专利名称：一种新型枯草芽孢杆菌多价载体疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物学、免疫学和水产动物病害防治领域，特别是涉及到一种用于防治鱼类因弧菌、爱德华氏菌、链球菌和嗜水气单胞菌引发病害的新型枯草芽孢杆菌多价载体疫苗及其应用。
背景技术：
水产养殖业已经成为世界上发展最快的动物源性食品生产业之一。据世界粮农组织(FAO) 2010年统计资料显示自2000年以来，渔品的增长主要来自于水产养殖。随着水产养殖业规模化、集约化和工业化的发展，展示在我们面前的将是一个以鱼类养殖为发展
重点的水产养殖业。然而，随着水产养殖业的快速发展，接踵而至的是各种病害的爆发。世界各国的生产实践表明，病害爆发和蔓延已经成为世界范围内水产养殖业获取更大发展的一个重要制约因素，各种重大传染性疫病的风险始终是水产养殖渔业中最为重大的风险之一。我国的水产养殖平均死亡损失率在30%以上，每年的经济损失高达数百亿元。病害问题业已成为水产养殖业健康和可持续发展的关键性制约因素之一。针对各种病害的发生，一个全球性关注的挑战已经凸现随着抗生素抗药病原的大量出现和蔓延而导致大量药物防治效力的逐渐丧失、化学药物等导致的环境污染以及水产品的药物残留等负面影响日趋严重，我们已步入一个后抗生素时代，水产品安全已成为备受关注的全球性问题。 预防性治疗可以防止或大幅减少易感病害的发生发展，利用生物技术开发的各种疫苗使水产养殖业有更多机会面对挑战，为水产养殖业生产的健康发展起到关键性支撑作用。为遏制各种环境因素和养殖密度激增等造成的水产养殖病害日益严重的趋势，推进水产养殖业的健康可持续发展，接种疫苗已成为世界范围内现代水产养殖业发达国家和地区的生产养殖规范。我国水产养殖的重要经济鱼类品种繁多，主要为以罗非鱼、草鱼、鲶鱼为代表的大宗淡水鱼类和以鲆鲽鱼类、鲈鱼、大黄鱼和石斑鱼为代表的海水鱼类。在过去的十多年中，世界范围内主要爆发的是弧菌病(Vibriosis,鳗弧菌Vibrio anguillarum、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、哈氏弧菌Vibrio harveyi等为重要病原)、爱德华氏菌病(Edwardsiel Iosis,其中迟纯爱德华氏菌Edwardsiella tarda和鱼爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri为重要病原)、链球菌病(Streptococcicosis,海豚链球菌Streptococcus iniae和无乳链球菌Streptococcus agalactiae为重要病原)和气单胞菌病(Haemorrhagic septicaemia and ulcer,嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 为重要病原)等重大细菌性病害，严重制约了我国的鱼类养殖生产的健康可持续发展，使我国鱼类养殖生产蒙受巨大损失。针对上述重要鱼类病害，目前主要采取以各种抗生素为代表的化学疗法。我国除草鱼出血病病毒疫苗外，尚未有任何商品化细菌性鱼类疫苗问世。在生产养殖环境中，由于各种病害病原可在养殖水体中同时传播，养殖鱼类面对的将是一个多病原共同侵袭的挑战，因此只针对单一病原病害的单效价疫苗在生产中很难达到较好的实际防治应用效果。开发可同时预防多种重要病原的多价疫苗始终是水产疫苗的重要方向，有着巨大而现实的市场迫切需求。目前国内外针对弧菌(Vibrio spp.)、链球菌(Streptococcus spp.)、爱德华氏菌(Edwardsiella spp.)和气单胞菌(Aeromonasspp.)的单效价疫苗或多联疫苗已有不少文献报道，但可同时针对上述四种重要细菌性病原而设计研发的多价疫苗还未有文献报道。在水产疫苗的开发中，疫苗接种给药方式往往是制约其商业化应用的关键制约因素。鱼类疫苗在生产应用中主要有三种接种给药方式注射、浸泡和口服。注射接种是目前已开发的水产疫苗中所有接种方式中免疫效果最好，保护期也最长，但由于其接种操作需要大量人力和特殊设备设施，耗时较长，因此给药成本最高，水产养殖业往往难以承受其给药成本。同时,注射接种往往给鱼造成较高的应激刺激,所以副作用和操作损失往往也较高。