再振荡器中室温下摇晃4小时，离心分离，去离子水洗涤，得到CpG核酸药物储藏的氨基修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，即为目标CpG核酸药物输送系统。
[0059]采用超微量分光光度计测定所得到的CpG核酸药物输送系统，其中，CpG核酸药物的储藏量为83 μ g/mgo
[0060]<实施例五>
[0061]取实施例一至四中制备的CpG核酸药物输送系统进行生物测试:
[0062]I)载体的细胞毒性测定:
[0063]采用标准的Cell Counting Kit_8方法。Raw264.7细胞购买于日本Riken并按供应商提供的方法进行培养。将实施例一中得到的载体分散于DMEM培养液，配制成浓度为lmg/ml的悬浮液，将Raw264.7细胞播种在96孔板中，细胞密度为5000个/孔，接着将载体的悬浮液加到96孔板中，得到浓度分别为25，50，75，100和200 μ g/ml，溶液体积为100 μ I的载体悬浮液。
[0064]将所得的五种不同浓度的载体悬浮液及没有加载体的空白对照液分别与细胞共培养24h后，每孔中加入10 μ I的CCK-8溶液，细胞继续培养3h后用酶标仪MTP-880测定450nm处的吸光度。载体溶液处理过的细胞的活细胞与空白对照液的活细胞相比的百分数表示细胞毒性。
[0065]图4为实施例五中氨基修饰的介孔氧化硅纳米颗粒载体的细胞毒性柱状图。
[0066]如图4所示，与空白对照相比，当该载体浓度达到200 μ g/ml时，仍然没有显示出细胞毒性。
[0067]2)输送系统细胞摄取情况的测定:
[0068]用荧光标记物FITC对实施例一提供的CpG核酸药物进行修饰，得到FITC修饰的CpG核酸药物。
[0069]按实施例一所提供的制备方法制备FITC修饰的CpG核酸药物输送系统。
[0070]将1.5X 15个Raw264.7细胞播种于一个35mm的玻璃底培养皿，培养24小时后将FITC修饰的CpG核酸药物输送系统加到培养皿中，最终浓度为100 μ g/ml。细胞继续培养19h后用PBS洗涤2次并用4%的甲醛溶液固定细胞15min，再用PBS洗涤2次；接着用含0.2%的吐温-20的PBS容费用室温处理1min后，用含1%的BSA的PBS处理Ih ;然后用LAMPl抗体染色处理lh。最后，用莱卡SP5共聚焦荧光显微镜观察细胞摄取介孔氧化硅纳米颗粒输送系统的情况和在细胞内的分布。
[0071]图5为实施例五中所涉及的FITC修饰的CpG核酸药物输送系统的细胞摄取情况。
[0072]如图5所示，结果显示，FITC修饰的CpG核酸药物输送系统10能够较好的被细胞摄取，并且分布在细胞的内质溶酶11体内。
[0073]3)细胞摄取输送系统后诱导分泌白细胞介素IL-6的测定:
[0074]将实施例三中制备的CpG核酸药物输送系统按I μ g/ μ I的比例用细胞培养液稀释，将细胞密度为I X 15个/孔的Raw264.7细胞播种于96孔板，将100 μ I所制得的输送系统的细胞培养液加入细胞培养孔中，继续培养15小时后收集上次清液，白细胞介素IL-6的分泌水平用酶联检测ELISA试剂盒测定。
[0075]图6为实施例五中所涉及的CpG核酸药物输送系统在细胞摄取后诱导分泌白细胞介素IL-6的结果。
[0076]如图6所示，氨基修饰的介孔氧化硅纳米颗粒MSN-NH2本身并不会对IL_6的分泌产生影响，而裸漏的CpG寡脱氧核苷酸free CpG与细胞培养后只有较低的IL-6分泌IL-6/Gapdh = 0.836±0.248，对于实施例三中制备的输送系统CpG/MSN_NH2则显示出非常高的IL-6分泌，达到IL-6/Gapdh = 6.02 ± 0.321，具有明显提高。
[0077]4) CpG核酸药物的释放实验:
[0078]取实施例一中采用的CpG核酸药物置于pH7.4的缓冲液中，37 °C条件下，采用NanoDrop2000C超微量分光光度计的核酸模式，测定浓度与吸光度的标准曲线。
[0079]将实施例一中所制备的CpG核酸药物输送系统在pH值为7.4的缓冲液中，37°C条件下，进行CpG核酸药物的释放实验。释放药物浓度在NanODix)p2000C超微量分光光度计的核酸模式上进行测定。
[0080]结果表明，在pH7.4时，48h内有近50%的CpG核酸药物释放出来，说明实施例一中采用的载体携带CpG核酸药物输送到细胞内后，CpG核酸药物能够较快的从载体的孔道内释放出来,从而与细胞内涵体和内质溶酶体膜上的TLR9作用而诱导免疫反应。
[0081]实施例的作用与效果
[0082]根据上述实施例提供的CpG核酸药物输送系统，由于用带正电荷的氨基硅烷偶联剂修饰的介孔氧化娃纳米颗粒为载体，能较好的负载带有负电荷的CpG核酸药物；
[0083]由于所用介孔氧化硅纳米颗粒具有较大的比表面积和介孔孔径，使CpG核酸药物的储存量也大大提高。
[0084]细胞毒性显示，所使用的氨基硅烷偶联剂修饰的介孔氧化硅纳米颗粒具有很低的细胞毒性。
[0085]细胞摄取输送系统的测定试验显示，实施例所提供的CpG核酸药物输送系统容易被细胞摄取，并较长时间停留在内涵体和内质溶酶体中。
[0086]诱导分泌白细胞介素IL-6的测定试验显示，实施例所提供的CpG核酸药物输送系统能够显著提高白细胞介素IL-6的分泌。
[0087]药物释放实验显示，输送系统携带CpG核酸药物进入细胞后能够释放出来，从而与细胞内涵体和内质溶酶体膜上的TLR9作用而诱导免疫反应。
