一种C型EV71病毒的TaqMan荧光实时定量PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及一种C型EV71病毒的TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（EV71)是引起手足口病的主要病原体之一，已在世界范围内引 起多次暴发与流行，该病常见于学龄前儿童和婴幼儿，可引起发热和手足口腔等部位的皮 疹和溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿和无菌性脑膜炎等并发症甚至死亡。EV71是于 1969年首次从美国加利福尼亚州一名九个月大的脑炎患儿脑脊液中分离出来，在1972年 分出血清型并于1974年首次被报道。自报道以来，该病毒在世界范围内引起多次暴发与流 行，因而受到了人们的广泛关注。
[0003]EV71属于小RNA病毒科肠道病毒属的成员，含有7408个核苷酸，病毒颗粒为直径 27nm的二十四面体立体对称的球形结构。病毒由外层衣壳和RNA核心构成，病毒的衣壳含 有四个结构蛋白（VPI、VP2、VP3和VP4)，其中VP1是最主要的结构蛋白，决定着肠道病毒71 型的血清型和病毒中和作用。近年来，EV71的流行在亚太地区呈上升趋势。根据我国卫生 部的最近数据，2009至2011年全国（不含港、澳、台地区）共报道手足口病发病455万例， 死亡1767例，占丙类传染病的首位。然而手足口病的相关科研工作比较薄弱，至今在临床 上没有有效的疫苗和药物对EV71进行有效的预防和控制。因此建立一种快速有效的检测 EV71的方法对控制疾病的传播以及疫苗和药物的研制有着重大的作用。
[0004]肠道病毒71型的检测方法目前有病毒分离培养法、血清学方法以及免疫组化法， 这些方法操作比较繁琐，试验周期长，并且灵敏性低，特异性差；普通PCR检测技术虽然比 较快速便捷，但不能精确测定病毒核酸的量，而且容易污染造成假阳性。
[0005]近年来发展起来的实时荧光定量PCR检测技术与其他检测技术相比具有很强的 优势，它综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术以及数码显象技术，具有较高的灵敏性， 并且能够使用特异性探针对定量分子进行识别；具有很高的准确性，引物和探针双重控制 靶序列，特异性好、假阳性低；线性关系好、线性范围宽，通过荧光信号检测可以直接对产物 进行定量，定量范围可在lO^K^copies/ y L ;操作简单、安全、污染率低、自动化程度高。因 而实时荧光定量PCR技术得到了广泛的应用，已成为目前很多病毒核酸定量测定的主要方 法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种C型EV71病毒的TaqMan荧光实时定量PCR检测方 法，以EV71-2010FJLY008株型病毒VPl基因为靶点，构建重组质粒体外转录成RNA为标准 品的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法，具有稳定性强、特异性好、灵敏度高的特点。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是： (1)将EV71-2010FJLY008株型病毒的RNA逆转录为CDNA，以逆转录的CDNA为模板，采 用如下克隆引物扩增基因片段：上游引物：5 ' -CGCAAGCTTTCATCAAATGCTAGTGAYGAG-3 '，下 游引物：5' -CACGAATTCCCCGTAITCAAGYTCTTTCTC-3' ； (2) 将基因片段构建重组质粒并进行纯化，纯化后的克隆载体线性化后进行体外转录， 并对转录完成的RNA进行RNA纯化并测其OD值，并根据如下公式换算成RNA拷贝数：拷贝 数（copise/y1)=质粒浓度（g/yI)X阿式常数/RNA分子量；阿式常数=6. 02X1023，RNA 分子量=一个碱基的分子量（340)X重组RNA总长度（bp); (3) 将已知拷贝数的RNA做10倍梯度稀释，配制拷贝数为IO3~IO9Copies /iU的 溶液，在荧光定量PCR反应仪中进行实时PCR反应，建立了Ct/LogCopynumber工作曲线； (4) 收集培养的EV71病毒上清样本，并提取样本的RNA; (5) 按照常规荧光定量PCR检测方法检测样品中EV71病毒的含量，其中定量检测的引 物和探针为： 上游引物：5' -TGGAGCCCCTAAGCCAGAIT-3'， 下游引物：5 ' -CTCGCAGGTGACATGAATGG-3 '， 探针probe: 5 '（FAM) -CCTTGCATGGCAAACCGCCACTAAC- (TAMRA) 3 '。
[0008] 所述构建重组载体所使用的质粒是P⑶NA3. 1+。