并且，这种接种方式很难应用到鱼苗期和幼鱼期(一般大于20g以上)，在实际生产养殖 中其应用范围受到很大限制。浸泡接种是将鱼放入一定浓度的疫苗稀释液中一段时间进行疫苗接种的方式，浸泡免疫的一个最大优点是可为鱼苗(体重I飞克)接种疫苗。其在生产应用也较易为水产养殖业接受。口服主要是通过将疫苗和饲料结合通过饲喂方式进行疫苗接种，这种接种方式在生产应用中最方便也最温和，不会给鱼类造成应激反应。如果免疫效力得到保证，这是水产疫苗最为理想的疫苗产品应用形式。但从国内外的研制开发和实际应用中发现，该类型的疫苗由于无法避免鱼类动物肠道的消化破坏的影响，往往保护期很短、免疫效力低下，难以获得理想的免疫效果。鉴于关键应用技术尚未有突破，目前国内外市场上尚未有具有良好免疫效果的口服水产疫苗产品问世。综上所述，针对养殖鱼类主要重大病害，开发具有多种病害防治效力的经济、高效、使用便利的多效价口服疫苗是水产养殖业的迫切需求。针对多价口服疫苗的产品特性要求，其需解决的关键技术在于如下两点1)筛选一种或多种针对鱼类主要病害病原的保护性广谱抗原；2)筛选并选取一种能够稳定定植存活于鱼类动物肠道的载体菌株，其可耐受肠道的低PH环境和各种消化蛋白酶的破坏，能够将保护性广谱抗原有效呈递到鱼类动物的相关免疫系统中以激发保护性免疫应答反应。同时，该载体菌株可耐受饲料制备工艺中各种加工环节的考验，可方便地制备成饲料剂型产品，以实现口服接种的产品特性。3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为一个看家基因广泛存在于几乎所有的生物体中。GAPDH是一个传统糖酵解蛋白，然而近年来的研究表明GAPDH在不同的亚细胞部位显示出和糖酵解无关的多种活性功能(3化(^6，14.，1997，了 Cell Biochem,66 (2):133-40;Sirove,M. A. , 1999,Biochim Biophys Acta，1432(2):159_184)。在许多微生物(酵母，细菌和致病性寄生虫)的细胞膜上发现有GAPDH存在，其中GAPDH做为外膜蛋白的潜在免疫保护性受到广泛的关注。GAPDH的免疫原性首次发现于白色念珠菌(Gil-Navarro et al.，1997，J Bacteriol，179 :4992-4999)。目前在布鲁氏菌和迟钝爱德华氏菌中已经证实，GAPDH能够激发宿主的保护性免疫反应(Kawai K. et al,2004, Vaceine, 22 :3411-3418 ；RosinnhaG. M. et al. ,2002, J Med Mierobiol,51 (8) :661_671)。同时许多致病菌的 GAPDH 的相似性非常高，X. Li等已证实GAPDH是重要的广谱性保护抗原，在不同的病原菌间具有显著的交叉免疫力(X. Li et al. , 2012, Letters in Applied Microbiology, 54 (I): 1-9)。因此，GAPDH具有开发成为一种针对多种水产养殖动物重要病原的候选广谱抗原的潜力。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种好氧性的革兰氏阳性细菌,对人畜无害，常被作为动物的益生菌广泛应用于陆地和水生动物的养殖生产中，是国际上公认的具有良好生物安全性的宿主菌株。同时，其具有显著的胞外分泌功能，经基因工程改造后可向胞外大量分泌表达特定生物活性物质，被广泛应用于工业化大规模生产发酵。枯草芽孢杆菌还具有在营养缺乏或其他胁迫条件下形成抗逆性休眠体芽孢的特点，芽胞具有极佳的的抗逆性，不仅能耐受100°C的高温，还可耐受较低的酸性环境。因此，以枯草芽孢杆菌作为口服疫苗载体，以芽孢形式添加到饲料中，既可耐受饲料高温加工过程的破坏和鱼类胃液中的酸性环境，又可顺利穿过胃肠屏障，通过向胞外大量分泌表达外源抗原激发较强的免疫反应，达到较好的免疫效果。由于枯草芽孢杆菌这种显著的的胞外分泌功能和芽孢独特的抗逆性和免疫学特性以及生物安全性，使其成为极具商业开发价值的口服疫苗载体。枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术，通过芽孢表面展示蛋白与目标蛋白相融合，将目标蛋白展示在芽孢表面，可用于研制新型口服重组蛋白疫苗，近年来已成为国内外科学家关注的焦点。