一种真菌种属pcr鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物物种鉴定，具体涉及真菌种属。
【背景技术】
[0002] 真菌的分类鉴定过去一般采用的是形态学方法，主要按照真菌的形态特征、生长 特征、生理生化特点、抗原构造等特征加以区分，尤其是以有性态的形态特征为主要依据。 目前世界上使用最广泛的真菌分类系统是Ainsworth分类系统，它按真菌孢子的类型和有 性态的有无，把真菌分为鞭毛菌、接合菌、子囊菌、担子菌和半知菌5个亚门。但真菌的种类 多，形态和解剖结构复杂多变，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，且 要获得其有性或无性器官需很长时间(某些真菌如半知菌亚门甚至不能形成有性态），常会 得出假阳性或假阴性结果，因此鉴定结果不是很准确。近年来，随着分子生物学的发展，其 在真菌分类学中发挥了越来越大的作用，其中rDNA(核糖体DNA)序列分析被广泛使用。
[0003] 真核生物的核糖体是80S型，包含大亚基60S与小亚基40S。大亚基60S是由25-28S rRNA、5.8S rRNA和5S rRNA及核糖体蛋白构成;小亚基40S则由18S rRNA与相关核糖蛋白构 成。真核生物细胞中的25-28S rRNA、5.8S rRNA和18S rRNA基因串联构成一个转录本，初 始转录的产物为35S-45S rRNA前体，35S-45S rDNA与5S rDNA串联形成一个重复单位， 150-200个重复单位构成了 rDNA簇。5.8S、25S和18S之间的内转录基因间隔序列为基因内 部转录间隔序列（ITS)。
[0004] rDNA用以进行物种分类鉴定原理，主要是基于其独特的保守性和适当的进化速 率，使得不同物种间产生相应的碱基差异，这些碱基差异可以通过相应的技术方法来分析， 从而进行菌株的分类鉴定。序列分析、限制性片段长度多态性RFLP、单链构象多态性SSCP和 末端限制性片段长度多态性T-RFLP等
[0005] 为主要的技术方法，并且有日益完善的Internet数据库和序列分析软件作为支 持。
[0006] 研究表明26S rRNA可应用于系统发育分析和菌种鉴定。在大亚基的多态性研究 中，其序列可为12个区域，其中D1和D2两个区域主要用于系统发育研究和菌种鉴定。26S rDNA的D1/D2区域位于大亚基的5'端，序列长度在600bp左右。种内序列变异< 1%，而种间 序列差异 >1%。扩增常用通用引物为NL1: 5 ' -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ' 和NL4: 5 ' -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3 '，扩增出的序列结合序列分析、限制性片段多态性RFLP或单链构 象多态性分析，对待测菌株进行分析。
[0007] 内转录间隔区ITS与5.8S rDNA(internal transcribed spacer, ITS)是rDNA上的 一个非编码区域，由位于18SrDNA和5.8S rDNA之间的ITS1区及5.8S rDNA和28S rDNA之间 的ITS2区构成，长度约为500bp。该区域受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有 进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现 出极大的序列多态性，可以为真菌学的研究提供丰富的遗传信息。研究时，通常采用ITS序 列的通用引物ITS1 (5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '）和ITS4(5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'），扩增出包括ITS1、5.8S和ITS2的全长ITS区域序列，长度400~870bp，然后结合DNA序列 测定分析和RFLP分析，对物种进行分类鉴定。由于ITS区不加入成熟核糖体，所以受到的选 择压力较小，进化快，在绝大多数的真核生物中表现出很高的序列多态性，Renske等认为， 真菌通过ITS区域比对，序列相似性大于99%，鉴别为同种。ITS序列间的趋异已经用于真菌 中很多属的系统发育研究，已证明该序列在研究属内和关系较近的属间关系时是十分有价 值的，尤其在近似种的区别中。
