039]
[0043] (2)GSPEGFR基因检测探针制备：使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明 书要求的操作方法对不同BAC克隆分别进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm 处的吸光度对质粒DNA定量;采用高压灭菌的超纯水稀释为200ng/ul，采用1.5ml的离心管 分装，最后将分别得到的3种或4种质粒DNA混合，-20°C密封保存。
[0044] (3)通过切口平移方法对质粒DNA混合物进行荧光标记，每种探针标记的荧光素为 Spectrum-Orange。采用abbott的Nick Translation Kit，按如下方案，严格避光条件下在 冰上配制PCR反应体系。
[0045]
[0046] 配完后震荡混匀，在16°C标记12小时，再80°C孵育10分钟灭活酶。取5ul使用2%琼 脂糖凝胶做电泳，要求在50bp~500bp之间存在弥散的带。
[0047]对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠 和无水乙醇，避光、冰上配制：
[0048] 标记产物 45ul
[0049] 醋酸钠(3mol/L) 5ul
[0050] 无水乙醇 125ul
[0051 ] 混匀后置于_70°C冰箱中至少2小时，4°C13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿搅 动沉淀，加入lml的70%乙醇，4°C13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光 干燥。使用1 u 1纯化水溶解沉淀，获得GSP EGFR基因探针，避光、-20°C储存。
[0052] (4)GSP EGFR基因探针验证:分别使用两组探针，使用人类正常分裂中期淋巴细胞 滴片进行待测样本进行两组探针验证（检测方法参考实施例3)。包含中期或间期染色体 DNA，荧光原位杂交时，染色体DNA表现为形态上可识别的染色体或是细胞核。两组探针的结 果相同，如图2所示：中期染色体的FISH杂交结果图。图中可以看见染色体7pll位置显示红 色荧光信号，内控探针CSP7(7号染色体鉴别探针，可以标记出7号染色体，购自KREATECH-KBI20007)显示绿色荧光。
[0053]实施例2 :EGFR基因检测试剂盒制备方法
[0054] EGFR基因检测试剂盒包括有EGFR杂交液和DAPI复染剂两个组分，其中EGFR杂交液 包含实施例1所述的GSP EGFR基因探针(分别为两组检测探针，对应两种试剂盒）、CSP7探针 (7号染色体鉴定探针）、用于杂交环境（促进杂交）的缓冲液组分、封闭重复序列的COT Human DNA等。DAPI复染剂主要用于杂交后的细胞复染，其中的DAPI会与DNA结合，使得细胞 核显示出蓝色荧光，含有对苯二胺的复染剂可以保持荧光的稳定。
[0055] 具体配方如下：
[0056] (1)杂交液配制
[0057]
[0058] (2)DAPI复染剂配制
[0059] 10mg的对苯二胺溶于lml的PBS中，调节pH为9.0，加入9ml甘油，反复震荡混匀，-20 °C储存。取2.5μ1的DAPI溶液(0. lmg/ml)溶于lml抗褪色液中，避光条件下反复震荡混匀，-20°C避光密闭保存。
[0060] (3)成品组装
[0061]
[0062]实施例3 :EGFR基因检测试剂盒的检测方法 [0063] 1、玻片预处理
[0064] 1.1玻片放入65±5°C恒温箱中烤片过夜；
[0065] 1.2取出玻片，将其放入二甲苯中室温脱蜡15分钟；
[0066] 1.3取出玻片，再将其放入另一缸二甲苯中室温继续脱蜡15分钟；
[0067] 1.4取出玻片，再将其放入无水乙醇中室温10分钟，去除残留二甲苯；
[0068] 1.5取出玻片，再将其放入100%、90%、70%梯度乙醇室温复水各3分钟；
[0069] 1.6取出玻片，再将其放入纯化水中室温洗涤3分钟，用无绒纸巾吸取多余水分；