Medaglini D等利用衣孢蛋白作为芽孢表面展示外源抗原的融合载体蛋白， 成功地在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示了破伤风毒素(TTFC)C末端的459氨基酸片段。试验结果证明TTFC抗原展示于芽孢表面，每个芽孢表面约有I. 15X IO3个TTFC蛋白分子，可被特异性抗体识别，并且TTFC的出现并未影响芽孢孢衣的结构和功能(Medaglini D，2001，Vaccine, 19 :1931_9)。D. ning等将VP28展示在枯草芽孢杆菌表面，制备的对虾口服疫苗对对虫下白斑综合症病毒有一定的预防作用(D. ning et al. , 2011, J Appl Microbiol, 111
(6):1327-36),这些研究表明了枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术可有效用于口服疫苗的研究和开发。穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPP)是具有细胞膜穿透能力的一小段碱性氨基酸多肽，如HIV-I TAT、HSP-VP22和Antennapedia (ANTP)等，能有效运输各物质进入细胞及细胞核的系统，也称作蛋白质转导结构域(Lindgren M et al., 2000, TrendsPharmacol Sci, 21 (3):99_103)。通过穿膜肽携带的物质有蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸等。现在研究最多的、应用范围最广的穿膜肽来源于人免疫缺陷病毒I型的转录激活因子(trans-activating transcriptional activator, TAT) Tat 蛋白，此多妝蛋白中部序列具有富含阳离子区域，能够携带外源分子转导进入细胞，同时穿膜肽的转导不依赖于能量、胞吞作用、受体及离子通道等作用，可直接穿越脂质双分子层完成跨膜转运，并且能携带其它DNA、多肽及蛋白质等大分子物质进入细胞内。由于穿膜肽的这一特殊功能，被广泛应用于药物的研究(L. Crombez et al, 2009, Mol. Ther. ,17, pp. 95-103 ；S. C. Pero et al,2007, Br. J. Cancer, 96，pp. 1520-1525)和疫苗的开发(Zhang Y et al，2012，Journalof virological methods,181 (1):59_67)。以枯草芽孢杆菌作为口服疫苗载体，经基因工程改造后向胞外大量分泌表达穿膜肽和抗原蛋白融合形成的融合蛋白，利用穿膜肽具有将抗原蛋白跨膜携带进入细胞内的特点，使抗原蛋白直接进入动物体内激发免疫反应，达到体内注射相似的效果，同时利用芽孢表面展示技术在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示另一种病原菌抗原蛋白，达到交叉免疫保护的功效。该策略开发的口服疫苗巧妙的将枯草芽孢杆菌显著的胞外分泌特点、穿膜肽良好的穿膜特性、芽孢对高温和酸性条件下优异的耐受性以及芽孢表面展示技术作为疫苗开发的优越性高度集成在一起，开发出一种具有安全性好、保护效率高、同时对抗多种病原的多价高效口服疫苗。以此策略进行鱼类疫苗的研究及产品开发在国内外尚无报道，本发明为首次提出。本发明利用一种枯草芽孢杆菌重组菌株作为核心组成制备成一种新型的口服剂型多价载体疫苗，该枯草芽孢杆菌芽孢表面展示有以鱼类重要病原无乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为模板的广谱抗原蛋白，同时在其染色体上整合有穿膜肽与鳗弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)融合基因，使该菌株能持续向胞外分泌穿膜肽与鳗弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗原蛋白的融合蛋白。该多价载体疫苗可通过口服给药方式接种，能有效预防养殖鱼类链球菌病、弧菌病、爱德华氏菌病和嗜水气单胞菌病等重要细菌性病害。
发明内容
