9] a.只计数肿瘤组织(在FISH检测前，使用HE染色片进行对照观察）
[0100] b.避免在坏死区域及核边界不清的区域计数
[0101] C.需要主观辨别的核不计数
[0102] d.跳过信号弱及没有特定信号或高背景的核计数
[0103] 4.6转至100X物镜，调整焦距，在核的不同层次找到所有信号点；
[0104] 4.7在每个核内计数信号点；调焦找到每个核内的所有信号点，计数一个区域内的 两种信号，只计数每种颜色有1个或更多FISH信号的，没有信号或只有一种颜色信号的核不 计数;记录观察到的细胞总数(信号正常及异常）；
[0105] 4.8计数方法
[0106] 在5个清晰的肿瘤区域，共计数50个肿瘤细胞核内GSPEGFR(红色）和CSP 7 (绿色） 信号，分别计数单个细胞核内GSPEGFR和CSP 7的信号数。计数时，要特别注意信号断裂、成 对或是成簇情况。当两个或三个信号由线状相连或是相邻(间距小于信号点直径)时作为一 个信号。记录最大信号数目为15,当>15时，记录为15。
[0107] 5、试验结果的判定
[0108] 统计GSPEGFR信号2 4个的细胞占统计总细胞的百分比，再计算所有细胞GSP EGFR 信号总数与CSP 7信号数的比率。
[0109] 当如下情况时：
[0110] a. 2 40%的细胞出现2 4个EGFR信号；
[0111] b.GSPEGFR/CSP7(红色/绿色）2 2，同时，用于计数的核中CSP7信号2 2;
[0112] c. 2 10%的细胞出现2 4个EGFR信号簇；
[0113] d. . 2 10%的细胞出现>15个EGFR信号；
[0114] 若满足情况a、或b、或c、或d时判定为FISH阳性(EGFR基因扩增）；
[0115] 不满足上述情况判定为FISH阴性(EGFR基因无扩增）。
[0116] 研究表明，在非小细胞肺癌样本中EGFR基因扩增表现形式多样，基于FISH检测，常 表现为6种信号形式：在约60 %的核中EGFR信号表现为相对松散、超过20个拷贝的信号类 型，扩增子表现为均染区（图3a);在10%~15%核中EGFR信号表现为4-10拷贝的基因信号 (图3b);在15 % -20 %核中扩增子包含CSP7序列，表现为共扩增基因簇(图3c);约5 %核中出 现非典型的相对内对照细胞内信号大且明亮的基因信号簇（图3d);约1%核内出现双微体 (图3e); 5 %核内出现染色体非整倍情况，表现为2 10 %核内出现2 15EGFR信号（图3f)。
[0117] 实施例4:EGFR基因检测试剂盒临床使用评价
[0118] 使用实施例1所述两组检测探针，实施例2所述检测试剂盒对20份临床样本(其经 过病理检测确诊，具体见下表），进行检测。根据实施例3的检测方法重复检测3次，结果相 符，检测结果的重复性好;两种探针组合的检测一致性佳。与市售商品化试剂比较，检测结 果完全一致，试剂的特异性和灵敏度高。图3和图4为探针组1的检测结果图。探针组2的结果 与探针组1的结果相同，图省略。图4为标本4检测结果，信号类型为2R2G，EGFR基因未发生扩 增；图5为标本7检测结果，信号类型为6-12R2G，EGFR基因扩增。
[0119]
[0120]
[0121]从检测结果知，在对这些样本进行分子标志物检测后，可以据检测结果对样本进 行分子分型，依据检测指标的意义，用于临床治疗方案制定、用药选择和疗效判断。
[0122] 本发明中，分别各使用EGFR基因中的一种探针也能实现相应的检测，具体结果省 略，但相对探针组合使用而言，组合探针的使用，检测信号会更好。理论上探针长度越长，实 际检测时获得的荧光信号亮度越明亮，但因为可能涉及到更多基因序列，所得到的信号复 杂性可能性增多，对检测实现的难度也增强。本发明所述针对EGFR基因的组1和组2的检测 探针的BAC克隆总长度分别为:568Kb和380Kb，均为包含EGFR基因及其两端序列的核酸混合 物。
[0123] 发明人在对本发明所述探针验证中发现，较长的检测探针确实获得更强的荧光信 号，并且在对临床样本的检测验证中也获得了相同的结果。因此，在荧光探针的设计中，可 以通过适当延长荧光探针长度增加信号亮度，但具体如何组合使用，存在的一定的技术困 难，要实现很好的检测结果，除了设计中的经验之外，还需通过临床样本验证评估信号类型 差异，需要发明人付出大量艰辛的工作，寻求合适的探针组合。
[0124] 所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例 中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛 盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0125] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种EGFR基因检测探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 选取8六(：克隆为1^11-74806、1^11-16467、1^11-781022、1^11-17115中至少一种，或 选取 BAC 克隆为 〇1)-2086?7、1^11-38165、〇1)-2343815中的至少一种； (2) 对BAC克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量； (3) 用荧光素标记质粒DNA，不同来源的质粒DNA所标记的荧光素相同，即得。2. 根据权利要求1所述EGFR基因检测探针的制备方法，其特征在于，所 述 BAC 克隆为 1^11-74806、1^11-16467、1^11-781022和1^11-17115;或所述从(：克隆为 CTD-2086F7、RP11-381G5和CTD-2343B15。3. 根据权利要求1所述EGFR基因检测探针的制备方法，其特征在于，所述荧光素为 Alexa,Fl.U.〇r?488、FITC、AlexaFlllO：r?555、Rhodamine、Texas Red、pacific blue?、DEAC。4. 根据权利要求1-3任一项所述EGFR基因检测探针的制备方法，其特征在于，步骤（3) 采用随机引物法或切口平移法对质粒DNA进行荧光素标记。5. 根据权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的EGFR基因检测探针。6. -种EGFR基因检测试剂盒，其特征在于，包括有权利要求5所述的EGFR基因检测探 针。7. 根据权利要求6所述EGFR基因检测试剂盒，其特征在于，还包括有用于内控的7号染 色体鉴别探针，该鉴别探针与EGFR基因检测探针标记的荧光素的颜色不相同。8. 根据权利要求6或7所述EGFR基因检测试剂盒，其特征在于，还包括有用于封闭重复 序列的COT Human DNA，和DAPI复染剂。
【专利摘要】本发明涉及EGFR基因检测探针及其制备方法，该方法包括以下步骤：选取BAC克隆为RP11-748O6、RP11-164G7、RP11-781C22、RP11-17J15中至少一种；或选取BAC克隆为CTD-2086F7、RP11-381G5、CTD-2343B15中的至少一种，对克隆分别提取质粒提取，得到质粒DNA，定量；用荧光素标记。本发明还公开了包含有EGFR基因检测探针的试剂盒。本发明通过筛选到最优的EGFR检测探针，信号计数行准确、快速，且结果的重复性好；补充了临床中EGFR突变检测的不足，有利于筛选更多受益于靶向药物的患者，提高肺癌患者生存率和总生存期。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12N15/10
【公开号】CN105483257
【申请号】CN201511033448
【发明人】陈绍宇, 何瑰, 欧焕金
【申请人】广州安必平医药科技股份有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月30日