[0008] 虽然种内26S D1/D2区碱基差异小于1%的标准已被普遍接受，然而此数值仍是一 个试验的经验值。但真菌的种类非常复杂，不同种真菌的基因组的进化速率各不相同，跨物 种的基因交流(重组、染色体重排、水平转移、基因渗透)可能会造成核糖体基因簇的某一区 段适用于大多数的物种鉴定，却不能将亲缘关系较近的物种加以区分的现象，或者依赖于 单一标记的分类结果可能无法正确反映该菌株的真实分类地位。有时具有相同D1/D2区序 列的菌株，杂交遗传学和标准特征却表明它们不属于同一个种。
[0009] 同时由于不同真菌的内转录间隔区ITS与5.8S rDNA序列存在差异，使用ITS序列 的通用引物ITS1和ITS4有时无法扩增到ITS1、5.8S和ITS2的全长ITS区域序列，无法用于菌 种鉴定。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于，提供一种真菌种属PCR鉴定方法，解决以上技术问题。
[0011] 本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：
[0012] -种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0013] 步骤一，菌株的培养与收集；
[0014] 步骤二，DNA提取；
[0015] 步骤三，DNA样品的检测；
[0016] 步骤四，PCR扩增；
[0017] 步骤五，测序；
[0018] 步骤六，序列分析。
[0019] 本发明通过步骤一~步骤六实现了对真菌种属的鉴定。
[0020] 所述步骤一中，作为一种方案，所述菌株在一土豆培养基中进行培养，培养环境在 25°C~30°C，光照12h，黑暗12h，培养2~5天后，所述菌株的菌丝长满所述土豆培养基的表 面，直接从所述土豆培养基表面刮取所述菌丝作为样品；
[0021] 所述土豆培养基是一固体培养基。
[0022] 本发明通过在固体培养基上培养菌种能够便于观察菌落和便于分离菌丝。
[0023]所述步骤一中，作为一种方案，所述菌株在一土豆培养基中进行培养，培养环境在 25°C~30°C，光照12h，黑暗12h，培养2~5天后，所述菌株的菌丝长满所述土豆培养基的表 面；
[0024]将菌丝置于一液体土豆培养基中，保持所述液体土豆培养基内的环境在25°C~30 °C，将所述液体土豆培养基以180r/min的速度进行高速离心5~10天，再收集菌丝作为样 品。
[0025]本发明通过液体培养基高速离心能够使菌丝内的活性增强，扩大培养，增加溶解 氧含量。
[0026] 步骤2-1，将所述样品溶解在锥形瓶中形成菌液，抽取lml~2ml菌液于一第一离心 管中，将所述第一离心管以12000r/min离心3min~5min。
[0027] 步骤2-2，在所述第一离心管中加入500yL十六烷基三甲基溴化铵，将所述第一离 心管放入液氮中迅速制冷30s~40s，在将所述第一离心管迅速放入60°C~70°C温水中30s ~40s，重复步骤2-2三~五次。
[0028] 本发明通过十六烷基三甲基溴化铵能够对第一离心管内的核酸进行沉淀，便于收 集 DNA。
[0029] 步骤2-3,在所述第一离心管中再加入所述第一离心管体积1/3的玻璃珠，将所述 第一离心管放置在一漩涡振荡器进行高速震荡3min~8min。
[0030] 本发明通过玻璃珠能够更好的将细胞压碎，便于收集DNA。
[0031]步骤2-4在所述第一离心管中再加入蛋白酶K，将所述第一离心管在60°C~65°C的 水中保温30min并且每隔lOmin摇匀1次。
[0032]本发明通过蛋白酶K能对第一离心管内的蛋白质进行降解。
[0033] 步骤2-5在所述第一离心管中加入体积比在20~30: 20~25 :0.5~1之间的酚、氯 仿和异戊醇。
[0034]本发明通过酚、氯仿和异戊醇能够抽取DNA，苯酚的作用是使蛋白质变性，氯仿的 作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层.最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量 酚.（酚易溶于氯仿中）。本发明通过这三者的结合能够使提取DNA的方法变得简单方便。 [0035]作为一种优选方案，步骤2-5在所述第一离心管中加入体积比25:24:1的酚、氯仿 和异戊醇。
[0036]步骤2-6将所述第一离心管中的上清液移入到第二离心管中，在所述第二离心管 中加入体积比24:1的