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本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种枯草芽孢杆菌多价载体疫苗及其应用，该疫苗是以枯草芽孢杆菌重组菌株作为核心制备而成的一种新型的口服剂型多价载体疫苗，通过诱导枯草芽孢杆菌重组菌株可产生表面展示无乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)蛋白的芽孢，当芽孢萌发形成营养细胞时可以分泌穿膜肽与鳗弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)形成的融合蛋白。按照本发明提供的技术方案一种新型枯草芽孢杆菌多价载体疫苗，其特征在于所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢杆菌重组菌株，该菌株的分类命名是枯草芽孢杆菌HT5302 (Bacillus subtilis HT5302)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCCNo M 2012380。作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株在形成芽孢后能够在芽孢表面展示无乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)蛋白。作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上重组整合有以枯草芽孢杆菌衣壳蛋白基因cotB为分子载体并与无乳链球菌基因相融合的融合基因片段(SEQ ID NO: I)，所述融合基因片段重组整合在枯草芽孢杆菌重组菌株染色体上的amyE基因位点，通过诱导该枯草芽孢杆菌重组菌株可产生表面展示无乳链球菌3_磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)蛋白的芽孢。作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株在形成营养细胞时能够分泌穿膜肽与鳗弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)形成的融合蛋白。作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上还重组整合有由枯草芽孢杆菌分泌信号肽基因、穿膜肽tat基因和鳗弧菌甘油醛脱氢酶#3/70 基因相融合所获得的sacB-tat~gapdh融合基因序列(SEQ ID NO: 2),该sacB-tat~gapdh融合基因序列克隆至枯草芽孢杆菌P43启动子下游并利用同源交换整合至枯草芽孢杆菌染色体的IacA基因位点，该枯草芽孢杆菌重组菌株在形成营养细胞时能够胞外分泌表达穿膜肽与鳗弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)融合蛋白。作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上还重组有抗生素壮观霉素筛选标记基因，所述壮观霉素抗性基因重组整合在枯草芽孢杆菌重组菌株染色体上的必基因位点。
作为本发明的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上还重组有抗生素红霉素筛选标记基因，所述红霉素筛选标记基因重组整合在枯草芽孢杆菌重组菌株染色体上的IacA基因位点。本发明的枯草芽孢杆菌重组菌株构建方法为
采用枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术，利用枯草芽孢杆菌孢衣蛋白基因mii 为分子载体，与无乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因济识過融合，利用同源交换原理整合至枯草芽孢杆菌染色体政基因位点；然后以该枯草芽孢杆菌为出发载体菌株，进一步从鳗弧菌中克隆基因并与枯草芽孢杆菌分泌信号肽基因和穿膜肽基因tat融合，获得sacB-tat-gapdh融合基因，将融合基因克隆至枯草芽孢杆菌p43启动子下游并利用同源交换整合至上述枯草芽孢杆菌染色体基因位点。通过上述方法获得的重组菌株即为枯草芽孢杆菌多价载体疫苗。