[0070] 1.7取出玻片，再将其放入纯化水中100±5°C煮片25分钟（切片水平放置于容器 中，样本面朝上）；
[0071] 1.8取出玻片，室温晾干；
[0072] 1.9将玻片正面朝上放在架子上，在样本区域滴加适量的胃蛋白酶反应液，消化5 ~15分钟；
[0073] 1.10将多余液体甩去，将其放入室温2 X SSC中5分钟；
[0074] 1.11取出玻片，再将其放入另一缸室温2 X SSC中5分钟；
[0075] 1.12取出玻片，再将其依次放入室温70%，90%，100%梯度乙醇脱水各3分钟；
[0076] 1.13取出玻片，室温晾干。
[0077]胃蛋白酶的反应时间需要通过预试验进行确定。可以使用同批制备的样本片按所 述方法进行预试验，通常以5分钟为间隔时间。例如，分别测试消化时间为5分钟、10分钟和 15分钟，完成"玻片预处理"后，可以在明场下，使用10X或20X物镜观察组织消化状态;或 者直接进行DAP I复染，进行消化状态判断。
[0078] 2、样品和探针同时变性(避光操作）
[0079] 2.12.1从_20±5°C冰箱中取出实施例2所述检测试剂盒中的杂交液，震荡混匀，瞬 时离心；
[0080] 2.22.2加 ?ομL的杂交液到杂交区域，迅速盖上18 X 18mm盖玻片，轻压使杂交液均 勾分布，避免产生气泡；
[0081 ] 2.32.3用橡皮胶沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片和载玻片接触的部位；
[0082] 2.42.4将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上 盖，设置"Denat&Hyb"程序，变性85°C5分钟，杂交37°C 10~18小时。（若无杂交仪，可使用替 代仪器，如恒温热台进行变性，电热烘箱/或水浴锅进行杂交，需注意温度准确及保持杂交 湿度）。
[0083] 3、杂交后洗涤及复染(避光操作）
[0084] 3.1洗涤前30分钟，将配制好的洗液I，洗液II，放入37± 1°C的水浴中，测量以确保 温度合适；
[0085] 3.2关闭杂交仪电源，将玻片取出，轻轻撕去橡皮胶，移去盖玻片(若盖玻片难以去 除，可以将其放入洗液I中微微摇晃，以利于其脱落；
[0086] 3 · 3玻片放入37 ± 1°C洗液I (2 X SSC)中10分钟；
[0087] 3 · 4取出玻片，再将其放入37 ± 1°C洗液II (0 · 1 % NP-40/2 X SSC)中5分钟；
[0088] 3.5取出玻片，室温70%乙醇中3分钟；
[0089] 3.6取出玻片，暗处自然干燥玻片；
[0090] 3.7室温，滴加 ?ομL DAPI复染剂到22 X 22mm的盖玻片，载玻片目标区域朝下，轻放 于盖玻片上，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。
[0091] 上述所列举试剂均在圆形染色缸中配制(每种试剂体积均为40ml)，每个染色缸最 多可放入5片切片。非室温溶液，在操作开始前需提前预热反应试剂至指定温度。在洗涤过 程中，可间隔2~3分钟轻轻晃动染色缸，提高洗涤效果。
[0092] 4、结果分析
[0093] 相关荧光和DAPI需用合适的滤块观察。其中，CSP7探针显示绿色信号;GSPEGFR探 针为红色信号。
[0094] 4.1使用合适的滤镜，在40 X物镜下寻找，在100 X物镜下计数；
[0095] 4.2调整合适的焦距，对信号和背景有明确的概念;信号点因位于细胞内；当细胞 外存在荧光信号点时，要注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；
[0096] 4.3扫视几个肿瘤细胞区域，选择至少4个有很好核分界的区域，要求细胞核边界 完整，DAPI染色均匀、核无重叠，CSP7探针(绿色信号点)信号清晰；
[0097] 4.4从选择区域的左上角开始分析，从左到右扫视，观察多个视野；
[0098] 4.5组织计数的要求：
[009