[0088]另外，本发明所涉及的CpG核酸药物输送系统中，硅烷偶联剂还可以选自Y -氨丙基二甲氧基娃烧、Y -氨丙基二乙氧基娃烧、N-β (氨乙基)-Y -氨丙基二甲氧基娃烧、N- β (氨乙基)-Y -氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基氨乙基氣丙基二乙氧基娃烧中的任意一种或几种的混合物。
[0089]另外，本发明所涉及的CpG核酸药物输送系统中，CpG核酸药物还可以选自其他含有不同碱基对的CpG寡脱氧核苷酸药物，碱基对的数目可以为12?72个之间的任意数值。
[0090]另外，本发明所涉及的CpG核酸药物输送系统中，硅烷偶联剂修饰的介孔氧化硅纳米材料的颗粒粒径可以为50?10nm之间的任意粒径,娃烧偶联剂修饰的介孔氧化娃纳米材料的介孔孔径可以为2?15nm之间任意孔径。
[0091]当然本发明所涉及的CpG核酸药物输送系统并不仅仅限定于上述实施例中的内容。以上内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种CpG核酸药物输送系统,其特征在于: 包含载体及储存在所述载体中的CpG核酸药物，Img所述载体中储存有50?155 μ g的所述CpG核酸药物， 其中，所述载体为用氨基硅烷偶联剂修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，颗粒粒径为50nm?10nm,介孔孔径为2nm?15nm,所述CpG核酸药物为CpG寡脱氧核苷酸,含有12?72个碱基对。
2.根据权利要求1所述的CpG核酸药物输送系统，其特征在于: 其中，所述氨基娃烧偶联剂为Y-氨丙基二甲氧基娃烧、Y-氨丙基二乙氧基娃烧、Ν-β (氨乙基)-Y-氨丙基三甲氧基硅烷、Ν-β (氨乙基)-Y-氨丙基三乙氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨乙基氨乙基氨丙基三乙氧基硅烷中的任意一种或至少两种的混合物。
3.一种制备如权利要求1?2中任意一项所述的CpG核酸药物输送系统的方法,其特征在于，包括以下三步: 步骤一:将表面活性剂和助溶剂完全溶解于一定温度的水中，接着缓慢加入硅源并快速搅拌I?4小时，离心分离得到白色胶体颗粒，用乙醇洗涤多次后干燥，干燥后的产物煅烧除去有机模板，得到介孔氧化硅纳米颗粒， 各反应物的摩尔比为:1?5表面活性剂:10?50硅源:1?10助溶剂:2000?6000水； 步骤二:将所述介孔氧化娃纳米颗粒和所述氨基娃烧偶联剂以lg/0.5ml?lg/2ml的比例加入到无水乙醇中，在隔绝空气的条件下搅拌24?72h，过滤、洗涤、真空干燥，得到所述载体； 步骤三:将步骤二中得到的所述载体分散于水得到悬浮液，然后将I?5μ g/μ I的CpG核酸药物的溶液按质量比为1/2?1/50的比例，加入到所述悬浮液中，在振荡器中室温摇晃2?6小时,离心分离,水洗漆,得到所述CpG核酸药物输送系统。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于: 其中，所述表面活性剂为十四烷基对甲苯磺酸酯、十六烷基对甲苯磺酸酯、十八烷基对甲苯磺酸酯、十四烷基三甲基卤化铵、十六烷基三甲基卤化铵、十八烷基三乙基卤化铵中的任意一种或几种的混合物； 所述助溶剂为三乙醇胺、丙三醇中的任意一种或二者的混合物； 所述硅源为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯中的任意一种或二者的混合物； 所述一定温度为70?90°C。
5.一种制备如权利要求1?2任意一项所述的CpG核酸药物输送系统的方法,其特征在于，包括以下步骤: 步骤一:将表面活性剂和助溶剂完全溶解于指定温度的水中，缓慢加入硅源和氨基硅烷偶联剂并搅拌I?4小时，得白色胶体颗粒，离心分离并用乙醇洗涤多次后干燥，将干燥后的产物在酸性溶液中回流、离心分离、乙醇洗涤、干燥，得到所述载体， 各反应物的摩尔比为:1?5表面活性剂:10?50硅源:I?10硅烷偶联剂:I?10助溶剂:2000?6000水； 步骤二:将步骤一制备的所述载体分散于水中得到悬浮液，然后将I?5μ g/μ I的CpG核酸药物的溶液按质量比为1/2?1/50的比例，加入到所述悬浮液中，在振荡器中室温摇晃2?6小时,离心分离,水洗漆,得到所述CpG核酸药物输送系统。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于: 其中，所述表面活性剂为十四烷基对甲苯磺酸酯、十六烷基对甲苯磺酸酯、十八烷基对甲苯磺酸酯、十四烷基三甲基卤化铵、十六烷基三甲基卤化铵、十八烷基三乙基卤化铵中的任意一种或至少两种的混合物； 所述助溶剂为三乙醇胺、丙三醇中的任意一种或两者的混合物； 所述硅源为正硅酸甲酯、正硅酸乙酯中的任意一种或两者的混合物； 所述指定温度为70?90°C。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于: 其中，所述酸性溶液为5?1ml浓盐酸/10ml乙醇，所述回流的次数为2?5次，每次回流时间为12?48h。
【文档编号】A61P37/08GK104127886SQ201410336649
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】朱钰方, 陶翠莲 申请人:上海理工大学