本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌多价载体疫苗在鱼类养殖中防治因链球菌、弧·菌、爱德华氏菌和嗜水气单胞菌等引发的重要细菌性病害的应用。作为所述应用的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌多价载体疫苗是以枯草芽孢杆菌芽孢形式添加到鱼饲料及饲料添加剂中，以口服方式免疫。本发明与现有技术相比，优点在于本发明的枯草芽孢杆菌疫苗株，形成芽孢后能够在芽孢表面展示无乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH蛋白，在形成营养细胞时能够分泌穿膜肽与鳗弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶构成的融合蛋白。本发明利用芽孢所具有的独特抗逆性，将该枯草芽孢杆菌多价载体疫苗以芽孢形式添加到鱼饲料中口服免疫，芽孢能携带无乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH蛋白顺利通过鱼的消化道屏障，激发鱼的免疫反应，同时芽孢在鱼肠道定植萌发形成营养细胞，营养细胞能够大量分泌穿膜肽与鳗弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶构成的融合蛋白，穿膜肽携带GAPDH透过胃肠道细胞的磷脂双分子层进入细胞，激活鱼的免疫反应。本发明构建的枯草芽孢杆菌多价载体疫苗，相对于其它疫苗具有交叉保护、穿透鱼消化道屏障并能够及时将抗原传递到宿主细胞内部的效果，并且该疫苗能够添加到饲料中，耐受饲料的高温定型，具有广阔的商业开发景。生物材料保藏
一种新型枯草芽孢杆菌多价载体疫苗，该菌株的分类命名是枯草芽孢杆菌HT5302(Bacillus subtilis HT5302)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2012年9月25日，保藏号为CCTCCNo M 2012380。
图I是以大菱鲆为实验用鱼的各实验组的累计死亡率统计曲线图。图2是以罗非鱼为实验用鱼的各实验组的累计死亡率统计曲线图。图3是以石斑鱼为实验用鱼的各实验组的累计死亡率统计曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步描述。实施例I :枯草芽孢杆菌多价载体疫苗的制备
I、培养基配制(I)DSM 液体培养基细菌营养肉汤(Difco) 8g，10% (w/v) KCl 10ml, I. 2% (w/v)MgSO4 ·7Η20 10ml, IM NaOH I. 5ml，调 pH 至 7. 6，ddH20 定容至 1000ml。高压灭菌后，冷却至50°C，在使用前分别加入已灭菌的IM Ca (NO3)2、O. OIMMnCl2、ImMFeSO4各lml。(2) PBS 缓冲液=Na2HPO4 · 2H20 2. 74g/L，NaH2PO4 · H2O O. 63g/L，将所述成份溶解于IOOOml蒸馏水，于121°C灭菌20分钟。(3)LB 培养基胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化钠(NaCl) 10g/L，调 pH 至 7. O。2、平板培养基复苏取_80°C保存的保藏号为CCTCCNo M 2012380的枯草芽孢杆菌重组菌株种子划线接种于LB固体平板上，在37°C培养过夜，使枯草芽孢杆菌重组菌株复壮，形成单菌落。3、种子的制备挑取单菌落接种于100ml DSM液体培养基中，37°C培养18h，0D600 至2. O,作为种子液。4、发酵液的制备制备的种子液按照1%的接种量接种到5L生物反应器中，采用DSM液体培养基，培养温度37°C，通气量2L/分钟，pH7. 5，培养25_30h，至芽孢形成率90%以上，终止发酵，得发酵液。5、枯草芽孢杆菌芽孢菌粉的制备将上述发酵液于室温以5000g离心10分钟，收集菌泥，向菌泥中加入15%重量百分比的淀粉，喷雾干燥，得到水分重量百分含量〈5%的枯草芽孢杆菌芽孢菌粉，该枯草芽孢杆菌芽孢菌粉即为所述的枯草芽孢杆菌多价载体疫苗。6、疫苗饲料的制备将上述的枯草芽孢杆菌芽孢菌粉与鱼饲料原料混合制粒，包被大约I X IO10个芽孢/ g饲料，饲料经微粉碎后过40目筛，混合均匀后用小型颗粒饲料机加工成直径I. 5mm的颗粒饲料备用，饲料加工过程中温度65-70°C持续时间约lOmin。