[0009]荧光定量PCR检测采用试剂盒为OneSt印PrimeScriptRTPCRKit(TaKaRa， RR064A)，反应体系为： 2XonestepRT-PCRBufferIII 10yL TakaraExTaqHS 0. 4yL PrimeScriptRTenzymeMixII 0. 4yL RoxReferenceDyeII 0. 5yL 上游引物（IOyM) 0. 6yL (300nM) 下游引物（IOyM) 0. 6yL (300nM) Probe(5yM) 0.8yL(200nM) RNaseFreedH20 I. 7yL 模板 5yL 总体积 20yI 荧光定量PCR扩增条件为： 42°C5min，95°C10s;95°C5s，56°C45s，45 个循环扩增。
[0010] 本发明的优点和技术效果如下： 荧光定量PCR技术作为一种新兴的分子检测技术，不仅操作便捷，而且还具有较高 的稳定性、灵敏性和特异性。荧光定量中运用的体外转录RNA标准品，能够很好地对待测样 品进行处理并对反转录过程进行有效的控制，此外，标准品RNA不易对实验仪器和环境造 成交叉污染而导致假阳性结果。因此，荧光定量PCR检测技术适用于EV71样品的大批量检 测，为EV71的诊断、检疫、食品安全检验和病原生物学、分子流行病学研究提供了一种新的 方法。
【附图说明】
[0011] 图1为EV71-2010FJLY008株型保守区段VPl基因克隆引物扩增片段电泳检测结 果； 图2为不同退火温度条件下特异性引物扩增片段电泳检测结果； 图3为不同引物浓度下特异性引物扩增片段电泳检测结果； 图4为不同探针浓度扩增曲线； 图5为以IO3~10 9拷贝数为模板建立Ct/LogCopynumber工作曲线； 图6为组间重复性检测扩增曲线； 图7为以EV71-2010FJLY008株型、柯萨奇A16、柯萨奇B1、轮状病毒、疱疹病毒为模板 建立的TaqManPCR检测方法特异性分析曲线； 图8为TaqManPCR检测方法灵敏性分析曲线； 图9为不同时间所收获的EV71病毒样品TaqManPCR扩增曲线。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的仪器试剂均为常规市售产品。
[0013] 实施例I:PCR引物的设计及PCR扩增 EV71-2010FJLY008株型病毒(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心）属于C基因型 病毒，PCR克隆引物是根据NCBI中下载的二十余条C基因型EV71病毒株，通过MEGA5软件 对其进行了同源性比对后找到了特异保守序列，通过Primerpremier5. 0设计引物，引物 由大连宝生物有限公司合成，引物扩增片段长度为507bp具体过程如下： 1、 设计的RT-PCR扩增引物 上游引物：5' -CGCAAGCTTTCATCAAATGCTAGTGAYGAG-3'（163bp-183bp) 下游引物：5 ' -CACGAATTCCCCGTAITCAAGYTCTTTCTC-3 '（ 669bp-649bp) 2、EV71-2010FJLY008株型病毒RNA的提取 EV71-2010FJLY008株型病毒RNA的提取采用病毒RNA提取试剂盒(天根)，具体操作过 程如下： (1) 用移液器将500yLCarrierRNA工作液加入一个干净的I. 5mL离心管中； (2) 向离心管中加入100yL的病毒上清液，涡旋振荡15秒混匀； (3) 室温（15-25) °C孵育10分钟； (4) 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体； (5) 加入500yL的无水乙醇，盖上管并涡旋振荡15秒； (6) 简短离心以收集附着再管壁及管盖上的液体； (7) 仔细将离心管中的630yL液体转移至RNase-Free吸附柱CR2 (吸附柱放在收集 管中)，盖上管盖，8000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中； (8) 重复步骤7 ; (9) 小心打开吸附柱盖子，加入500yL溶液⑶，盖上管盖，8000rpm离心1分钟，弃废 液，将吸附柱放回收集管中； (10) 小心打开吸附柱盖子，加入500yL溶液RW，盖上管盖，8000rpm离心1分钟，弃废 液，将吸附柱放回收集管中； (11) 将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3分钟； (12) 将吸附柱放回2mL收集管中，打开吸附柱盖子，室温放置3分钟，使吸附膜完全变 干，弃废液； (13) 将吸附柱放入一个RNase-Free离心管（I. 5mL)中，小心打开吸附柱的盖子，向膜 中央加入45yLRNase-FreeddH20,室温放置5分钟，8000rpm离心1分钟。
[0014] 3、PCR扩增 以提取的EV71-2010FJLY008株型病毒RNA为模板，用普通PCR仪（ABI-2720)逆转录成cDNA，过程如下：逆转