实施例2 :以大菱鲆为实验用鱼的口服免疫效力评价试验。病原菌悬浮液的制备在TSB (2% NaCl)液体培养基中分别培养鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌至0D600为O. 6，在TSB液体培养基中培养嗜水气单胞菌至0D600为O. 6，然后于室温以5000rpm离心10分钟，收集沉淀菌体，用PBS缓冲液悬浮至终浓度为I X 107cfu/ml。实验用鱼的饲养从山东购置的试验用鱼(大菱鲆)暂养于200L水族箱，配以流动循环水处理和净化系统，养殖水温维持18±2°C，暂养I周后，剔除不健康个体。选择体长为12-15cm的健康大菱鲆随机分组至20L试验水族箱，每个水族箱30尾，实验水族箱每天换水两次，换水量为1/3，维持水温18±2°C，继续暂养2周。免疫效力评价上述已分组水族箱分别设置口服对照组A、免疫对照组A、免疫组A、口服对照组B、免疫对照组B、免疫组B、口服对照组C、免疫对照组C、免疫组C和空白对照组，口服对照组A、口服对照组B和口服对照组C饲喂基础饲料，免疫对照组A、免疫对照组B和免疫对照组C饲喂普通枯草芽孢杆菌混拌的基础饲料，免疫组A、免疫组B和免疫组C饲喂实施例I制备的疫苗饲料，空白对照组饲喂基础饲料，每组设置2个平行。将上述各组大菱鲆连续饲喂免疫3天，每条鱼每天免疫Ig饲料，免疫3天后各组停止免疫，均改喂普通基础饲料，停止免疫28天后，对除空白对照组外的各组大菱鲆分别攻毒，其中口服对照组A、免疫对照组A和免疫组A分别腹腔注射迟钝爱德华氏菌病原菌悬浮液，口服对照组B、免疫对照组B和免疫组B分别腹腔注射鳗弧菌病原菌悬浮液，口服对照组C、免疫对照组C和免疫组C分别腹腔注射嗜水气单胞菌病原菌悬浮液，每条鱼的注射剂量为100 μ I。在以后的14天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况，14天后，各组的累计死亡率稳定，统计各组鱼的累计死亡率，统计结果如图I所示。利用下列公式计算相对免疫保护率
相对免疫保护率(RPS)% =(稳定后的口服对照组的累计死亡率-稳定后的免疫组的累计死亡率)/稳定后的口服对照组的累计死亡率X 100%。经计算，实施例I制备的枯草芽孢杆菌多价载体疫苗对鳗弧菌的免疫保护率达到93. 4%，对迟钝爱德华式菌的免疫保护率达到79. 3%，对嗜水气单胞菌的免疫保护率达到70%，由此可见，该疫苗对鳗弧菌、迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌毒株感染都具有很好的防治效果，能有效地保护大菱鲆抵御鳗弧菌、迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的侵染，呈现出显著的交叉免疫力。实施例3 以罗非鱼为实验用鱼的口服免疫效力评价试验
病原菌悬浮液的制备在脑心浸出液肉汤(BHI)培养基(胰蛋白质胨10. Og/L，氯化钠5. Og/L，磷酸氢二钠2. 5g/L，葡萄糖2. Og/L，牛心浸出液500mL/L，pH7. 4)中分别培养无乳链球菌和海豚链球菌至0D600为O. 6，在TSB培养基中培养嗜水气单胞菌至0D600为O. 6，然后于室温以5000rpm离心10分钟，收集沉淀菌体，用PBS缓冲液悬浮至终浓度为I X IO7Cfu/ml ο实验用鱼的饲养从山东购置的试验用鱼(罗非鱼)暂养于200L水族箱，配以流动循环淡水处理和净化系统，养殖水温维持24±2°C，暂养I周后，剔除不健康个体。选择体长为12-15cm的健康罗非鱼随机分组至20L试验水族箱，每个水族箱30尾，实验水族箱每天换水两次，换水量为1/3，维持水温24±2°C，继续暂养2周。免疫效力评价上述已分组水族箱分别设置口服对照组A、免疫对照组A、免疫组A、口服对照组B、免疫对照组B、免疫组B、口服对照组C、免疫对照组C、免疫组C和空白对照组，口服对照组A、口服对照组B和口服对照组C饲喂基础饲料，免疫对照组A、免疫对照组B和免疫对照组C饲喂普通枯草芽孢杆菌混拌的基础饲料，免疫组A、免疫组B和免疫组C饲喂实施例I制备的疫苗饲料，空白对照组饲喂基础饲料，每组设置2个平行。将上述各组罗非鱼连续饲喂免疫3天，每条鱼每天免疫Ig饲料，免疫3天后各组停止免疫，均改喂普通基础饲料，停止免疫28天后，对除空白对照组外的各组罗非鱼分别攻毒，其中口服对照组A、免疫对照组A和免疫组A分别腹腔注射无乳链球菌病原菌悬浮液，口服对照组B、免疫对照组B和免疫组B分别腹腔注射海豚链球菌病原菌悬浮液，口服对照组C、免疫对照组C和免疫组C分别腹腔注射嗜水气单胞菌病原菌悬浮液，每条鱼的注射剂量为100 μ I。在以后的14天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况，14天后，各组的累计死亡率稳定，统计各组鱼的累计死亡率，统计结果如图2所示。利用下列公式计算相对免疫保护率
相对免疫保护率(RPS)% =(稳定后的口服对照组的累计死亡率-稳定后的免疫组的累计死亡率)/稳定后的口服对照组的累计死亡率X 100%。经计算，实施例I制备的枯草芽孢杆菌多价载体疫苗对无乳链球菌的免疫保护率达到93. 4%，对海豚链球菌的免疫保护率达到90%，对嗜水气单胞菌的免疫保护率达到76%，由此可见，该疫苗对无乳链球菌、海豚链球菌和嗜水气单胞菌毒株感染都具有很好的防治效果，能有效地保护罗非鱼抵御无乳链球菌、海豚链球菌和嗜水气单胞菌的侵染，呈现出显著的交叉免疫力。
实施例4 :以石斑鱼为实验用鱼的口服免疫效力评价试验
病原菌悬浮液的制备在脑心浸出液肉汤(BHI)培养基(胰蛋白质胨10. Og/L，氯化钠5. Og/L，磷酸氢二钠2. 5g/L，葡萄糖2. Og/L，牛心浸出液500mL/L，pH7. 4)中培养海豚链球菌至0D600为O. 6，在TSB (2%NaCl)液体培养基中培养溶藻弧菌至0D600为O. 6，在TSB液体培养基中培养嗜水气单胞菌至0D600为O. 6，然后于室温以5000rpm离心10分钟，收集沉淀菌体，用PBS缓冲液悬浮至终浓度为I X 107cfu/ml。实验用鱼的饲养从山东购置的试验用鱼(石斑鱼)暂养于200L水族箱，配以流动循环海水处理和净化系统，养殖水温维持23±2°C，暂养I周后，剔除不健康个体。选择体长为12-15cm的健康石斑鱼随机分组至20L试验水族箱，每个水族箱30尾，实验水族箱每天换水两次，换水量为1/3，维持水温23±2°C，继续暂养2周。免疫效力评价上述已分组水族箱分别设置口服对照组A、免疫对照组A、免疫组A、口服对照组B、免疫对照组B、免疫组B、口服对照组C、免疫对照组C、免疫组C和空白对照组，口服对照组A、口服对照组B和口服对照组C饲喂基础饲料，免疫对照组A、免疫对照组B和免疫对照组C饲喂普通枯草芽孢杆菌混拌的基础饲料，免疫组A、免疫组B和免疫组C饲喂实施例I制备的疫苗饲料，空白对照组饲喂基础饲料，每组设置2个平行。将上述各组石斑鱼连续饲喂免疫3天，每条鱼每天免疫Ig饲料，免疫3天后各组停止免疫，均改喂普通基础饲料，停止免疫28天后，对除空白对照组外的各组石斑鱼分别攻毒，其中口服对照组A、免疫对照组A和免疫组A分别腹腔注射海豚链球菌病原菌悬浮液，口服对照组B、免疫对照组B和免疫组B分别腹腔注射溶藻弧菌病原菌悬浮液，口服对照组C、免疫对照组C和免疫组C分别腹腔注射嗜水气单胞菌病原菌悬浮液，每条鱼的注射剂量为100μ I。在以后的14天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况，14天后，各组的累计死亡率稳定，统计各组鱼的累计死亡率，统计结果如图3所示。利用下列公式计算相对免疫保护率
相对免疫保护率(RPS)% =(稳定后的口服对照组的累计死亡率-稳定后的免疫组的累计死亡率)/稳定后的口服对照组的累计死亡率X 100%。经计算，实施例I制备的枯草芽孢杆菌多价载体疫苗对海豚链球菌的免疫保护率达到90%，对溶藻弧菌的免疫保护率达到86. 2%，对嗜水气单胞菌的免疫保护率达到73. 4%，由此可见，该疫苗对海豚链球菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌毒株感染都具有很好的防治效果，能有效地保护石斑鱼抵御海豚链球菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌的侵染，呈现出显著的交叉免疫力。需要指出的是，上述实施例仅仅作为本发明的说明，而不是限制。本发明所指的鱼类并不局限于上述实施例所描述的大菱鲆、罗非鱼和石斑鱼，对于经充分说明的本发明来说，根据本发明的所阐述的内容进行简单实验所作出的变换及改型的方案，仍然属于本发明的保护范围。总之，本发明的保护范围应包括那些对于本领域普通技术人员来说显而易见的变换或替代以及改型。
权利要求
1.一种新型枯草芽孢杆菌多价载体疫苗，其特征在于所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢杆菌重组菌株，该菌株的分类命名是枯草芽孢杆菌HT5302 (Bacillussubtilis HT5302)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo M 2012380。
2.如权利要求I所述的新型枯草芽孢杆菌多价载体疫苗，其特征在于所述枯草芽孢杆菌重组菌株在形成芽孢后能够在芽孢表面展示无乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)蛋白。
3.如权利要求2所述的新型枯草芽孢杆菌多价载体疫苗，其特征在于所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上重组整合有以枯草芽孢杆菌衣壳蛋白基因cotB为分子载体并与无乳链球菌识/7過基因相融合的融合基因片段(SEQ ID NO: 1)，所述融合基因片段重组整合在枯草芽孢杆菌重组菌株染色体上的_yE基因位点，通过诱导该枯草芽孢杆菌重组菌株可产生表面展示无乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)蛋白的芽孢。
4.如权利要求2所述的新型枯草芽孢杆菌多价载体疫苗，其特征在于所述枯草芽孢杆菌重组菌株在形成营养细胞时能够分泌穿膜肽与鳗弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)形成的融合蛋白。
5.如权利要求4所述的新型枯草芽孢杆菌多价载体疫苗，其特征在于所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上还重组整合有由枯草芽孢杆菌分泌信号肽基因、穿膜肽iai基因和鳗弧菌甘油醒脱氢酶基因相融合所获得的融合基因序列(SEQ ID NO: 2)，该识/7過融合基因序列克隆至枯草芽孢杆菌p43启动子下游并利用同源交换整合至枯草芽孢杆菌染色体的基因位点，该枯草芽孢杆菌重组菌株在形成营养细胞时能够胞外分泌表达穿膜肽与鳗弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)融合蛋白。
6.权利要求f5任一项所述的新型枯草芽孢杆菌多价载体疫苗在鱼类养殖中防治因链球菌、弧菌、爱德华氏菌和嗜水气单胞菌等引发的重要细菌性病害的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述枯草芽孢杆菌多价载体疫苗是以枯草芽孢杆菌芽孢形式添加到鱼饲料及饲料添加剂中，以口服方式免疫。
全文摘要
本发明涉及一种新型枯草芽孢杆菌多价载体疫苗及其应用。所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢杆菌重组菌株，该菌株分类命名是枯草芽孢杆菌HT5302，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNoM2012380。该枯草芽孢杆菌多价载体疫苗是以枯草芽孢杆菌重组菌株作为核心制备而成，通过诱导枯草芽孢杆菌重组菌株可产生表面展示无乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)蛋白的芽孢，芽孢萌发形成营养细胞时可以分泌穿膜肽与鳗弧菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)形成的融合蛋白。该疫苗具有对链球菌病、弧菌病、爱德华氏菌病和嗜水气单胞菌等细菌性病害的多效价防护作用。
文档编号A61K39/02GK102949713SQ20121037603
公开日2013年3月6日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者不公告发明人 申请人:无锡海健生物科技有限公司